楊麗秋 龍?chǎng)? 彭強(qiáng) 楊陽(yáng) 岳陽(yáng) 楊永蘭 龍毅 楊宇 朱麗

摘要：目的? 通過(guò)本項(xiàng)目研究，了解三步止瀉法治療腹瀉乳兔的可能作用機(jī)制，明確三步止瀉法治療小兒腹瀉與腸微生態(tài)作用機(jī)制的強(qiáng)相關(guān)性。方法? 將乳兔制作脾虛證模型后，分為六組即：補(bǔ)脾組、摩腹組、推上七節(jié)骨組、三步止瀉手法組、益生菌組、模型組，經(jīng)過(guò)治療周期后，處死乳兔后，將胃黏膜、腸黏膜組織切片進(jìn)行HE染色，觀察乳兔胃、腸黏膜的組織學(xué)變化；檢測(cè)腹瀉兔血漿內(nèi)毒素的表達(dá)水平；并收集各組大鼠糞便排泄物，進(jìn)行微生物組總DNA提取，目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量，測(cè)序文庫(kù)制備，上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序，然后多元化對(duì)比，后統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果? 兔胃腸組織HE染色提示治療后三步止瀉手法組、補(bǔ)脾組、摩腹組及推上七節(jié)骨組、益生菌組能有效的改善兔胃腸組織水腫及炎癥情況；血漿內(nèi)毒素的表達(dá)水平表明補(bǔ)脾組在降低兔血漿內(nèi)毒素有較好的效果（P<0.05），三步止瀉手法組、摩腹組、推上七節(jié)骨組及益生菌組對(duì)降低兔血漿內(nèi)毒素也有一定的作用；OTU/ASV分析、Alpha多樣性分析表明摩腹組及三步止瀉手法組可糾正菌群紊亂，提高菌群的豐富度及均勻性，使腸道內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。結(jié)論? 三步止瀉手法組具有刺激宿主產(chǎn)生免疫及清除功能、減少內(nèi)毒素的吸收、調(diào)整腸道菌群間及其與人體生理機(jī)能的平衡狀態(tài)，改善腹瀉癥狀，且研究表明，各手法組在治療中，針對(duì)性各有不同。

關(guān)鍵詞：三步止瀉；小兒推拿；小兒腹瀉；腸微生態(tài)

中圖分類(lèi)號(hào)：R256.34????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B????? 文章編號(hào)：1007-2349（2023）06-0070-06

Study on the Mechanism of Three-Step Antidiarrheal Therapy in the Treatment of Infantile Diarrhea by Regulating Intestinal Microecology

YANG Li-qiu， LONG Xin， PENG Qiang， YANG Yang， YUE Yang， YANG Yong-lan， LONG Yi， YANG Yu， ZHU Li

（Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： Through this study， to understand the possible mechanism of action of three-step antidiarrheal therapy in the treatment of diarrhea in suckling rabbits， and to clarify the strong correlation between the three-step antidiarrheal therapy in the treatment of diarrhea in children and the intestinal microecological mechanism of action. Methods： After the spleen deficiency syndrome model of the suckling rabbits was made， the rabbits were divided into six groups： spleen tonifying group， abdominal massage group， seven-segment bone pushing group， three-step antidiarrheal technique group， probiotics group and model group. After the treatment cycle and the suckling rabbits were sacrificed， the gastric mucosa and intestinal mucosa tissues were sliced for HE staining， and the histological changes of the gastric mucosa and intestinal mucosa were observed. The expression level of plasma endotoxin of the diarrhea rabbits was detected. The feces and excrement of the rabbits each group were collected for total DNA extraction of microbiome， PCR amplification of target fragments， recycling and purification of amplification products， fluorescence quantification of amplification products， preparation of sequencing library， high-throughput sequencing on the computer， and then diversified comparison， and statistical analysis. Results： The HE staining of the rabbit gastrointestinal tissue suggested that after treatment， the three-step antidiarrhea manipulation group， the spleen tonifying group， the abdominal massage group， the seven-segment bone pushing group and the probiotics group could effectively improve the edema and inflammation of the rabbit gastrointestinal tissue. The expression level of plasma endotoxin showed that the spleen tonifying group had a good effect on the reduction of the rabbit plasma endotoxin （P<0.05）， and the three-step antidiarrhea manipulation group， the abdominal massage group， the seven-segment bone pushing group and the probiotics group also had a certain effect on the reduction of the rabbit plasma endotoxin. OTU/ASV analysis and Alpha diversity analysis showed that the abdominal massage group and the three-step antidiarrhea manipulation group could correct the flora disorder， improve the richness and uniformity of the flora， and restore the intestinal environment to a stable state. Conclusion： The three-step antidiarrheal manipulation group can stimulate the host to produce immunity and clearance function， reduce the absorption of endotoxin， adjust the balance between intestinal flora and human physiological function， and improve the symptoms of diarrhea. The study has shown that each manipulation group has different pertinence in the treatment.

