蘇紅霞,蔡林康,劉濱磊,李炎坤**

(1.湖北科技學院藥學院鄂南特色中藥湖北省工程研究中心,湖北 咸寧 437100;2.武漢濱會生物科技股份有限公司;3.湖北工業(yè)大學)

結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,預計到2030年,CRC的全球負擔將增加60%,新病例達到并超過220萬,死亡人數(shù)達到110萬例[1]。機體免疫系統(tǒng)不能有效識別腫瘤抗原是腫瘤發(fā)生的主要原因之一。近年來隨著腫瘤免疫逃避機制的進一步明確,人們不斷探索靶向腫瘤免疫逃避的干預措施,重新調(diào)動免疫應答,吸引免疫細胞進入腫瘤組織讓“冷腫瘤”變?yōu)椤盁崮[瘤”,恢復機體正常的抗腫瘤免疫反應。

細胞因子是一種控制免疫細胞的發(fā)育,由免疫細胞介導的多效性多肽,可以對抗腫瘤免疫抑制,激活腫瘤免疫細胞[2]。已有研究表明[3],粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(ganloye-macrophage colory simulating fetor,GM-CSF)對結(jié)直腸腫瘤細胞生長有直接抑制的作用。GM-CSF通過誘導細胞周期的G0/G1期停滯來抑制惡性腫瘤細胞的增殖,并促進它們的分化[4]。然而,GM-CSF在體內(nèi)抑瘤的效果仍有待探討。

在腫瘤微環(huán)境內(nèi)高效表達細胞因子需要良好的載體。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高,但易受免疫原性的影響,引發(fā)嚴重的免疫反應和炎癥反應,靶向性較差,且成本較高。腺病毒載體由于其高度免疫原性衣殼而觸發(fā)嚴重免疫應答的能力,可能導致病毒失活并阻礙轉(zhuǎn)基因的系統(tǒng)傳遞,使其應用受到了限制[5-6]。早在1990年,就有文章報道質(zhì)粒載體是一種極具前景的體內(nèi)轉(zhuǎn)染載體,表達熒光素酶的DNA分子在小鼠體內(nèi)表達時間可長達兩個月[7]。質(zhì)粒DNA載體較為安全,可誘導廣泛的免疫反應,也不存在任何與復制微生物相關(guān)的風險,而直接瘤內(nèi)注射質(zhì)粒的方式減少了擴散和泄露,且增加了對主要病灶的免疫原性。

本實驗用CT26-IRFP腫瘤細胞皮下接種BALB/c小鼠建立腫瘤動物模型,用穿梭質(zhì)粒pT7 mGM-CSF注射小鼠瘤內(nèi),觀察GM-CSF基因免疫治療小鼠結(jié)腸癌的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細胞

6～7周齡雌性BALB/c小鼠購于湖北省實驗動物研究中心(合格證編號42000600043578)。CT26-IRFP細胞由本實驗室通過PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將近紅外熒光蛋白IRFP 720轉(zhuǎn)入鼠結(jié)腸癌細胞CT26細胞株,并通過嘌呤霉素篩選獲得CT26-IRFP 720單克隆細胞株[8]。

1.1.2 主要試劑與儀器

ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit重組克隆試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);氨芐青霉素(德國biofrox);大腸桿菌DH5α(賽默飛世爾科技有限公司);lipofectamine3000購自(賽默飛世爾科技有限公司);胎牛血清(四季青公司);胰酶(美國Gibco公司);DME/F-12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);肌醇山梨醇緩沖液(IS Buffer)(武漢塞維爾生物科技有限公司);PBS(南京生航生物技術(shù)有限公司);蘇木素染液(武漢塞維爾生物科技有限公司);一抗CD3(武漢塞維爾生物科技有限公司);一抗CD11b(武漢塞維爾生物科技有限公司);HRP標記山羊抗兔組化試劑盒DBA顯色劑(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

