侯亞瓊，王輝，郭彥魁，宋獻美

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州451191

糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一組以慢性高血糖為共同特征的代謝異常綜合征。隨著糖尿病在疾病譜中的比重不斷上升從而逐漸成為威脅人類健康的巨大殺手，傳統(tǒng)中醫(yī)藥對糖尿病良好的療效引發(fā)了更多的關(guān)注。糖尿病中90%以上患者是2 型糖尿?。═2DM）[1]，而根據(jù)《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》，除了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療方式以外，中醫(yī)治療中將T2DM 分三型辨證：陰虛熱盛、氣陰兩虛和陰陽兩虛[2]?！吨嗅t(yī)內(nèi)科學(xué)》教材中也明確提出消渴病本質(zhì)以“陰虛為本，燥熱為標(biāo)”[3]。根據(jù)消渴證病機特點，初期為陰虛熱盛階段，由于消渴本質(zhì)是虛證，熱盛階段不能持久，傷陰耗氣會后很快進入氣陰兩虛階段。而至陰陽兩虛階段，概因疾病遷延，氣陰損耗日久至陰損及陽，元陽虧損以至于陰陽兩虛。故氣陰兩虛證型在糖尿病中持續(xù)時間最久，且貫穿于糖尿病整個病程的中后期。在知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫中試檢索后，氣陰兩虛的研究文獻顯著多于其他兩種類型。因此研究T2DM 氣陰兩虛證型的中醫(yī)藥療法具有較大意義。

1 氣陰兩虛型T2DM 數(shù)據(jù)挖掘

以中國知網(wǎng)和萬方平臺為依托使用專業(yè)檢索，檢索現(xiàn)存截至2022 年1 月以來，有完整內(nèi)服方藥組成的中醫(yī)藥臨床辨證治療T2DM 且療效確切的相應(yīng)證型的文獻?？梢园魉幝?lián)合中藥方劑的治法和名中醫(yī)驗方或?qū)＜医?jīng)驗，排除非本證型以外的其他證型和動物實驗類文獻。知網(wǎng)平臺檢索式為SU=（“糖尿病”+“消渴”+“T2DM”+“TⅡDM”+“DMⅡ”）ד氣陰兩虛”，萬方平臺檢索式為（“糖尿病”or“消渴”or“T2DM”or“TⅡDM”or“DMⅡ”）and“氣陰兩虛”）。氣陰兩虛型共計采集收錄符合標(biāo)準(zhǔn)的方劑395首，累計中藥217 種。使用中醫(yī)傳承平臺計算平臺（TCMSP）v3.0 對結(jié)果進行分析。統(tǒng)計結(jié)果包含藥物頻次、關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類分析。

1.1 藥物頻數(shù)統(tǒng)計通過TCMSP 分析，氣陰兩虛證型中，用藥頻次在2%以上的藥物，如表1，占方比指在本證型中，含有某一味中藥的方劑數(shù)量與收錄方劑總數(shù)量的比值。

表1 氣陰兩虛型常用藥物（單味藥物頻率≥2%）

1.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則將氣陰兩虛組數(shù)據(jù)的置信度設(shè)≥80%，支持度設(shè)為30%（支持個數(shù)為118 個）可得到8 個藥物組合，黃芪-地黃頻次為180 次居于首位，其藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則置信度為0.84。

1.3 聚類分析應(yīng)用TCMSP 平臺“方劑分析”中的“聚類分析”（采用k-means 算法+回歸模擬），將聚類個數(shù)設(shè)置為3時，可以得到3 個核心藥物聚類。聚類頻率首位59.75%的藥物組合為：黃芪、地黃、山藥、葛根、麥冬。且3 個核心藥物組成中有2 個都含有黃芪-地黃。聚類分析圖的離散和聚集程度如圖1。

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析黃芪-地黃藥對治療T2DM 作用機制

由數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果析可知，在氣陰兩虛證型中，使用頻率最高的藥物為黃芪，使用率為8.12%，使用頻次為311，占方比為78.73%；一半以上的方劑使用了黃芪、地黃（占方比＞50%）。在關(guān)聯(lián)規(guī)則中，設(shè)置置信度條件下，黃芪、地黃藥對頻詞居于首位，且置信度較高為0.84；核心方劑三聚類時，2 個核心方劑中均出現(xiàn)黃芪、地黃藥對組合。說明黃芪-地黃藥對組合在糖尿病氣陰兩虛證型中居于極其重要的地位和治療作用，研究黃芪、地黃藥對組合的多種成分和糖尿病之間的相互關(guān)系，有較大的意義。

