滕藤 唐其柱

(1.武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖北 武漢 430060; 2.代謝與慢病相關湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430060)

阿霉素(doxorubicin)是一種廣泛使用的蒽環(huán)類高效化療藥物,用于治療各種類型的癌癥,然而,阿霉素的劑量依賴性心臟毒性極大地限制了其臨床應用[1]。目前為止還沒有任何一種有效的療法可以預防或者消除阿霉素的心臟毒性?；钚匝醯拇罅慨a(chǎn)生是阿霉素造成心臟損傷的主要因素,這引起心肌細胞氧化損傷和心肌細胞凋亡,最終導致心力衰竭的發(fā)生[2]。

右雷佐生是美國食品和藥物管理局(FDA)唯一批準用于阿霉素心臟毒性治療的藥物,但由于其潛在的致癌性,因此臨床使用受到限制[3-4]。許多天然化合物具有明顯的抗氧化、抗炎癥等作用[5]。甜菜堿廣泛存在于動植物體內(nèi)[6],是動物代謝的中間產(chǎn)物,是動物體內(nèi)重要的甲基供體。甜菜堿可以促進肝臟和腎臟同型半胱氨酸的代謝[7],同時,甜菜堿也具有較強的抗炎、抗氧化以及抗凋亡作用[8-10],但關于其在阿霉素心臟毒性中的作用機制尚不清楚,現(xiàn)探究甜菜堿在阿霉素心臟毒性中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甜菜堿(betaine)購于阿拉丁;阿霉素購于深圳萬樂藥業(yè)有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化蛋白激酶B(phosph-protein kinase B,p-AKT)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化糖原合成激酶-3β(phosph-glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β)均購于CST公司;4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)購于Abcam公司;TUNEL凋亡檢測試劑盒購于碧云天;丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒以及胱天蛋白酶(caspase)-3活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;心肌損傷標志物試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 模型建立與動物分組

選取購自北京華阜康生物科技股份有限公司8～10周齡的雄性C57/BL6小鼠48只,體重為23.5～27.5 g,飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級,恒溫、恒濕,12 h晝夜節(jié)律,并可自由飲食。本研究涉及的所有動物實驗均通過武漢大學動物倫理委員會批準。小鼠經(jīng)過適應性喂養(yǎng)1周后,按照隨機數(shù)字表分為4組,每組12只,分別為生理鹽水+生理鹽水組、生理鹽水+甜菜堿組、阿霉素+生理鹽水組、阿霉素+甜菜堿組。實驗開始第一天,阿霉素組小鼠給予阿霉素(15 mg/kg)單次腹腔注射,對照組小鼠腹腔注射同體積生理鹽水;甜菜堿組小鼠給予甜菜堿(800 mg·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃7 d,對照組小鼠給予同等體積生理鹽水灌胃。

1.3 心功能檢測及取材

各組小鼠結束灌胃后于異氟烷(2%濃度誘導,1%濃度維持,氧流量300～500 mL/min)吸入麻醉下進行心臟超聲檢查,評估心功能情況[左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)]、[左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)]等。完成檢測后處死小鼠、收集心臟標本并記錄取材信息,用于分子生物學檢測和病理檢測。

1.4 組織病理檢測

1.4.1 免疫組織化學染色

將心臟組織脫蠟、水合、抗原修復、H2O2處理、封閉后滴加一抗(4-HNE)于4 ℃過夜,第二天進行二抗孵育以及DAB顯色,顯色完全后及時終止,經(jīng)蘇木素復染、脫水、透明后用樹脂封片。

1.4.2 組織TUNEL染色

將心臟組織脫蠟、水合后,按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.5 分子生物學檢測

1.5.1 蛋白免疫印跡試驗

取左心室組織樣本提取蛋白并進行BCA定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉膜后,于4 ℃過夜進行一抗的孵育,次日孵育對應種屬二抗,然后按照比例配置ECL化學發(fā)光顯影液,曝光顯影,然后用Image Lab軟件對條帶進行灰度分析。

1.5.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應試驗

取左心室組織樣本提取總RNA,逆轉錄成cDNA后,進行目標基因的表達檢測。

1.6 生化檢測

將左心室組織制成勻漿后分別用心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、MDA以及caspase-3活性檢測試劑盒按照說明書進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,兩組間樣本比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間樣本比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況及心功能比較

阿霉素+甜菜堿組的小鼠體重以及心重/脛骨長的下降程度較阿霉素+生理鹽水組的小鼠明顯減輕(P<0.05)。阿霉素處理的小鼠較對照組小鼠的LVEF以及LVFS明顯降低(P<0.05),甜菜堿治療可以明顯改善阿霉素損傷的心功能(P<0.05)(圖1)。阿霉素處理的小鼠的心肌損傷標志物cTnI以及LDH較對照組小鼠明顯升高(P<0.05),而甜菜堿治療可以明顯減輕小鼠由阿霉素導致的心肌損傷(P<0.05)(圖2)。

注:*表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;# 表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

注:?表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

2.2 各組小鼠心臟氧化應激情況比較

阿霉素處理的小鼠心臟較對照組小鼠心臟中的MDA以及4-HNE含量明顯升高(P<0.05),甜菜堿治療可以明顯減少小鼠心臟中由阿霉素誘導的MDA以及4-HNE的生成(P<0.05)(圖3)。與對照組小鼠相比,阿霉素處理的小鼠心臟中的超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2,SOD-2)、谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1,GPx-1)以及過氧化氫酶(catalase,CAT)的mRNA表達降低(P<0.05),甜菜堿治療的小鼠心臟較阿霉素小鼠心臟中的SOD-2、GPx-1以及CAT的mRNA表達上調(diào)(P<0.05)(圖4)。