細胞計數(shù)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);基因擴增儀和二氧化碳培養(yǎng)箱(日本松下公司);恒溫水浴鍋(新苗生物科技有限公司);倒置熒光顯微鏡(日本Olympus Corporation);生物安全柜(青島海爾集團公司);-70℃低溫冰箱(青島海爾集團公司);高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);小動物活體成像系統(tǒng)(PE珀金埃爾默股份有限公司);包埋機(武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建與表達

pT7載體由本實驗室提供,根據(jù)目的基因GM-CSF序列設計引物,引物序列以XX基因組序列為模板擴增,PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小正確后,將目的片段進行產(chǎn)物回收。載體pT7以及目的基因GM-CSF的PCR產(chǎn)物用ClonExpress技術(shù)進行同源重組。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5ɑ,利用氨芐青霉素進行陽性克隆篩選,得到pT7 mGM-CSF后,DNA測序檢測載體正確性。

將質(zhì)粒通過lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細胞,收集細胞上清,用Elisa驗證抗原的表達,重復實驗5次。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

CT26-IRFP細胞用含有10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基接種后,將細胞放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),待細胞匯合度達80%～90%時,按照1∶4的比例進行細胞傳代。

1.2.3 植瘤前細胞處理

對所需要植瘤的CT26-IRFP細胞進行培養(yǎng),在植瘤前,收集細胞,離心條件為800g,5min,然后重懸于DME/F-12培養(yǎng)基中。調(diào)整CT26-IRFP細胞濃度至1×106/mL。

1.2.4 CT26-IRFP細胞植瘤

15只BALB/c小鼠飼養(yǎng)于配有IVC籠具及新風系統(tǒng)動物實驗室內(nèi),飼養(yǎng)一周后開始實驗,于BALB/c小鼠右側(cè)肋背部皮下注射100μL含有1×106個CT26-IRFP的細胞懸液,待腫瘤生長至50～80mm3備用。

1.2.5 pT7 mGM-CSF瘤內(nèi)給藥實驗

隨機分成3組,分組見表1。CT26-IRFP荷瘤鼠在第1、4、7、10d瘤內(nèi)注射80μL(200ng/μL)提取的質(zhì)粒和IS buffer。

表1 pT7 mGM-CSF給藥實驗方案

1.2.6 量取腫瘤體積

用游標卡尺量取長徑(a)一次、短徑(b)兩次,腫瘤體積(tumor volume)的計算公式為:V=1/2×a×b×b。

1.2.7 活體動物成像系統(tǒng)檢測IRFP產(chǎn)生的熒光信號

小鼠腫瘤近紅外熒光拍攝前先對小鼠進行麻醉,后將小鼠分組放入小動物活體成像系統(tǒng)拍攝箱,拍攝腫瘤近紅外熒光表達圖片。每隔7d使用小動物活體成像儀觀察小鼠體內(nèi)熒光表達情況,持續(xù)觀察。

1.2.8 免疫組織化學檢測

治療第14d時取各組腫瘤組織,4%多聚甲醛固定過夜,脫水處理、石臘包埋、制成厚度為4～5μm的切片。免疫組化染色流程如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟、補水處理,3%H2O2室溫孵育5～10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用組化油筆將待染組織圈好,加入10%FBS室溫封閉1h,加入待測一抗,室溫孵育2h,PBS洗滌,加入HRP標記IgG抗體,室溫作用1h,PBS洗滌,DAB顯色,自來水充分沖洗,透明,樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用Graph Pad Prism 8.01軟件進行統(tǒng)計學分析,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒pT7 mGM-CSF在真核細胞中的表達

參照lipofectamine3000使用說明書,將0.5μg的pT7 mGM CSF轉(zhuǎn)染293T細胞,轉(zhuǎn)染36～48h后,收集六孔板中的細胞上清,用Elisa檢測mGM-CSF蛋白表達。結(jié)果顯示,與pT7 GFP組和PBS組比較,pT7 mGM-CSF質(zhì)粒的表達在質(zhì)粒組的293T細胞上清中的含量達到600pg/mL,與其他兩組有顯著差異(*P<0.05)。如圖1所示。

圖1 Elisa測定mGM-CSF在293T細胞中的表達(*P<0.05,n=3)