【Key words】Three-Step Antidiarrheal Therapy; Pediatric Massage; Infantile Diarrhea; Intestinal Microecology

小兒腹瀉亦稱(chēng)小兒泄瀉，是小兒常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，發(fā)病年齡3歲以下多見(jiàn)，一年四季均可發(fā)病，尤以季節(jié)更替時(shí)明顯。它主要表現(xiàn)為大便次數(shù)增多并且糞質(zhì)改變，病情較重者可出現(xiàn)脫水及電解質(zhì)紊亂或危及生命。三步止瀉法是本課題組小兒推拿治療腹瀉的特效推拿療法，取穴簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，無(wú)副作用，療效明確^［1］。本項(xiàng)目從腸微生態(tài)作用機(jī)制著手，通過(guò)對(duì)血漿檢測(cè)內(nèi)毒素，動(dòng)物胃腸組織形態(tài)學(xué)改變，糞便腸道菌群改變來(lái)了解三步止瀉手法治療小兒腹瀉的可能作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1? 動(dòng)物取健康的日本大耳乳兔70只，體重3.0～3.5 kg，雌雄各半，重量分布均一。（由云南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境：飼養(yǎng)于IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～25℃（日溫差≤3℃）；濕度40%～70%；照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx；噪音≤60dB。

1.1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑? HE 染色試劑盒（Solarbio，生產(chǎn)編號(hào)：G1121）；ELISA 試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，生產(chǎn)編號(hào)：MB-3113A）。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 實(shí)驗(yàn)分組與造模? 將日本大耳乳兔70只隨機(jī)分為7組，每組10 只分別為空白組、模型組、補(bǔ)脾組、摩腹組、推上七節(jié)骨組、三步止瀉手法組，益生菌組。

1.2.2? 造模方法? 采用通過(guò)喂服生大黃粉（與飼料拌食）續(xù)灌服14 d，每天3次。模型標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)腹瀉癥狀，大便性狀變?yōu)橄”慊蛩畼颖悖螖?shù)增多，體重下降，毛色光澤雜亂，神情呆滯，四肢乏力等脾虛的癥狀。

1.2.3? 治療方法? 手法治療組（40只），專(zhuān)人操作，手法、操作步驟及時(shí)間固定。操作方法如下：如三步止瀉手法組10只；三步止瀉法每天治療1次，連續(xù)治療1周，其它手法組同前。對(duì)照組乳兔予喂服益生菌藥物治療，每天1次，治療1周；空白組為模型制作后不予任何治療，予正常飼料喂養(yǎng)觀察。模型組繼續(xù)喂服生大黃粉（與飼料拌食）。

1.2.4? 取材和指標(biāo)檢測(cè)? （1）組織切片：在無(wú)菌的條件下，從動(dòng)物的腸和胃上取下組織塊（厚度不超過(guò)0.5厘米）投入預(yù)先配好的固定液中（10％福爾馬林，Bouin氏固定液等）使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固，通過(guò)脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、封固等步驟制作切片標(biāo)本待觀察分析。（2）血漿：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 min將血清和紅細(xì)胞迅速小心分離。用ELISA法檢測(cè)血漿內(nèi)毒素的表達(dá)水平。（3）糞便：分別收集空白對(duì)照組，模型組，治療組6組，各組兔治療7 d后的新鮮糞便保存在印P管中，做好編號(hào)和記錄，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)糞便樣本總DNA提取、目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化、擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量等方法，分析腸道菌群的多樣性及種類(lèi)。

1.2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的數(shù)值表示以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1? HE觀察兔腸組織和胃組織病理改變

