湯瑞玲,范立青

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室,湖北 咸寧 437100;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖與干細(xì)胞工程研究所)

隨著全球進入后工業(yè)化時代,生育年齡推后,以及二胎政策的施行,高齡父親(advanced paternal age,APA)的生殖狀態(tài)及其對子代健康的影響已經(jīng)成為全球研究熱點。臨床人群研究顯示[1-3],高齡父親子代發(fā)生先天畸形、兒童腫瘤、智力低下、精神疾病如孤獨癥和精神分裂癥,以及不良孕產(chǎn)史的風(fēng)險大大增加。高齡雄性睪丸中精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cell,SSC)發(fā)生的新發(fā)基因突變和表觀遺傳異常均可通過精子傳遞,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的子代健康問題,稱為父親年齡效應(yīng)(paternal age effects,PAEs)[4-5];父親年齡超過35歲導(dǎo)致PAEs疾病風(fēng)險呈指數(shù)級增加;小鼠睪丸細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示8月齡SSCs即開始表達衰老相關(guān)基因[6-7]。目前SSC衰老研究集中于新生期和性成熟期小鼠來源的SSC體外長期培養(yǎng)造成的遺傳和表觀遺傳改變[8-9],直接來源于高齡小鼠睪丸SSC體外培養(yǎng)體系尚未見報道。本研究擬建立8月齡小鼠睪丸來源SSCs體外培養(yǎng)體系,可以完整保存SSCs發(fā)生衰老改變時的遺傳、表觀遺傳、基因表達特征,將為闡明高齡SSC衰老啟動時的遺傳和表觀遺傳調(diào)控機制提供有力的研究工具。

1 材料與方法

1.1 動物

6～8周齡成年雄性昆明白小鼠購自湖南史萊克景達有限責(zé)任公司,飼養(yǎng)于中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程中心實驗動物房,用于實驗室正常小鼠繁殖配種,12h光照,12h黑暗,水食自由,所有實驗動物處理均遵循《實驗動物管理和使用指南》。5只6月齡小鼠停止配種后繼續(xù)飼養(yǎng)至8月齡用于本實驗。

1.2 試劑和儀器

StemPro-34 SFM培養(yǎng)基、高糖DMEM、100×MEM維生素、100xNEAA、100×丙酮酸鈉、100×ITS、FBS購自美國Gibco公司。Recombinant mouse GDNF購自美國Sigma公司、Recombinant mouse GDNF GFRa-1購自Sino Biological公司、Recombinant mouse bFGF、Recombinant mouse EGF和Recombinant mouse LIF均購于美國R&D公司。腐胺、D(+)葡萄糖、乳酸、維生素C、d-生物素、β-巰基乙醇購自Sigma公司。膠原酶IV、中性蛋白酶和0.05%胰酶/EDTA購自美國Gibco公司,透明質(zhì)酸酶和DNA酶購自美國Sigma公司,0.1%明膠購自美國Millipore公司,BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自美國Invitrogen公司,兔抗小鼠ThY-1多克隆抗體、兔抗小鼠PLZF多克隆抗體、兔抗小鼠c-KIT多克隆抗體、鼠抗OCT-4單克隆抗體均購自美國Santa Cruze公司,兔抗SCP3購自Abcam公司,驢血清、alexafluor 488標(biāo)記驢抗兔二抗、alexafluor 488標(biāo)記驢抗小鼠二抗購自美國Invitrogen公司,SP免疫組化試劑盒購自中國福建邁新公司。Trizol購自美國Invitrogen公司,RevertAid First Strand cDNA SyntHEsis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司,2×PCR Premix Taq購自日本Takara公司,江豐數(shù)字切片掃描儀購自中國江豐公司,體視光學(xué)顯微鏡購自德國蔡司公司,倒置相差熒光顯微鏡購自日本尼康公司,水套式二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高齡小鼠睪丸切片HE染色和IHC檢測PLZF表達