2.1 黃芪-地黃有效成分篩選通過TCMSP 平臺搜尋黃芪成分，設(shè)置OB≥30%，類藥性DL≥0.18，得到有效成分后通過其MOL.ID 號搜尋單味藥成分作用靶點。通過文獻收集地黃有效成分，并運用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得地黃成分SMILES。導(dǎo)入到結(jié)構(gòu)相似度預(yù)測靶點數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction 預(yù)測靶點。然后通過herb 平臺補充地黃有效靶點，最后利用uniprot數(shù)據(jù)庫下載化合物Excel 數(shù)據(jù)表格，運用“TRIM”函數(shù)優(yōu)化數(shù)據(jù)，使用“VLOOKU”函數(shù)匹配靶點基因名。并查閱相關(guān)文獻補充未匹配到的基因名稱。最后，將綜合得到的化學(xué)成分的相關(guān)靶點蛋白利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫，對其進行注釋。并利用Cytoscape 3.8.2 將其可視化。

2.2 糖尿病靶點預(yù)測及關(guān)鍵靶點獲取運用Gene-Cards（https：//www.genecards.org/）和 OMIM（https：//www.omim.org/）平臺獲取疾病相關(guān)靶點，疾病名稱取“Diabetes”為關(guān)鍵詞搜索相關(guān)靶點。設(shè)置對象為“human”，使用“VLOOKUP”函數(shù)匹配靶點基因名并篩選交集基因。從Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）軟件獲取中藥活性化合物作用靶點與糖尿病的交集靶點，即為黃芪-地黃治療糖尿病的潛在靶點。

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建通過String（https：//string-db.org/）平臺，導(dǎo)入交集基因，對象設(shè)置（homo sapiens）、取最高置信度0.9，隱藏游離基因節(jié)點，得到蛋白互作關(guān)系。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，選擇“network Analyzer”。取Degree值的二倍中位數(shù)以上，BC 和CC 的中位數(shù)上作為衡量標(biāo)準(zhǔn)篩選中藥與疾病的核心靶點。

2.4 GO 及KEGG 富集分析利用Metascape（http：//metascape.org/）平臺進行GO 功能、KEGG 通路富集分析，把所得交集靶點導(dǎo)入列表中，對象設(shè)為“human”，設(shè)置最小重疊（Min Overlap）為3、p 值取0.05、最低濃縮度為1.5，并將分析結(jié)果可視化。

2.5 黃芪-地黃關(guān)鍵成分與重要靶點的分子對接將藥對關(guān)鍵成分與重要靶點進行分子對接驗證。從RCSBPDB（https：//www.rcsb.org）數(shù)據(jù)庫中下載重要核心靶點PDBID 的PDB 格式，通過PvMOL2.2.0 軟件去除溶劑分子與配體。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取核心活性成分，并在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載核心成分3D 結(jié)構(gòu)的sdf 格式，通過OpenBabel3.1.1 軟件轉(zhuǎn)化為mol2 格式。利用AutoDockTools1.5.7 軟件對核心靶點及核心成分進行加氫、計算電荷數(shù)量、加ROOT 等操作。最后利用AutoDockTools1.5.7 軟件進行分子對接運算與分析，算法選擇“Local Search Parameters”，并借助OpenBabel、PyMOL 軟件完成文件格式轉(zhuǎn)化與分子對接視圖輸出。

3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.1 黃芪-地黃成分篩選在TCMSP 中檢索黃芪-地黃藥對的化學(xué)成分并進行篩選（設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18），獲取黃芪活性成分11種，地黃活性成分5 種。獲得黃芪和地黃活性成分對應(yīng)的靶點555 個。此外根據(jù)檢索結(jié)果得到4 458 個糖尿病治療作用相關(guān)的靶點。將黃芪-地黃有效成分的555 個靶點與糖尿病治療作用相關(guān)的4 458 個靶點，利用韋恩圖進行可視化，見圖2，可以看到藥物活性成分與疾病之間有310 個共同靶點。

