郭躍麗，湯麗云，鄭溫潔瑩，陳孟權(quán)，孔萬(wàn)仲，王明山

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因十分復(fù)雜，受遺傳、內(nèi)分泌、免疫、感染及子宮解剖結(jié)構(gòu)等多種因素影響[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，孕婦血栓前狀態(tài)也是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要影響因素[3-4]。血栓前狀態(tài)又稱為易栓癥，是一種血液高凝狀態(tài)，引起全身彌漫性血栓形成，并進(jìn)一步造成孕婦子宮胎盤或臍帶血栓形成、梗死，引發(fā)流產(chǎn)[5-6]。對(duì)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女，臨床推薦進(jìn)行血栓性基因突變篩查，以明確病因，并進(jìn)行針對(duì)性治療。目前研究發(fā)現(xiàn)，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態(tài)性與血漿中凝血因子Ⅻ活性改變密切相關(guān)[7-8]，但具體的機(jī)制尚不明確。本研究分析復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態(tài)性特點(diǎn)，為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床基因診斷提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2022 年1—6 月溫州市中醫(yī)院收治的138 例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者（觀察組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；（2）連續(xù)3 次及以上妊娠28 周前發(fā)生自然流產(chǎn)；（3）進(jìn)行凝血因子Ⅻ基因Exon1 測(cè)序；（4）病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）生殖道病原體感染；（2）子宮結(jié)構(gòu)異常，如先天性子宮畸形、子宮頸機(jī)能不全、宮腔粘連及子宮肌瘤等；（3）內(nèi)分泌疾病，如多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能疾病及黃體功能不全等；（4）夫妻任何一方染色體異常；（5）自身免疫抗體檢查異常。同期選取69 例妊娠史良好的健康女性（對(duì)照組），納入標(biāo)準(zhǔn)：至少有1 次成功分娩，無(wú)流產(chǎn)史、早產(chǎn)史、產(chǎn)后出血史及妊娠合并癥史。

觀察組年齡25 ～41 歲，平均（31.3±3.5）歲；孕前 體 質(zhì) 量 指 數(shù) 19.35 ～ 32.86 kg/m2，平 均（26.10±2.04）kg/m2；文化程度：初中24例，高中49例，大專及以上65 例。對(duì)照組年齡23 ～38 歲，平均（30.5±3.2）歲；孕前體質(zhì)量指數(shù)18.96 ～31.05 kg/m2，平均（25.45±1.88）kg/m2；文化程度：初中10 例，高中24 例，大專及以上35 例。兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。本研究經(jīng)溫州市中醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 方法 所有受檢者均采集空腹靜脈血，一支采血管為乙二胺四乙酸抗凝，用于提取單個(gè)核細(xì)胞D NA 分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態(tài)性；另一支采血管為0.109 mol/L 枸櫞酸鈉抗凝，用于分離血漿檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）及D-二聚體。

1.2.1 凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態(tài)性分析 使用苯酚-氯仿法提取血液中的單個(gè)核細(xì)胞DNA，干燥DNA 沉淀物置于-20 ℃保存待檢。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增技術(shù)分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T，PCR 引物使用Primer Premier 5 軟件 設(shè) 計(jì)，上 游引 物：5’-CCA GTCCCACTATCTAGAAAAG-3’，下 游 引 物：5’-CTATCAC AGCCATGAGCCAT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度594bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸10 min，總循環(huán)30 個(gè)，4 ℃冷卻結(jié)束。檢測(cè)儀器為伯樂CFX Connect Real-Time 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)BioRad 公司）。使用Chromas 軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank 基因庫(kù)中公布的凝血因子Ⅻ基因序列比對(duì)，分析基因型和等位基因型。

1.2.2 凝血指標(biāo) 采用法國(guó)Stago STA-R 全自動(dòng)血凝儀（配套試劑由法國(guó)STAGO 公司提供）及凝固法檢測(cè)PT、APTT 和FIB，采用SEKISUI CP-3000 全自動(dòng)血凝儀（配套試劑由SEKISUI 公司提供）及免疫比濁法檢測(cè)D-二聚體。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡對(duì)樣本的群體代表性進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 分布特點(diǎn)兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（均P ＞0.05），具有群體代表性。在基因型分布上，兩組CC、CT、TT 基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=7.888，P ＜0.05），觀察組CT基因型頻率高于對(duì)照組（2=4.696，P ＜0.05），TT 基因型頻率低于對(duì)照組（2=7.749，P＜0.05），而兩組CT 基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=1.660，P ＞0.05），見表1。在等位基因分布上，觀察組的C 等位基因頻率高于對(duì)照組（P ＜0.05），T 等位基因頻率低于對(duì)照組（P ＜0.05），見表2。