8周齡和8月齡昆明白小鼠脫頸致死,睪丸用Bouin固定液固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,切片厚度5μm;免疫組化(immunohisto-chemistry,IHC)染色:常規(guī)脫蠟至水,100mmol/L甘氨酸脫甲醛,3%過氧化氫消除內(nèi)源性生物素,正常羊血清封閉,1∶200稀釋兔抗PLZF抗體孵育過夜,生物素標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育10min,鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶室溫孵育10min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹脂封片。蘇木素伊紅(haematoxylin-eosin,HE)染色:常規(guī)脫蠟至水,蘇木素染色5min,0.1%鹽酸酒精分色5sec,自來水返藍20min,醇溶伊紅染色2min,中性樹脂封片。HE和IHC切片使用江豐數(shù)字切片掃描儀掃描,KF-Viewr閱片軟件截屏拍照。

1.3.2 三步酶消化法消化高齡小鼠睪丸獲取單細(xì)胞懸液

(1)配制消化酶。消化酶Ⅰ:6mL高糖DMEM加入5mg/mL膠原酶IV、2mg/mL透明質(zhì)酸酶;消化酶Ⅱ:6mL高糖DMEM加入2mg/mL膠原酶IV、2mg/mL透明質(zhì)酸酶、2mg/mL中性蛋白酶、100μg/mL Dnase I酶;消化酶Ⅲ:6mL 0.05%胰酶/EDTA加入100μg/mL Dnase I酶,0.22μm無菌過濾器4℃保存過濾備用。

(2)三步酶消化。脫頸處死8月齡雄性昆明白小鼠1只,取出雙側(cè)睪丸,去除睪丸白膜,在體式顯微鏡下用鐘表鑷分離精曲小管之間的間質(zhì)組織和血管,10mL PBS洗滌3次,將松散完整精曲小管移到15mL離心管中,加入6mL消化酶Ⅰ進行第一步消化:37℃水浴,30～40次/min震蕩消化10min,加入6mL高糖DMEM和2%FBS終止消化,靜置沉降5min共3次,吸棄上清中的間質(zhì)組織和細(xì)胞直至洗滌液清亮,5mL吸管輕輕吹吸精曲小管200次,800rpm離心2min。收集上清單細(xì)胞懸液,管底沉淀的精曲小管片段加入6mL消化酶Ⅱ進行第二步消化:37℃水浴,100次/min震蕩消化20min,加入600μL FBS終止反應(yīng),5mL吸管輕輕吹吸200次幫助精曲小管和細(xì)胞團塊解離,800rpm離心2min。收集上清單細(xì)胞懸液,10mL不含鈣鎂的DPBS洗滌管底的精曲小管殘跡和細(xì)胞團塊,1500rpm離心5min,管底沉淀的細(xì)胞團塊加入5mL消化酶Ⅲ進行第三步消化:37℃水浴,100次/min震蕩消化5min,加入600μL FBS終止消化,5mL吸管輕輕吹吸200次,直至細(xì)胞團塊完全解離,將第一、二、三步消化中收集的全部細(xì)胞懸液用200目無菌篩網(wǎng)過濾,1500rpm離心5min,10mL高糖DMEM和10%FBS洗滌,10mL含15%FBS的精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸,細(xì)胞計數(shù)5.4×106個細(xì)胞,臺盼藍染色檢測細(xì)胞活性達95%以上。將細(xì)胞按9×105/cm2的密度接種到0.1%明膠預(yù)包被的6個60mm皿中,37℃ 5%CO2差異貼壁培養(yǎng)72h。

1.3.3 高齡小鼠精原干細(xì)胞原代培養(yǎng)