圖2 黃芪-地黃與T2DM 共同靶點韋恩圖

3.2 黃芪-地黃活性成分-靶點見圖3。利用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建黃芪-地黃干預(yù)糖尿病的“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中青色方塊形狀部分為靶點，共計555 個節(jié)點。紅色為黃芪活性成分，共計11 個節(jié)點。藍色為地黃活性成分共計5 個節(jié)點。加上2 個藥物節(jié)點一共573 個節(jié)點。

圖3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

3.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建見圖4。利用String 導(dǎo)入交集基因，設(shè)置對象（homo sapiens）、取最高置信度0.900，隱藏游離基因節(jié)點。結(jié)果導(dǎo)入軟件Cytoscape3.7.2，選擇“network analyzer”，得到網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)作圖。得出130 個節(jié)點和1 034 條邊。選擇Degree 值的二倍中位數(shù)以上，BC 和CC 的中位數(shù)上作為衡量標(biāo)準(zhǔn)篩選核心成分靶點，得出核心成分靶點為TP53、AKT1、TNF、JUN、IL-6、MAPK3。

圖4 黃芪-地黃干預(yù)T2DM PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析見圖5。將交集靶點進行GO 功能和KEGG 富集分析，GO 富集中得到BP 4 952條，MF 717條，CC 387 條。由GO 富集功能可見其干涉疾病的生物過程主要涉及藥物反應(yīng)、營養(yǎng)水平、活性氧代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞對化學(xué)壓力和脂多糖的反應(yīng)等方面。分子功能主要涉及兒茶酚胺結(jié)合、核受體活動、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、羥酸結(jié)合等方面；細胞組分主要涉及膜閥、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域、突觸后膜、突觸膜等方面。KEGG 富集得到通路289條，根據(jù)所有通路的LogP 值、富集分數(shù)、基因數(shù)目，篩選出10 條信號通路，并進行可視化分析，如圖6。黃芪-地黃治療氣陰兩虛型糖尿病可能與AGE-RAGE 通路、白細胞介素（IL）-17 信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、藥物反應(yīng)通路、化學(xué)致癌-活性氧通路、化學(xué)致癌受體激活以及人類巨細胞感染通路等有關(guān)。

圖5 黃芪-地黃干預(yù)T2DM 關(guān)鍵靶點GO 功能富集分析圖

圖6 黃芪-地黃干預(yù)T2DM 關(guān)鍵靶點KEGG 功能富集分析圖

3.5 分子對接見表2、圖7～11。將黃芪-地黃中的核心成分槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異丁香酚、γ-氨基丁酸和PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心成分靶點TP53（1gzh）、AKT1（7nh5）、TNF（7ta3）、JUN（1jnm）、IL-6（1il6）、MAPK3（7nrb）進行分子對接驗證，結(jié)果如表2。當(dāng)化合物與靶點之間結(jié)合能＜0 的時候，認為蛋白靶點與化合物之間可以自行結(jié)合。若結(jié)合能＜-1.2，則表明活性成分與靶點蛋白之間的對接活性良好。本次分子對接結(jié)果中大部分結(jié)合能＜-5，可以認為化合物和靶點之間具有較強的結(jié)合能力。表明黃芪-地黃對糖尿病的干預(yù)效果較好，與文獻數(shù)據(jù)挖掘中的結(jié)果相符。表2 每橫列為同一化合物與各個主要靶點的結(jié)合能，每豎列為同一靶點和不同化合物的結(jié)合能。對接結(jié)合能越小，表明化合物和靶點之間的結(jié)合越緊密。取每橫列及每豎列的最小對接結(jié)果，去除＞-5 的對接結(jié)果及構(gòu)象不理想的對接結(jié)果，得到對接活性較好的部分通過Pymol 軟件進行可視化展示，如圖7～11。

