包瑞璇，周皓隆，方再郗，盧靜，呂明生，王淑軍

（1.江蘇海洋大學海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室/海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 225005；2.江蘇省海洋生物產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222000）

乳酸菌是發(fā)酵糖類產生乳酸、過氧化氫酶陰性和革蘭氏陽性細菌的通稱[1,2]，其厭氧或兼性厭氧，對營養(yǎng)要求比較高[3-5]。在水產養(yǎng)殖中，乳酸菌是微生態(tài)制劑的重要菌種之一。乳酸菌產生的有機酸可以降低魚蝦腸道內的pH，抑制病原菌在腸道的定植[6,7]；分泌的消化酶可以促進水產動物的生長[8,9]。黃浦江等[10]采用乳酸菌降解作用降低凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖水體中的有機物，降低氨氮、亞硝酸鹽等的含量，凈化水質。殷海成等[11]在飼料中添加乳酸桿菌后，顯著提高了鯉（Cyprinus carpio）末重、增重率和生長率。衣啟麟等[12]將嗜酸乳桿菌投喂給凡納對蝦，有效抑制了病菌侵入引起的細胞凋亡，降低了對蝦的死亡率。

從健康水產動物腸道中篩選乳酸菌是獲得優(yōu)良菌株的重要手段之一[13,14]。我國水產養(yǎng)殖的密度較高，受病原微生物侵染的潛在威脅大[15]。通過乳酸菌定植于水產動物腸道，調節(jié)宿主免疫功能，促進營養(yǎng)物質的吸收和利用[18,9]，可以降低抗生素的使用，實現(xiàn)綠色健康養(yǎng)殖，保障食品安全，提高經濟效益[20-22]。海州灣海水養(yǎng)殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）和凡納對蝦的病害日益增多[21]，病原菌主要有鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）等[22]；弧菌病一直是凡納對蝦養(yǎng)殖的重要病害[23]。本研究通過從健康大菱鲆腸道內分離乳酸菌，研究其特性，以篩選適用于海水養(yǎng)殖魚蝦的益生菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

大菱鲆和凡納對蝦購于江蘇省連云港市海鮮市場。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、鰻弧菌（V.anguillarum）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌（Escherichia coli）均為實驗室保藏。MRS 固體培養(yǎng)基和MRS 肉湯培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司）；大豆蛋白酶、脂肪酶、豬胃蛋白酶、牛胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、卡納霉素、氨芐青霉素、慶大霉素和羅紅霉素（阿拉丁工業(yè)公司）。細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（天根生化科技有限公司），乳酸、過氧化氫和過氧化氫酶（生物工程上海股份有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設備

小型離心機（Eppendorf 儀器公司），PCR 擴增儀（伯樂生命醫(yī)學產品公司），電泳槽和電泳儀（北京六一儀器廠），pH 計（上海梅特勒-托利多儀器公司），酶標儀（Bio-Rad Laboratories），SPX-150C 型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的篩選

取健康大菱鲆腸道5 g 研磨，用無菌生理鹽水梯度稀釋后，涂布于MRS 平板（含1%碳酸鈣）上，37℃下靜置培養(yǎng)24 h。挑取白色光滑圓潤、有透明圈的菌落三區(qū)劃線，純化二次，斜面保藏[24]。

1.2.2 菌株的鑒定

觸酶試驗：挑取培養(yǎng)菌苔置于潔凈的玻片上，在其上加一滴3%過氧化氫，觀察結果，30 s 內有氣泡產生為陽性菌，反之為陰性[25]。保留觸酶陰性菌株進行下一步試驗。

革蘭氏染色：挑取新培養(yǎng)20 h 的純培養(yǎng)物，用革蘭氏染色法染色，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照，保留革蘭氏陽性菌株進行下一步試驗[25]。

16S rDNA 鑒定：選用細菌鑒定通用引物27F 和1492R 進行PCR 擴增，電泳檢測后寄上海生工檢測，提交序列到NCBI 比對，用MEGA7 軟件,采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹[26]。

1.2.3 乳酸菌抑菌活性檢測

采用牛津杯法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性。指示菌分別為鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。取菌懸液50 μL 涂布于LB 固體平板上，將牛津杯均勻旋轉并加入200 μL 發(fā)酵上清液，37℃培養(yǎng)12～24 h 后，測量抑菌圈直徑，以未接種的MRS肉湯培養(yǎng)基上清液作為對照，設三個平行樣，測量后取平均值。