(1)配制小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液。StemPro-34 SFM加入StemPro專用補充物作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,逐次加入1×MEM維生素、1×NEAA、1×丙酮酸鈉、1×ITS、60μmol/L腐胺、6mg/mL D(+)葡萄糖、1μL/mL乳酸、100μmol/L維生素C、10μg/mL d-生物素、20ng/mL GDNF,400ng/mL GFRa1、20ng/mL EGF,10ng/mL bFGF,10ng/mL LIF、50μmol/L β-巰基乙醇,根據(jù)需要的濃度最后加入胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),0.22μm無菌過濾器過濾4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)CF-1小鼠來源胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層和條件培養(yǎng)基制備。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblasts,MEF)培養(yǎng)液由高糖DMEM添加10%FBS組成;液氮罐取出凍存的P2代CF-1小鼠來源MEF,解凍后加入MEF培養(yǎng)液10mL,接種到0.1%明膠預(yù)包被的100mm大皿,常規(guī)換液培養(yǎng)48h,以1∶4比例傳代,P3代換液常規(guī)培養(yǎng)3～4d至細(xì)胞鋪滿皿底,PBS洗滌3次,加入配有10μg/mL絲裂霉素C的MEF培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)2.5h。洗滌、消化、離心收集絲裂霉素C處理的P3代MEF,按3×106/管加入凍存液放入液氮中凍存,凍存液由9μL FBS和1μL DMSO組成。制備條件培養(yǎng)基時按1.5×106/9.5cm2接種密度鋪入6孔板中的1孔,加入2mL精原干細(xì)胞培養(yǎng)液,每隔24h收集條件培養(yǎng)基并更換新鮮精原干細(xì)胞培養(yǎng)液,7～10d后觀察飼養(yǎng)層細(xì)胞狀態(tài),如果不佳即丟棄。

(3)高齡小鼠精原干細(xì)胞原代培養(yǎng)。差異貼壁培養(yǎng)72h后,倒置顯微鏡下見5個60mm中皿貼壁體細(xì)胞約占皿底2/3,生殖細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中,少量細(xì)胞相互積聚形成細(xì)胞團塊,收集上清生殖細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)2.2×106,以1.1×106接入鋪有密度為7.5×105/9.5cm2MEF飼養(yǎng)層的6孔板中2孔,加入2mL含10%FBS的精原干細(xì)胞培養(yǎng)液,37℃ 5%CO2培養(yǎng),翌日觀察到絕大部分生殖細(xì)胞已貼壁,僅少許懸浮細(xì)胞,隔日換液,每個培養(yǎng)孔加入MEF條件培養(yǎng)液和新鮮精原干細(xì)胞培養(yǎng)液各1mL,記為P0代。

(4)高齡小鼠精原干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。P0代細(xì)胞培養(yǎng)10d后,倒置顯微鏡下見6孔板2個孔的生殖細(xì)胞大量死亡,漂在培養(yǎng)液中,MEF飼養(yǎng)層上剩余的精原細(xì)胞堆積成大量小細(xì)胞團塊。每孔加入1mg/mL中性蛋白酶+1mg/mL膠原酶Ⅳ,37℃消化20min,輕輕吹吸皿底,至飼養(yǎng)層上的生殖細(xì)胞團塊完全脫落,皿底僅剩余部分飼養(yǎng)層細(xì)胞,等體積含有5%FBS的DMEM終止反應(yīng),1500rpm離心5min,按2∶2傳代,接入鋪有密度為5×105/9.5cm2MEF飼養(yǎng)層的6孔板中2孔,37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng),記為P1代;第10d觀察到精原細(xì)胞呈葡萄串狀聚集,可見多個包含20～50個細(xì)胞的精原干細(xì)胞克隆形成,1mg/mL中性蛋白酶+1mg/mL膠原酶Ⅳ消化傳代,傳代比例2∶3;從P1到P5代高齡小鼠SSC克隆增殖比較緩慢,傳代間隔為7～10d,傳代比例為2∶2或2∶3,在此期間保持精原干細(xì)胞培養(yǎng)液中15%FBS的濃度、CF-1來源MEF飼養(yǎng)層鋪皿密度5×105/9.5cm2,如果出現(xiàn)細(xì)胞2～3d不增殖時可加入新鮮解凍的MEF增加飼養(yǎng)層密度,或者加入MEF條件培養(yǎng)基,以促進高齡小鼠SSC克隆增殖;P6代以后高齡小鼠SSC克隆體外增殖處于穩(wěn)定狀態(tài),傳代間隔縮短至5～7d,傳代比例為1∶3,P6代開始將精原干細(xì)胞培養(yǎng)液中FBS以每周下降5%的梯度逐漸調(diào)整至5%,1周后再調(diào)整至1%,飼養(yǎng)層接種密度調(diào)整至2.5×105/9.5cm2,體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng)6個月,共傳13代,在傳代和實驗需要之外,將6孔板中每孔細(xì)胞加入由9μL FBS和1μL DMSO配制的凍存液,放入1個凍存管,置入液氮中保存。