圖7 AKT1-槲皮素

圖8 JUN-7-O-甲基異丁香酚

圖9 JUN-山奈酚

圖10 IL-6-山奈酚

圖11 MAKP3-山奈酚

表2 黃芪-地黃核心成分與核心靶點分子對接 kcal/mol

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，黃芪-地黃藥對中的潛在活性成分有16種，主要成分有槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異丁香酚、γ-氨基丁酸等。槲皮素除了抗炎、抗氧化作用外，可以通過抑制α-葡萄糖苷酶來增強db/db 小鼠的胰島素敏感性和胰島素信號傳導(dǎo)，從而改善空腹高血糖。同時，槲皮素中的醛糖還原酶抑制劑可以通過抑制醛糖還原酶（AR）活性控制過量葡萄糖代謝，減少山梨醇的積聚，改善一系列眼部并發(fā)癥的癥狀。此外，生理濃度范圍內(nèi)的槲皮素可通過激活CaMKKβ/AMPK 通路和胰島素信號通路，增加肌肉細胞對葡萄糖的攝取，從而達到降低血糖的目的[4]。山奈酚在動物實驗中不但可以有效地改善糖尿病大鼠空腹血糖，同時還可以保護糖尿病大鼠腎損傷，對糖尿病造成的病理組織起到保護作用[5]。γ-氨基丁酸可通過激活GSK-3β/Nrf2 通路來保護胰腺組織。在糖尿病動物模型中單獨使用、與其他成分聯(lián)合使用都能有效改善動物血糖。T2DM 大鼠食用含γ-氨基丁酸的飼料后，體內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B、核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）基因水平上調(diào)，糖原合成激酶3β（GSK-3β）基因水平下降，血糖和胰島素水平得到改善[6]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖提示TP53、AKT1、TNF、JUN、IL6、MAPK3 為黃芪-地黃藥對治療T2DM 的關(guān)鍵靶點。現(xiàn)代研究顯示，TP53 可誘導(dǎo)細胞生長停滯、細胞凋亡和細胞分化，參與平滑肌細胞凋亡調(diào)控，其高表達可減少心血管疾病及主要心血管不良事件的發(fā)生，參與糖的穩(wěn)態(tài)調(diào)控[7-8]。AKT1 在多種組織中表達，以心、腦、肺中多見，能夠廣泛參與細胞的生長和增殖。ATK1 是IRS-2 下游信號的主要部分，被胰島中的IRS-2 激活后，進而介入胰島細胞增殖，是胰島β 細胞增殖所必須的[9]。此外，ATK1 與TSC22D4 相互作用時，能夠降低饑餓期間AKT 其下游靶標(biāo)的基礎(chǔ)磷酸化，促進胰島素敏感性并改善葡萄糖代謝[10]。

TNF-α 是重要的炎性介質(zhì)，參與體內(nèi)免疫平衡調(diào)節(jié)過程，彭航婭等[11]研究表明TNF-α 與胰島素抵抗相關(guān)，且骨骼肌分泌的TNF-α 與葡萄糖的攝取和利用呈負相關(guān)。王迪等[12]研究表明，單純T2DM 患者血清TNF-α 大于健康對照組。T2DM 患者血清中TNF-α 與骨密度呈現(xiàn)負相關(guān)，TNF-α 升高時，患者骨密度下降，合并骨質(zhì)疏松并發(fā)癥的可能性升高。且T2DM 患者腸道菌群水平紊亂水平與TNF-α 存在相關(guān)性[13]。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制c-Jun，c-Fos 的基因表達，下調(diào)AP-1 水平，可有效改善糖尿病大鼠腎皮質(zhì)功能損傷[14]。此外發(fā)現(xiàn)T2DM 患兒外周血JUN的基因表達降低，JUN 與兒童T2DM 密切相關(guān)[15]。IL-6 是一種多功能的細胞因子，與T2DM 的病理生理學(xué)相關(guān)。IL-6 循環(huán)水平的升高是T2DM 的獨立預(yù)測因子，被認為與炎癥、胰島素抵抗以及β 細胞功能障礙發(fā)展有關(guān)。此外多種證據(jù)能夠表明IL-6 具有抗炎作用并能夠改善葡萄糖代謝[16]。邢旭[17]臨床觀察表明T2DM 患者血清中IL-6 異常表達，且與腎臟損傷程度相關(guān)。