1.2.4 乳酸菌的耐藥性檢測

采用濾紙片法測定乳酸菌對抗生素的敏感性。取50 μL 菌懸液涂布于MRS 平板上，將滅菌的濾紙片旋轉后分別滴加5 μL 卡納霉素、氨芐青霉素、慶大霉素和羅紅霉素（100 μg/mL）。37℃培養(yǎng)12 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 乳酸菌生物被膜形成能力檢測

1.2.6 發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵上清液的制備

菌株按2%的接種量接入25 mL 的MRS 肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)液10 000 r/min 離心5 min，取上清液，用0.22 μm 濾器過濾，備用。

1.2.7 指示菌菌懸液的制備

指示菌菌株按2%接種量接入LB 肉湯培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)10 h。

1.2.8 菌株發(fā)酵液抑菌物質的鑒定

過氧化氫：在發(fā)酵上清液中加入1.5 mg/mL 的過氧化氫酶，對照組不用過氧化氫酶處理，在37℃水浴作用2 h，排除發(fā)酵液中過氧化氫的作用。以鰻弧菌為指示菌，采用牛津杯法檢測抑菌能力[28]。

有機酸產物：鑒定發(fā)酵上清液中起抑菌作用的是否為有機酸等物質。將菌株發(fā)酵液用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 調節(jié)pH 至5.0，分別用乳酸、乙酸和鹽酸調節(jié)pH 為5.0 的MRS 肉湯作對照組，檢測其對鰻弧菌的抑菌能力[29]。

1.2.9 溫度對發(fā)酵上清液抑菌性能的影響

“正直，”他瞪大眼睛一邊揉著大腿說，“對公牛般神氣的財神爺來說是一塊紅布，換句話說，正直是窮人的遮羞布?！保?014：431）

將菌株上清液的pH 調至5.0，分別在30℃、37℃、60℃、80℃、105℃下水浴30 min，滅菌的MRS肉湯為對照組，檢測其對鰻弧菌的抑菌能力。

1.2.10 蛋白酶敏感試驗

將菌株發(fā)酵液的pH 調至大豆蛋白酶、脂肪酶、豬胃蛋白酶、牛胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的最適pH（分別為8.0、7.5、2.5、8.6 和10.0），37℃恒溫水浴2 h、4 h，沸水10 min 使酶失活，再將pH 調為5.0，以處理0 h 和未處理發(fā)酵液為對照，采用牛津杯法檢測抑菌作用[30]。

1.2.11 致病菌感染試驗

將150 mL 濃度為1×103cfu/mL（秋季）、2×103cfu/mL（夏季）的鰻弧菌、哈維氏弧菌和菌株N5 分別加入15 L 鹽濃度為2%的水中，對照組三組：鹽水對照（C）；MRS 和鹽水混合（M）；LAB 和鹽水混合（L）。試驗組為：菌株N5 和鹽水混合（N）；哈維氏弧菌和鹽水混合（H）；哈維氏弧菌與菌株N5 和鹽水混合（H+N）；鰻弧菌和鹽水混合（V）；鰻弧菌與N5 和鹽水混合（V+N）；哈維氏弧菌與鰻弧菌與菌株N5 和鹽水混合（H+V+N）。其中只有H+V+N 組中，哈維氏弧菌與鰻弧菌分別是75 mL。先加入菌株N5 菌液試養(yǎng)5 d，待蝦生存穩(wěn)定后，加入致病菌，觀察7 d，記錄凡納對蝦的存活[31]。

1.2.12 菌株N5 對病原菌形成生物膜的影響

在24 孔板中加入1 mL MRS 培養(yǎng)基和培養(yǎng)至對數(shù)生長期的鰻弧菌或哈維氏弧菌1 mL，菌株N5發(fā)酵上清的加入是亦為1 mL。分組同1.2.11。30℃培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液，檢測病原菌的生物膜[32]，方法同1.2.5。

1.3 數(shù)據分析

數(shù)據用平均值加標準差表示，應用SPSS 20 統(tǒng)計軟件進行。試驗均設置三個平行，進行均值檢驗、方差齊性檢驗、顯著性檢驗、單因素方差分析，采用Origin 9.0 繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

從大菱鲆腸道中分離出22 株具有溶鈣圈的菌株，其中8 株菌為革蘭氏陽性，過氧化氫酶呈陰性，對該8 株菌進行分子生物學鑒定。

2.2 乳酸菌的鑒定

通過16S rDNA 序測定，利用BLAST 進行序列比對，利用MEGA7 軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示8 個菌株均為Lactobacillus，與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）相似度最高，其中菌株N5 的系統(tǒng)進化樹見圖1。