1.3.4 高齡小鼠精原干細(xì)胞克隆的干性、精原干細(xì)胞標(biāo)記物檢測

(1)AKP染色檢測SSC克隆的堿性磷酸酶活性。P10代SSC接種到4個孔內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)3d,第4d進行SSC克隆的AKP染色:吸棄培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛200μL室溫固定15min,雙蒸水200μL洗3次,每次10min,按照使用說明書配制BCIP/NBT染色液,加200μL染色液入培養(yǎng)孔,室溫孵育10～15min,吸棄染色液,用雙蒸水洗2次各2min,倒置顯微鏡觀察SSC克隆顏色變化,如果呈淺藍色可繼續(xù)加入染色液再染15～30min,雙蒸水洗滌3次,SSC克隆細(xì)胞呈深藍色時拍照。

(2)免疫熒光檢測SSC克隆的精原細(xì)胞標(biāo)記物的蛋白表達情況。P10代SSC接種到4個孔內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)3d,第4d進行SSC克隆的免疫熒光染色,吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液,400μL PBS洗滌3次,4%多聚甲醛200μL室溫固定30min,400μL PBS洗3次各10min,10%正常驢血清200μL室溫封閉30min,吸棄驢血清,分別加100μL一抗:ThY-1和cKIT兔抗多克隆抗體、OCT-4鼠抗單克隆抗體用10%驢血清按1∶50濃度稀釋,SCP3、PLZF兔抗多克隆抗體用含有0.5% TritonX-100的10%驢血清按1∶100濃度稀釋,陰性對照孔留置封閉液,4℃冰箱孵育過夜,400μL PBS洗3次各10min,加入1∶1000稀釋的alexafluor 488標(biāo)記驢抗兔二抗100μL室溫避光孵育1h,400μL PBS洗3次各10min,1∶1000濃度DAPI復(fù)染細(xì)胞核3 min,400μL PBS洗滌1次5 min,倒置熒光顯微鏡觀察SSC克隆熒光染色結(jié)果并拍照。

(3)RT-PCR檢測SSC克隆的精原干細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達情況。6孔板培養(yǎng)孔用4℃預(yù)冷PBS洗滌2次,1mL Trizol裂解液輕輕吹吸,移入1.5mL無核酶污染EP管內(nèi),冰上裂解10min,加0.2mL氯仿,按照Trizol使用說明書抽提RNA,溶于20μL DEPC水,測OD260/OD280,計算RNA濃度和純度,-80℃凍存;取1μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書冰上配制20μL反應(yīng)體系獲得cDNA,RT反應(yīng)程序為:42℃孵育60min;70℃孵育5min;4℃,+∞。取1μL cDNA為模板配制20μL PCR反應(yīng)體系,程序如下:95℃預(yù)變性5min(95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s)×35循環(huán),72℃終延伸5min,4℃,+∞。基因引物序列見表1。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖膠100V電泳15min分離,Gel Dox XR凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 RT-PCR檢測mRNA表達的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 高齡小鼠睪丸內(nèi)精曲小管出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變

8月齡高齡小鼠睪丸大體形態(tài)與8周齡正常小鼠相似(圖1a),HE染色觀察到8月齡高齡小鼠睪丸出現(xiàn)精子異常的精曲小管:部分精曲小管內(nèi)出現(xiàn)各級生精細(xì)胞排列紊亂,偶見精曲小管僅保留Sertoli細(xì)胞和精原細(xì)胞而其他生精細(xì)胞均缺失(圖1b);IHC進行PLZF檢測顯示8周齡正常對照小鼠PLZFhigh表達于A型未分化精原細(xì)胞(a typeundifferentiated spermatogonia,Aun),PLZFlow表達于A型分化精原細(xì)胞(a type differentiating spermatogonia,Adiff),不表達于中間型分化精原細(xì)胞(intermediate type differentiated spermatogonia)(圖1c),8月齡高齡小鼠生精正常和生精異常精曲小管中均存在PLZFhighAun和PLZFlowAdiff精原細(xì)胞,同時PLZFPOS還表達于In分化精原細(xì)胞(圖1d)。