KEGG 的通路富集結(jié)果顯示，黃芪-地黃干預(yù)糖尿病的信號通路主要與AGE-RAGE 通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路等相關(guān)。AGEs 是在高糖環(huán)境下的代謝產(chǎn)物，其毒性作用可直接破壞腎臟細胞及其組織，也稱為“糖毒素”。RAGE 是一種具有獨特氨基酸末端序列多肽，是細胞表面分子中免疫球蛋白超家族中的一個多配體成員，在眾多疾病中的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。許多細胞如內(nèi)皮細胞、單核-巨噬細胞、血管平滑肌細胞、腎小球上皮細胞、星形細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的表面都可見RAGE的表達[18]。健康人體中的RAGE 表達低下，持續(xù)的高糖狀態(tài)或糖尿病時，RAGE 出現(xiàn)高表達[19]。AGEs-RAGE 信號通路可以激活下游信號傳導(dǎo)通路包括p38MAPK、NF-κB 等共同參與氧化應(yīng)激與炎癥，引起糖尿病微血管并發(fā)癥[20]。此外AGEs-RAGE 信號通路可以激活腎素-血管素緊張素-醛固酮系統(tǒng)，促使血管內(nèi)皮細胞增生，活性氧（ROS）的生成加速，從而造成足細胞的損傷[18]。越來越多的觀點認同糖尿病是一種由慢性脂糖代謝引起的炎性疾病。炎性因素在糖尿病發(fā)生和發(fā)展中占重要地位。TNF-α 可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起炎癥因子升高及胰島素抵抗[21]。JNK 信號通路在肥胖引起的胰島素抵抗中起關(guān)鍵作用，而TNF-α 可以激活JNK。TNF-α 還可通過誘導(dǎo)SOCS 家族成員中SOCS3 的表達來參與介導(dǎo)細胞因子對胰島素信號通路的抑制。一氧化氮（NO）在誘生型一氧化氮合酶（iNOS）/NO 信號通路中參與胰島素抵抗，介導(dǎo)炎癥因子、脂質(zhì)和葡萄糖誘導(dǎo)的B 細胞損傷，同時也是導(dǎo)致B 細胞凋亡的重要介質(zhì)。而TNF-α和TNF-γ 可以通過誘導(dǎo)L6 骨骼肌細胞iNOS 表達，催化NO 產(chǎn)生，從而導(dǎo)致胰島素抵抗，并通過介導(dǎo)炎癥因子、脂質(zhì)及高糖所致的胰島B 細胞功能障礙，在T2DM 發(fā)病中起到非常重要的作用[22]。IL-17 在T1DM 和T2DM 患者的胰島中均有表達，T2DM 患者胰島中IL-17 的表達最高[23]。有研究表明，IL-17 可能通過激活NF-κB 通路，上調(diào)炎癥細胞因子基因表達，刺激促炎細胞因子包括TNF-α 的分泌，從而抑制胰島素信號通路，誘導(dǎo)胰島素抵抗，最后導(dǎo)致T2DM 的發(fā)生發(fā)展[24]。

本研究對近20 年間現(xiàn)代處方文獻的檢索和挖掘，篩選出治療氣陰兩虛型T2DM 的核心藥對黃芪-地黃。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到黃芪-地黃16 個活性成分，活性成分相關(guān)靶點555 個。T2DM 靶點4 458個，交集靶點310 個。并通過分子對接驗證核心成分與靶點之間存在較強的對接活性。GO 富集中得到BP 4 952條，MF 717條，CC 387 條。KEGG 富集得到通路289條，主要涉及AGE-RAGE 通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路等。提示黃芪-地黃可通過多成分、多通路、多靶點對氣陰兩虛型T2DM進行干預(yù)。

綜上，通過大量數(shù)據(jù)挖掘得到中藥治療T2DM氣陰兩虛證型的主要藥物和方劑，并對挖掘結(jié)果中的核心藥物進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和靶向的研究，揭示藥物的作用機制和多種調(diào)節(jié)途徑。研究結(jié)果能夠為臨床中醫(yī)藥治療氣陰兩虛型T2DM 提供參考，并為科研提供思路和實驗依據(jù)，提高藥物試驗的成功率。