注:*表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

2.3 各組小鼠心肌細胞凋亡情況比較

與對照組小鼠相比,阿霉素處理的小鼠心臟中caspase-3的活性明顯增加(P<0.05),甜菜堿治療可以降低由阿霉素誘導增加的心臟caspase-3活性(P<0.05)。TUNEL染色顯示,阿霉素處理的小鼠心臟較對照組小鼠的心臟凋亡水平顯著增加(P<0.05),經(jīng)過甜菜堿治療,阿霉素導致的小鼠心臟凋亡水平顯著降低(P<0.05)(圖5)。

注:?表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

2.4 相關通路改變情況

蛋白質(zhì)免疫印跡結果顯示,阿霉素組的小鼠心臟中,p-AKT、p-GSK-3β顯著降低(P<0.05);甜菜堿恢復了小鼠心臟中p-AKT和p-GSK-3β的含量(P<0.05)(圖6)。這說明,甜菜堿可能是通過AKT/GSK-3β通路發(fā)揮對阿霉素所致心肌損傷的保護作用。

3 討論

許多癌癥患者在接受治療后因為阿霉素心臟毒性引起的心力衰竭導致生活質(zhì)量顯著降低[11]。因此,尋找一種有前景的藥物治療阿霉素引起的心臟毒性成為迫切需要。

注:*表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

注:NS,生理鹽水;DOX,阿霉素;BET,甜菜堿;?表示與生理鹽水+生理鹽水組相比,P<0.05;#表示與阿霉素+生理鹽水組相比,P<0.05;n=12。

氧化應激被認為是阿霉素誘導心臟毒性的最主要機制,此前的許多研究[12]表明,活性氧的過度產(chǎn)生會刺激脂質(zhì)過氧化等損傷,并最終導致心力衰竭。Meng等[13]研究發(fā)現(xiàn),甜菜堿可以減輕小鼠應激以及氧化應激引起的睪丸損傷。甜菜堿可以減輕乙醇引起的肝臟以及小腦的氧化應激損傷[14-15]。Lv等[16]研究報道,在ApoE-/-的小鼠中,補充甜菜堿可以減少血液中腫瘤壞死因子α等炎癥因子,從而減小動脈粥樣硬化的病變面積。Heidari等[17]報道,口服補充甜菜堿,可以減少氧化應激標志物,從而減輕膽汁淤積相關腎損傷。這些研究結果說明,甜菜堿具有較強的抗氧化作用。筆者研究也發(fā)現(xiàn),甜菜堿可以提高阿霉素小鼠心臟中抗氧化酶的活性,并降低阿霉素小鼠心臟中過氧化物的水平。

阿霉素可以誘導細胞凋亡,Mizutani等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)阿霉素處理的人早幼粒白血病細胞表現(xiàn)出caspase-3蛋白的激活,導致細胞死亡。線粒體依賴的內(nèi)源性通路在阿霉素心臟毒性中起著關鍵作用,這一途徑是通過上調(diào)促凋亡蛋白,如B淋巴細胞瘤-2基因關聯(lián)X蛋白,促進細胞色素C從線粒體釋放,導致caspase-9激活,進而導致效應器caspase-3激活[19]。此外,阿霉素還可通過死亡受體(death receptor,DR)等外源性途徑介導心肌細胞的凋亡。Zhao等[20]證實了阿霉素誘導的人多能干細胞來源的心肌細胞中DR的上調(diào),如腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體、凋亡相關因子、DR4和DR5,這些上調(diào)的DR與其同源配體結合,觸發(fā)caspase級聯(lián)反應,最終導致細胞凋亡。Veskovic等[10]發(fā)現(xiàn),甜菜堿可以通過AKT/mTOR與自噬通路減輕肝臟氧化應激、炎癥以及凋亡,從而發(fā)揮對于非酒精性脂肪肝的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn),在阿霉素處理的小鼠心臟中,caspase-3活性明顯升高,TUNEL染色顯示心肌細胞的凋亡水平也明顯增加;但經(jīng)過甜菜堿治療,小鼠心臟中caspase-3的活性被明顯抑制,TUNEL陽性率也明顯降低。這說明,阿霉素治療會引起較為嚴重的心肌細胞凋亡發(fā)生,但甜菜堿可以明顯減輕心肌細胞凋亡。

AKT和GSK-3β是胰島素信號通路的兩種重要蛋白激酶。當胰島素與其受體結合時,Thr308位點被磷酸化從而激活AKT,活化的AKT磷酸化GSK-3β并抑制其激酶活性[21],而 GSK-3β活性升高會破壞線粒體膜電位,增加細胞內(nèi)活性氧積累[22]。既往研究[23-24]表明,阿霉素誘導的損傷心臟中,AKT的活性明顯降低,而AKT磷酸化的增強促進了心肌細胞的存活,預防了阿霉素誘導的心功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn),阿霉素處理的小鼠心臟中,p-AKT的含量顯著降低,GSK-3β的活性明顯增高;經(jīng)過甜菜堿治療,AKT的活性明顯增加,而GSK-3β的活性則被明顯抑制。這說明,甜菜堿對阿霉素心臟毒性的保護作用可能是通過AKT/GSK-3β通路實現(xiàn)的。

綜上所述,甜菜堿可以減輕阿霉素引起的心臟氧化應激損傷和心肌細胞凋亡,而這些作用可能是通過激活AKT/GSK-3β實現(xiàn)的。