紅色三角:8周齡整體睪丸;藍色三角:8月齡整體睪丸;紅色箭頭:僅剩余基底膜側(cè)生精細(xì)胞的精曲小管;藍色箭頭:生精細(xì)胞排列紊亂的精曲小管;紅色無尾箭頭:精原細(xì)胞;藍色無尾箭頭:Sertoli細(xì)胞;紅色星號:PLZFhighA型未分化精原細(xì)胞;藍色星號:PLZFlowA型分化精原細(xì)胞;紫色星號:PLZFPOS中間型In分化精原細(xì)胞圖1 高齡小鼠的大體形態(tài)、HE染色和IHC檢測(Bar =100μm)

2.2 高齡小鼠單個整體睪丸經(jīng)過間質(zhì)預(yù)處理和三步酶消化解離成單細(xì)胞懸液

高齡小鼠難以成批獲取,我們只能進行單只高齡小鼠原代培養(yǎng),為盡可能多的獲取精原干細(xì)胞,我們需要優(yōu)化消化過程。在去除白膜后,消化前先用鐘表鑷機械分離小鼠睪丸間質(zhì)中的血管和結(jié)締組織,減少第一步消化時間,同時盡可能多的去除間質(zhì)組織和成纖維細(xì)胞。分離液中充滿離散的間質(zhì)組織團塊,未完全分離的血管殘端仍然附著在精曲小管上(圖2a);充分洗滌預(yù)處理的睪丸組織上清液中可見大量的間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)組織團塊(圖2b);第一步膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化后,可見大量間質(zhì)組織從精曲小管壁完全脫落(圖2c);再次充分洗滌丟棄間質(zhì)組織和細(xì)胞之后,洗滌液中可見完整脫落的間質(zhì)血管(圖2d);洗滌后保留的精曲小管管壁光滑,懸浮液中殘存極少量間質(zhì)細(xì)胞(圖2e);將洗滌后收集的精曲小管反復(fù)吹吸之后,大量精曲小管斷裂崩解(圖2f);第二步膠原酶、透明質(zhì)酸酶和中性蛋白酶組合消化和吸管反復(fù)吹吸后,精曲小管完全解體,僅剩余少量未消化的細(xì)胞團塊(圖2g);第三步胰酶消化和吸管反復(fù)吹吸后,精曲小管基本完全解離,尚有極少量的小細(xì)胞團塊(圖2h);200目篩網(wǎng)過濾掉細(xì)胞團塊,至此高齡小鼠睪丸組織完全解離成單細(xì)胞懸液(圖2i)。

紅色箭頭:精曲小管;藍色箭頭:間質(zhì)血管;紫色箭頭:間質(zhì)組織;黑色箭頭:細(xì)胞團塊圖2 高齡小鼠消化前預(yù)處理精曲小管形態(tài)改變過程(Bar=100μm)

2.3 高齡小鼠的72h差異貼壁富集和原代培養(yǎng)