圖1 菌株N5 系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain N5

2.3 乳酸菌抑菌能力

由表1 可知，菌株N5 對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，菌株N4 和N7 對枯草單胞菌抑制效果較差。菌株N5、N6 對哈維氏弧菌抑制效果較強，對副溶血弧菌抑制效果較好的是菌株N2 和N5，菌株N2 和N6 對嗜水氣單胞菌具有較好的抑制效果，對副溶血弧菌有明顯抑制效果的是菌株N2，菌株N5對鰻弧菌的抑制效果最佳。

表1 乳酸菌對指示菌的抑菌效果Tab.1 Bacteriostatic effect of isolated Lactobacillus spp.

2.4 乳酸菌藥物敏感性

結果表明：菌株N2、N6、N8 對卡納霉素高度敏感；菌株N1、N4、N7、N9 對卡納霉素中度敏感，而菌株N5 為耐藥；菌株N6 對氨芐青霉素和羅紅霉素表現(xiàn)為耐藥（表2）。

表2 分離菌株藥物敏感性檢測結果Tab.2 Drug sensitivity test results of isolated strains

2.5 乳酸菌生物被膜形成能力測定

結果表明：N1 的生物被膜形成能力更強，菌株N2、N6、N8 和N9 亦能較好地形成被膜，菌株N5 形成生物被膜的能力較弱（圖2）。

圖2 菌株生物被膜形成能力Fig.2 Determination of biofilm formation ability of bacterial strains

2.6 過氧化氫酶對菌株N5 抑菌能力的影響

經過過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液與未經過處理的上清液相比抑菌能力沒有顯著性差異，推測起抑菌作用的物質不是過氧化氫（表3）。

表3 菌株N5 發(fā)酵上清液排除過氧化氫試驗[11]Tab.3 Elimination of hydrogen peroxide in supernatant of strain N5 fermentation

2.7 菌株N5 抑菌物質的檢測

由表4 可知，菌株N5 發(fā)酵上清液對鰻弧菌有較強的抑制效果，用乳酸、乙酸和鹽酸調節(jié)pH 后，均不能抑制鰻弧菌的生長。推測菌株N5 的抑制鰻弧菌作用物質不是有機酸。

表4 菌株N5 發(fā)酵上清液排酸試驗[12]Tab.4 Acid removal test of fermentation supernatant of strain N5

2.8 溫度對菌株N5 抑菌物質的影響

結果發(fā)現(xiàn)，加熱處理不影響菌株N5 發(fā)酵上清抑制鰻弧菌的作用，表明該抑菌物質耐熱。105℃高溫處理后，抑菌作用略有提高（圖3）。

圖3 溫度對菌株N5 抑菌物質的影響，“ab”表示加熱處理后結果的顯著性分析（P＜0.05）Fig.3 Effect of temperature on the antibacterial secretory substance of strain N5，“ab”represents the significant difference between different warming treatments（P <0.05）

2.9 蛋白酶敏感試驗

菌株N5 發(fā)酵上清經多種蛋白酶處理后，對鰻弧菌的抑菌能力均有所下降（圖4），處理4 h 后，喪失抑菌能力。因此，推測發(fā)酵上清液中的抑菌物質為蛋白質。

圖4 不同酶處理對菌株N5 抑菌能力的影響，“abcd”表示不同酶處理后結果的顯著性分析（P ＜0.05）Fig.4 Effects of different enzyme treatments on the antibacterial ability of strain N5，“abcd”shows the significant difference between different enzyme treatments（P <0.05）

2.10 菌株N5 對致病菌感染試驗

凡納對蝦養(yǎng)殖5 d 定植菌株N5，加入鰻弧菌和哈維氏弧菌，繼續(xù)養(yǎng)殖7 d，統(tǒng)計對蝦存活的情況（圖5）。

圖5 菌株N5 在秋、夏兩季對凡納對蝦抗感染的影響，abcd表示為試驗組與對照組的顯著性分析（P＜0.05），紅色為夏季之間比較，蘭色為秋季之間比較Fig.5 Effect of strain N5 on anti-infection of Pacific white leg shrimp L.vannamei in autumn and summer.abcd were expressed as significant difference between the experimental group and the control group（P <0.05）.Red is the comparison between summer and blue is the comparison between autumn

在秋季和夏季，定植了菌株N5 的蝦的死亡率顯著降低。抗鰻弧菌感染的作用強于抗哈維氏菌的作用。秋季的效果好于夏季。夏季蝦的死亡率高于秋季，氣溫高導致致病菌的致病能力和蝦的死亡率大幅提高。