2.1.1? HE觀察兔腸組織病理改變? 正常對(duì)照組兔腸組織可見(jiàn)結(jié)構(gòu)清晰完整，表面絨毛排列規(guī)則且整齊，隱窩結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組可見(jiàn)腸絨毛明顯腫脹、紊亂、脫落，黏膜上皮可見(jiàn)大量散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩深度變淺，固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，且可見(jiàn)明顯疏松、水腫；益生菌組、三步止瀉手法組、補(bǔ)脾組、摩腹組及推上七節(jié)骨組可見(jiàn)腸絨毛腫脹較模型組減輕，腸絨毛形態(tài)較完整，黏膜層少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體明顯增多，水腫減輕，其中摩腹組、推上七骨組、補(bǔ)脾組改善作用稍好于益生菌組及三步止瀉手法組。見(jiàn)圖1。

2.1.2? HE觀察兔胃組織病理改變? 正常組兔胃組織可見(jiàn)胃黏膜光滑完整，無(wú)腺狀結(jié)構(gòu)紊亂或丟失，無(wú)出血或黏膜下水腫，模型組可見(jiàn)胃黏膜胃腺結(jié)構(gòu)紊亂、丟失明顯，局部可見(jiàn)潰瘍?cè)?，大量黏膜下水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和散在出血點(diǎn)；益生菌組、三步止瀉手法組、補(bǔ)脾組、摩腹組及推上七節(jié)骨組可見(jiàn)部分胃腺體紊亂，丟失，但均較模型組減輕，組織間炎細(xì)胞數(shù)量減少，無(wú)明顯浸潤(rùn)，出血有所減少，其中摩腹組、推上七骨組、補(bǔ)脾組改善作用稍好于益生菌組及三步止瀉手法組。見(jiàn)圖2。

2.2? ELISA檢測(cè)腹瀉兔血漿內(nèi)毒素的表達(dá)水平

2.3? 腹瀉兔腸道微生物多樣性結(jié)果

2.3.1? 稀釋性曲線? 稀釋性曲線（Rarefaction Curve）的速率表示：在一定范圍內(nèi)，隨著測(cè)序條數(shù)的加大，若曲線表現(xiàn)為急劇上升則表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)；當(dāng)曲線趨于平緩，則表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨測(cè)序數(shù)量的增加而顯著增多。稀釋曲線可以作為對(duì)各樣本測(cè)序量是否充分的判斷，下圖說(shuō)明樣品序列充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果提示各組中菌群豐富且相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)新菌群的出現(xiàn)和大量菌群的缺失，而模型組的菌群豐富度較其它組的低。見(jiàn)圖 3。

2.3.2? 等級(jí)豐度曲線? 等級(jí)豐度曲線主要用于同時(shí)解釋樣品所含物種的豐富度和均勻度，物種的豐富度由曲線在橫軸上的長(zhǎng)度來(lái)反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻度由曲線的形狀來(lái)反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高，下圖提示腸道菌群物種豐富度較高且均勻分布。見(jiàn)圖4

2.3.3? OTU/ASV分析? OTU即分類(lèi)操作單元，按最樣本序列數(shù)抽平后 OTU 物種分析顯示，測(cè)序數(shù)據(jù)7 組共70個(gè)樣本，菌群序列長(zhǎng)度分布在 839～873bp，使用Usearch軟件對(duì)Reads在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)、獲得OTU。通過(guò)下面OTU圖像得出，與模型組相比，各治療組的菌群序列長(zhǎng)度與正常組接近，說(shuō)明各種治療方法，都可以改善腹瀉兔的菌群，使腹瀉兔的失衡菌群，盡快恢復(fù)。其中三步止瀉手法組、推下七節(jié)骨組、益生菌組在改善菌群失衡方面，效果更明顯。見(jiàn)圖5。

2.3.4? 腸道菌群Alpha多樣性分析? Alpha多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐富度及多樣性。模型組ace指數(shù)明顯降低，摩腹組及三步止瀉手法組ace指數(shù)較模型組顯著升高，其余組較模型組具升高趨勢(shì)；模型組chao指數(shù)降低，摩腹組較模型組chao指數(shù)顯著升高，三步止瀉手法組較模型組具升高趨勢(shì)。提示在提高腹瀉兔腸道菌群的豐富度及多樣性方面，摩腹組及三步止瀉優(yōu)勢(shì)更加明顯。見(jiàn)圖6。