將消化解離的高齡小鼠睪丸單細(xì)胞懸液接種到0.1%明膠包被的6個60mm中皿,每隔24h觀察貼壁的體細(xì)胞密度,72h后貼附在皿底的體細(xì)胞約占皿底面積的1/2(圖3a),收集懸浮的生殖細(xì)胞并洗滌培養(yǎng)皿,可見皿底稀疏的貼壁體細(xì)胞(圖3b),將絲裂霉素C處理的MEF細(xì)胞按7.5×105/21cm2密度鋪皿作為高齡小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞(圖3c),將收集的生殖細(xì)胞以1.1×106/21cm2密度接種到飼養(yǎng)層上進行原代培養(yǎng),記為P0代(圖3d)。P0D10d可見生殖細(xì)胞集聚成葡萄串狀貼附在MEF飼養(yǎng)層上面,其中有少量有絲分裂旺盛的SSC來源子細(xì)胞緊密結(jié)合形成直徑<50μm小克隆(圖3e);P1D10d可見葡萄串狀的生殖細(xì)胞團塊數(shù)量減少,進入有絲分裂增殖的SSC數(shù)量增加,直徑增大,最大直徑約100μm(圖3f);P2D10日SSC克隆數(shù)量和克隆直徑進一步增加,最大SSC克隆直徑約200μm,僅剩余極少量未進入增殖狀態(tài)的原代生殖細(xì)胞,這些原代生殖細(xì)胞核直徑仍保持在10μm左右(圖3g);P3D10日可見SSC克隆數(shù)量和克隆直徑繼續(xù)增加,最大SSC克隆直徑約500μm,未觀察到原代生殖細(xì)胞(圖3h);P5D10可見SSC克隆處于穩(wěn)定增殖狀態(tài),細(xì)胞狀態(tài)良好(圖3i);P6代開始逐漸降低精原干細(xì)胞培養(yǎng)液中血清濃度和MEF飼養(yǎng)層鋪皿密度,P8D7(圖3j)P10D7(圖3k)和P13D5(圖3l)傳代過程中隨著殘留的老化MEF凋亡,培養(yǎng)皿中MEF密度逐漸降低,SSC克隆仍處于穩(wěn)定增殖狀態(tài),克隆細(xì)胞狀態(tài)良好。

紅色箭頭:葡萄串狀生殖細(xì)胞團塊;藍色箭頭:SSC克隆;綠色箭頭:未進入增殖狀態(tài)的原代生殖細(xì)胞圖3 高齡小鼠睪丸消化細(xì)胞中SSC差異貼壁富集、原代培養(yǎng)SSC克隆形成和傳代培養(yǎng)(Bar=100μm)

2.4 體外培養(yǎng)高齡小鼠SSC克隆具有堿性磷酸酶活性,表達精原干細(xì)胞標(biāo)記物

免疫熒光檢測顯示高齡小鼠SSC克隆表達ThY-1、PLZF、OCT-4 3種未分化精原細(xì)胞標(biāo)記蛋白(圖4a-i),不表達c-KIT分化精原細(xì)胞蛋白(圖4j-l)和SCP3精母細(xì)胞蛋白(圖4m-o);AKP染色顯示高齡小鼠SSC克隆表達堿性磷酸酶(圖4s);RT-PCR結(jié)果顯示高齡小鼠SSC克隆表達未分化精原細(xì)胞標(biāo)記物Gfra1、Oct-4、Ssea-1 mRNA,也表達分化精原細(xì)胞標(biāo)記物c-Kit mRNA和精母細(xì)胞標(biāo)記物Scp3 mRNA(圖4t)。

a-r:免疫熒光,第一列代表SSC克隆抗體熒光染色,第二列代表SSC克隆DAPI復(fù)染,第三列代表SSC克隆明場形態(tài),Negative代表陰性對照;s:AKP染色;t:RT-PCR,Primer代表陰性對照圖4 免疫熒光、AKP染色和RT-PCR檢測高齡小鼠SSC克隆的干細(xì)胞活性和精原干細(xì)胞標(biāo)記物在蛋白和mRNA水平的表達情況(Bar=100μm)

3 討 論

3.1 高齡小鼠睪丸微環(huán)境更有利于A型精原細(xì)胞增殖與存活

在正常睪丸發(fā)育過程中,PLZF高表達于Aun而弱表達于Adiff[10]。本研究IHC顯示在高齡小鼠睪丸中PLZF除了Aun與Adiff精原細(xì)胞之外,還表達于In分化精原細(xì)胞,提示高齡小鼠睪丸微環(huán)境可能促進cKITpos分化精原細(xì)胞的去分化,以及PLZFPOS的Aun和Adiff精原細(xì)胞存活和增殖,與文獻報道結(jié)果一致[11]。文獻研究結(jié)果表明,高齡小鼠睪丸微環(huán)境發(fā)生氧化應(yīng)激改變[12],導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高,ROS激活Myc基因表達,促進精原細(xì)胞增殖而使精曲小管內(nèi)其余生精細(xì)胞凋亡[13-14]。