2.11 菌株N5 對病原菌形成生物膜的影響

菌株N5 對鰻弧菌和哈維氏弧菌形成生物膜的影響見圖6。菌株N5 與致病菌共培養(yǎng)后，對鰻弧菌和哈維氏弧菌生物膜的形成具有較強的抑制能力。

圖6 菌株N5 對鰻弧菌和哈維氏菌形成生物膜的影響，abcd 表示為試驗組之間的顯著性分析（P＜0.05）Fig.6 The effect of strain N5 on biofilm formation of V.anguillarum and V.harvey.abcd were expressed as significant difference between groups（P <0.05）

3 討論

本實驗從健康的大菱鲆腸道中分離益生菌，通過平板劃線法分離得到8 株乳酸菌，對研究了病原菌的抑制和耐抗生素等，其中菌株N5 的特性較為突出，對其抑菌作用的物質以及對凡納對蝦的抗病作用進行了試驗。

菌株N5 在生長5 h 后進入生長對數(shù)期。這與高擎燏等[33]的研究結果相似。分離菌株多數(shù)具有較好生物被膜形成能力。史國萃等[34]報道，非致病性細菌生物被膜的形成具有保護作用，可維持和適應自身生存環(huán)境，增強對各種不利因素的抵抗力。

乳酸菌抑制病原菌可以提高水產動物的免疫力。然而，乳酸菌之間亦存在較大差異。郭鳳茹等[35]分析了20 株乳酸菌對5 種致病菌（大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌）的抑菌效果。結果表明：菌株之間的抑菌能力有一定差異，其中的13 株乳酸菌對5 種指示菌有不同程度的抑菌作用。本文從大菱鲆腸道內分離的8株乳酸菌的抑菌能力也存在差異，其中，菌株N5 對鰻弧菌的抑制能力最強；添加兩種病原菌時，菌株N5 仍表現(xiàn)出一定的抗病能力。

近年來，以乳酸菌為主的微生態(tài)制劑被用于改善水生動物健康狀況和預防疾病。具有廣譜拮抗作用乳酸菌是重要篩選標準之一。Kong 等[36]從烏鱧（Channa argus）腸道中分離出178 株菌株，其中5株均對多種水生病原菌具有較高的抑制作用?？股啬退幮砸呀洺蔀橐粋€全球化問題[37]。郭鳳茹等[38]研究表明：不同屬乳酸菌對抗生素的耐藥性具有明顯的種間差異，而相同屬的乳酸菌有其遺傳耐藥性，也存在不同程度的種內差異。菌株N5 對卡納霉素表現(xiàn)為耐藥，對羅紅霉素為中度敏感，反映了大菱鲆腸道乳酸菌的耐藥情況。

隨著養(yǎng)殖密度的不斷提高，養(yǎng)殖環(huán)境劣化，細菌性疾病日益增多，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經濟損失[39]。研究發(fā)現(xiàn)，65%～80%的細菌感染是由細菌生物膜所介導[40]。王亮亮[41]從牛奶中篩選抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成的乳酸菌，預防疾病的作用強。Sha 等[42]報導飼喂含有益生菌飼料的蝦存活率顯著提高。乳酸菌定植可以提高水產動物的抗病能力[43]。本試驗表明，菌株N 5 可以顯著抑制病原菌生物膜的形成。在秋季和夏季的試驗中，菌株N5 都能增加海州灣養(yǎng)殖的凡納濱對蝦的抗病能力，表明該菌株在水產養(yǎng)殖具有一定的應用潛力?？咕镔|是一種耐熱的蛋白質（乳酸菌素），有利于在加工飼料中添加；進一步對其結構與功能的研究也具有一定的科學意義。

結論

本研究從健康大菱鲆腸道分離得到了8 株乳酸桿菌，對鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌等具有一定的抑菌作用；對羅紅霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、卡納霉素等抗生素表現(xiàn)出不同程度的敏感和抗藥性，其中，菌株N5 的抑菌作用顯著、對抗生素敏感。推測菌株N5 的抑菌物質是一種耐熱的乳酸菌素。菌株N5 在抑制鰻弧菌和哈維氏弧菌生物膜形成有較強的抑制能力。通過定植菌株N5，可以提高凡納濱對蝦對鰻弧菌和哈維氏菌的抗感染能力，顯著降低蝦的死亡率。該菌株具有在水產養(yǎng)殖中應用的潛力，進一步研究耐熱的乳酸菌素的分子結構也具有一定的科學意義。