3? 討論

腸道菌群是按一定的比例組合，各種菌群在質(zhì)量和數(shù)量上形成穩(wěn)態(tài)平衡，個(gè)菌群之間相互制約與依賴(lài)，腸道菌群通過(guò)影響能量代謝、炎癥反應(yīng)、促進(jìn)或抑制細(xì)胞的增殖分化，從而對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生了很大的影響，任何導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的因素都可能導(dǎo)致各種胃腸道疾病和腸外疾病。成熟穩(wěn)定的腸道菌群可以協(xié)助人體能量攝取與代謝，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育、成熟和平衡，并且清除宿主腸道內(nèi)的病原體，防止致病菌引起宿主感染。腸道菌群的失調(diào)可以直接影響著機(jī)體的免疫。

有研究表明，腸道微生態(tài)紊亂導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，破壞腸道黏膜正常的屏障功能，進(jìn)而可導(dǎo)致腸道內(nèi)致病菌增殖并釋放內(nèi)毒素，進(jìn)一步破壞腸道黏膜屏障^［1］。腹瀉最易導(dǎo)致腸黏膜的受損，而腸黏膜損傷則會(huì)促使大量炎性促炎因子的釋放，引發(fā)炎性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致組織的炎癥、水腫^［2］。通過(guò)圖1、2發(fā)現(xiàn)，治療后三步止瀉手法組、補(bǔ)脾組、摩腹組及推上七節(jié)骨組、益生菌組能有效的改善組織水腫及胃腸的炎癥情況；說(shuō)明上述治療組，均能降低腹瀉兔胃腸組織損傷，緩解炎癥狀，從而改善腹瀉癥狀。益生菌是治療腹瀉的常用微生態(tài)制劑，其在腸道形成生物菌膜，分泌腸道調(diào)節(jié)因子，起到生物學(xué)屏障保護(hù)作用，改善腹瀉癥狀^［3］。促進(jìn)胃腸道微環(huán)境改變，提升抵御細(xì)菌、病毒等病原體的能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，降低腸黏膜的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷^［4］。兔胃、腸病理切片染色提示，補(bǔ)脾組、摩腹組及推上七節(jié)骨組在改善兔胃腸組織時(shí)效果優(yōu)于益生菌組、三步止瀉手法組，說(shuō)明各手法組在降低組織損傷，緩解炎癥狀，降低腸黏膜的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷的功效等同甚至優(yōu)于益生菌。

通過(guò)表1發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組腹瀉兔血漿內(nèi)毒素的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）；經(jīng)過(guò)手法治療后，與模型組比較，補(bǔ)脾組兔血漿內(nèi)毒素的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，三步止瀉組、補(bǔ)脾組、摩腹組、推上七節(jié)骨組及益生菌組，兔血漿內(nèi)毒素的表達(dá)水平也有不同程度的降低（P>0.05）。結(jié)果提示補(bǔ)脾法在降低兔血漿內(nèi)毒素有良好的效果，而三步止瀉組、補(bǔ)脾組、摩腹組、推上七節(jié)骨組及益生菌組對(duì)降低兔血漿內(nèi)毒素也有一定的作用。

當(dāng)腸道遭受病原微生物侵襲時(shí)發(fā)生發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞損傷及腸道菌群紊亂，從而使內(nèi)毒素升高，本研究表明三步止瀉組、補(bǔ)脾組、摩腹組、推上七節(jié)骨組及益生菌組可降低腸道對(duì)毒素的吸收，增強(qiáng)腸道屏障功能的作用機(jī)制，抑制內(nèi)毒素的釋放而誘發(fā)炎性反應(yīng)，有效避免炎性反應(yīng)擴(kuò)大而加重腸黏膜損傷。

從腸道菌群的OTU/ASV分析、Alpha多樣性分析中，我們可以發(fā)現(xiàn)摩腹組及三步止瀉可糾正菌群紊亂，提高菌群的豐富度及均勻性，使腸道菌群盡快恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)腸道內(nèi)環(huán)境的平衡。豐富度及均勻性的增強(qiáng)能提升腸道黏膜生物屏障的作用，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，抑制致病菌群的生長(zhǎng)，分解有害物質(zhì)，激活免疫系統(tǒng)等，抵御病原體的繼續(xù)入侵，同時(shí)修復(fù)受損的腸黏膜組織，抑制炎性反應(yīng)，從而恢復(fù)腸道固有的健康狀態(tài)。

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（收稿日期：2022-08-25）