3.2 通過優(yōu)化睪丸消化分離富集步驟,最大程度獲取單只高齡小鼠睪丸來源精曲小管和有活力的單細(xì)胞

8月齡高齡小鼠成批獲取較困難,本課題組選擇每次進行單只高齡小鼠的睪丸細(xì)胞消化富集和原代培養(yǎng)。根據(jù)前期經(jīng)驗,第一步消化時剪碎的精曲小管片段和消化下來的間質(zhì)細(xì)胞團塊比重相似,造成靜置沉降時精曲小管片段與間質(zhì)細(xì)胞團塊都沉降在管底,導(dǎo)致消化的單細(xì)胞中存在間質(zhì)成纖維細(xì)胞污染,需要經(jīng)歷多輪差異貼壁甚至多次傳代才能夠去除[15]。在本研究中,我們通過消化前機械去除間質(zhì)組織和血管,第一步消化分離殘留間質(zhì)組織同時保持精曲小管的完整性,提高靜置沉降時精曲小管與間質(zhì)的比重差,保證沉降的精曲小管純度,減少間質(zhì)成纖維細(xì)胞對SSC原代培養(yǎng)過程的污染[16-17]。

3.3 高齡小鼠來源SSC體外培養(yǎng)需要高密度飼養(yǎng)層、條件培養(yǎng)基和高濃度生長因子及胎牛血清支持

精原干細(xì)胞原代培養(yǎng)克隆形成與增殖能力和飼養(yǎng)層種類、飼養(yǎng)層密度、生長因子種類、生長因子濃度、血清濃度均有密切關(guān)系[18-19]。本課題組在單只高齡小鼠來源精原干細(xì)胞原代培養(yǎng)進行了優(yōu)化改進:采用CF-1小鼠來源胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblasts,MEF)作為飼養(yǎng)層[18,20],提高MEF飼養(yǎng)層密度,填加條件培養(yǎng)基,提高胎牛血清與生長因子濃度,加入GDNF受體GFRa1可溶性成分,成功促進高齡小鼠SSC原代培養(yǎng)克隆形成并增殖傳代保持長達6月。

3.4 高齡SSC克隆是包含未分化和分化精原細(xì)胞的異質(zhì)性克隆

高齡小鼠體外培養(yǎng)的SSC克隆在逐漸降低胎牛血清濃度和飼養(yǎng)層密度后,可維持長期穩(wěn)定增殖,具有干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性,免疫熒光染色顯示這些SSC克隆表達ThY-1、PLZF和OCT-4等A型精原細(xì)胞標(biāo)記蛋白,不表達cKIT分化精原細(xì)胞和SCP3精母細(xì)胞標(biāo)記蛋白;但是在mRNA水平,這些高齡小鼠來源SSC克隆除了表達Gfra1、Ssca-1、Oct-4等未分化精原細(xì)胞標(biāo)記物之外,也表達c-kit分化精原細(xì)胞和Scp3精母細(xì)胞標(biāo)記物;研究顯示[21-22],在精原細(xì)胞分化以及減數(shù)分裂啟動過程中主要涉及到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制,提示本研究中單只高齡小鼠來源SSC克隆是由未分化、分化精原細(xì)胞構(gòu)成的異質(zhì)性克隆,與文獻報道結(jié)果相符[23]。

總之,本研究通過在第一步消化中有效清除睪丸成纖維細(xì)胞,提高精原細(xì)胞接種密度、優(yōu)化飼養(yǎng)層和生長因子、FBS組合等措施,成功建立單只8月齡昆明白來源高齡小鼠的SSC體外長期培養(yǎng)體系,該SSC克隆可以長期穩(wěn)定傳代,具有干細(xì)胞活性,是一株同時表達未分化和分化精原細(xì)胞標(biāo)記物的異質(zhì)性原代培養(yǎng)SSC細(xì)胞系。后續(xù)還需要進行SSC克隆同種異體移植進行功能表型鑒定,SSC轉(zhuǎn)錄組、表觀組學(xué)檢測將有利于我們深入理解高齡小鼠來源SSC的基因表達和表觀調(diào)控情況。本研究為高齡男性SSC的體外功能表型和分子機制研究提供一種新的細(xì)胞工具。