2.2 質(zhì)粒pT7 mGM-CSF體內(nèi)抑瘤效應

研究結(jié)果顯示,在CT26-IRFP皮下移植瘤模型上,pT7 GFP組和PBS組相比,質(zhì)粒組動物腫瘤生長趨勢更為平緩。給藥第21d,與PBS比較,質(zhì)粒組治療效果明顯(圖2A)。在治療28d后,pT7 mGM-CSF質(zhì)粒組小鼠存活率為40%,與pT7 GFP組和PBS組相比有顯著性差異(P<0.05),見圖2B。

圖2 CT26腫瘤生長曲線圖及鼠生存曲線圖

2.3 腫瘤IRFP基因在體內(nèi)表達的熒光信號強度比較

小鼠腫瘤熒光趨勢圖和給藥21d熒光強度圖的數(shù)據(jù)顯示在CT26-IRFP小鼠皮下移植瘤模型上,小鼠腫瘤總熒光強度和量瘤數(shù)據(jù)的趨勢基本一致。腫瘤熒光強度結(jié)果顯示質(zhì)粒組IRFP基因表達的熒光信號與pT7 GFP組和PBS組相比都有顯著性差異(P<0.05),見圖3B。

圖3 CT26腫瘤IRFP基因在體內(nèi)表達的熒光信號強度圖

2.4 質(zhì)粒pT7 mGM-CSF應用有效刺激免疫細胞浸潤

為了進一步探究質(zhì)粒pT7 mGM-CSF的療效,我們開展了CD3(指示T淋巴細胞)、CD11b(指示NK細胞)免疫組織化學檢測,觀察小鼠腫瘤組織中浸潤細胞的類型。實驗結(jié)果顯示,與PBS組相比,質(zhì)粒組的小鼠腫瘤組織內(nèi)部有大量T淋巴細胞、NK細胞(圖4)。提示質(zhì)粒pT7 mGM-CSF能促進各種免疫細胞進入腫瘤組織、抑制腫瘤細胞的生長。

圖4 腫瘤局部組織免疫組織化學(標尺=50μm)

3 討 論

目前,腫瘤免疫監(jiān)控的概念正在復興,免疫系統(tǒng)可以通過各種途徑激活來發(fā)揮抗腫瘤的效果。為了達到這一目標,必須提供適當?shù)募毎蜃迎h(huán)境,使細胞因子操作成為免疫治療的核心。近來,國內(nèi)外研究者對GM-CSF功能的研究越來越深入,尤其在腫瘤免疫治療方面得到更多的關(guān)注。GM-CSF恢復腫瘤患者中性粒細胞驅(qū)動的免疫反應,在GM-CSF的下游免疫效應器中,中性粒細胞尤其重要,是最早對感染和癌癥做出反應的免疫細胞類型之一[9]。最近,GM-CSF被證明通過激活腫瘤微環(huán)境中嗜酸性粒細胞中的IRF-5來驅(qū)動抗腫瘤的CD4和CD8 T細胞免疫反應[10]。因此,GM-CSF在抗腫瘤方面的研究有必要進一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn),pT7 mGM-CSF質(zhì)粒能高效表達靶基因,明顯抑制BALB/c小鼠結(jié)腸癌的生長,延長小鼠的生存期。另外,免疫組織化學結(jié)果發(fā)現(xiàn),穿梭質(zhì)粒pT7 mGM-CSF治療組腫瘤組織內(nèi)部有大量T淋巴細胞、NK細胞,提示穿梭質(zhì)粒pT7 mGM-CSF能有效增強不同免疫細胞的趨化吸引作用,促進各種免疫細胞進入腫瘤組織、抑制腫瘤細胞的生長。但穿梭質(zhì)粒在患者原代腫瘤細胞中的局限性仍然不容忽視,更值得注意的是,這項研究僅限于單個細胞系,后期仍有必要增加不同細胞系的研究并與病毒載體進行比較研究。

綜上所述,瘤內(nèi)注射GM-CSF基因修飾的穿梭質(zhì)粒對小鼠結(jié)腸癌具有明顯的抑瘤效應,可能與質(zhì)粒pT7 mGM-CSF有效刺激免疫細胞浸潤有關(guān),但具體機制還需要進一步研究。本研究也為臨床應用GM-CSF基因免疫治療提供了實驗依據(jù)。