表1 兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 基因型分布 例（%）

表2 兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 等位基因分布 例（%）

2.2 兩組不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比較兩組凝血因子Ⅻ活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），且兩組CC、CT、TT 基因型的凝血因子Ⅻ活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。同組內(nèi)3 種基因型的凝血因子Ⅻ活性比較，CC 基因型凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型，且CT基因型凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型（均P ＜0.05），見表3。

表3 兩組不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比較 %

2.3 觀察組不同基因型患者的凝血指標(biāo)及凝血因子Ⅻ活性比較 觀察組CC 基因型患者的APTT水平低于CT 和TT 基因型患者，且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者（均P ＜0.05）。觀察組CC、CT、TT 基因型的PT、FIB、D-二聚體水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見表4。

表4 觀察組不同基因型患者的凝血指標(biāo)及凝血因子Ⅻ活性比較

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)一直是婦產(chǎn)科研究的重點(diǎn)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦具有血栓形成傾向，纖溶功能降低而凝血功能增強(qiáng)，血液呈高凝狀態(tài)[10-11]。凝血因子Ⅻ是一種由肝臟合成的絲氨酸蛋白酶，具有促進(jìn)纖溶、抗血栓的作用[12-13]。目前分子基因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能與凝血因子Ⅻ基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平升高相關(guān)[14]。也有研究表示，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 表達(dá)與凝血因子Ⅻ基因的翻譯效率密切相關(guān)，進(jìn)而影響凝血因子Ⅻ在血漿中的表達(dá)水平和活性狀態(tài)[15]。

本研究分析復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態(tài)性特點(diǎn)，結(jié)果顯示觀察組的CT基因型頻率高于對(duì)照組，觀察組的TT 基因型頻率低于對(duì)照組；且觀察組的C 等位基因頻率高于對(duì)照組，T 等位基因頻率低于對(duì)照組（均P ＜0.05）。上述結(jié)果說明凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 為CT 基因型可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。國(guó)外有關(guān)凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態(tài)性的研究也證實(shí)CT 基因型可能是孕齡期婦女發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要發(fā)病原因[16]。本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩組人群的凝血因子Ⅻ活性并無(wú)明顯差異，但深入對(duì)比不同基因型的凝血因子Ⅻ活性，可以發(fā)現(xiàn)CC 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型，并且CT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型，TT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性最低。這可能是因?yàn)槟蜃英駿xon1-46C/T 的T 等位基因發(fā)生突變，可使原始的起始密碼子死亡堿基重新配對(duì)，形成新的起始密碼子，并使下游的終止密碼子也發(fā)生改變，使得凝血因子Ⅻ基因翻譯提前結(jié)束，故攜帶C 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明顯上升，而T 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明顯下降。另外，本研究比較不同基因型的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女的血漿凝血指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，CC 基因型患者的APTT 水平低于CT和TT 基因型患者，且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者，即CC 基因型患者的APTT水平最低，而TT 基因型患者的APTT 水平最高。這說明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女凝血因子Ⅻ活性越高與APTT 縮短存在關(guān)聯(lián)。目前已有研究證實(shí)APTT與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)密切相關(guān)，APTT 反映內(nèi)源性途徑凝血因子的缺陷，APTT 縮短，血液處于高凝狀態(tài)，提示凝血亢進(jìn)，會(huì)使子宮局部組織形成微血栓，造成胚胎缺血、缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)。胚胎死亡后發(fā)生自溶，激活內(nèi)源性凝血途徑，進(jìn)而影響凝血功能。另外，妊娠期孕婦本身會(huì)出現(xiàn)生理性的血液高凝狀態(tài)，加上凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 遺傳病變，APTT 縮短，凝血因子Ⅻ活性增高，易發(fā)生血栓形成，梗塞子宮-胎盤，影響血流循環(huán)，胎兒在子宮內(nèi)缺血缺氧，未得到及時(shí)供氧，造成胎兒死亡，引起流產(chǎn)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)其他的凝血指標(biāo)如PT、FIB、D-二聚體水平，不同基因型患者無(wú)明顯差異，這可能是因?yàn)锳PTT是反映內(nèi)源性凝血途徑的指標(biāo)，臨床常用于測(cè)定內(nèi)源性途徑的凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ等[18]。

綜上所述，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 為CT 基因型可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)，T 等位基因突變?yōu)镃，引起凝血因子Ⅻ活性增高，APTT 縮短，導(dǎo)致血液高凝狀態(tài)和血栓形成，梗塞子宮-胎盤，誘發(fā)流產(chǎn)。對(duì)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女，臨床可檢測(cè)凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態(tài)性，進(jìn)行基因診斷，明確病因，為妊娠保胎治療提供參考。