萬曉君 許激揚(yáng)

【摘要】目的：研究清溪花鱉肽的體內(nèi)外抗氧化活性。方法：測(cè)定清溪花鱉肽體外對(duì)DPPH、·OH和·O2-自由基的清除作用。建立D-半乳糖致衰老模型小鼠，灌胃給予清溪花鱉肽，測(cè)定小鼠血漿和肝臟中的MDA（丙二醛）含量、CAT（過氧化氫酶）、T-SOD（超氧化物歧化酶）和GSH-Px（谷胱甘肽過氧化物酶）的活力，研究清溪花鱉肽體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果：清溪花鱉肽對(duì)DPPH、·OH和·O2-自由基的清除能力較強(qiáng)，IC50分別為2.45 mg/mL，4.36 mg/mL和6.95 mg/mL。而且，清溪花鱉肽能明顯降低造模小鼠肝臟與血漿中MDA的含量，并可以切實(shí)提高CAT、SOD與GSH-Px活力。結(jié)論：清溪花鱉肽有很好的體內(nèi)外抗氧化活性。

【關(guān)鍵詞】清溪花鱉；多肽；抗氧化

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.01.034

Study on Antioxidant Activity of Qingxi Turtle Peptide

WAN Xiao-jun1，XU Ji-yang2*

（1.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China；2.School of Life Science and Technology，China

Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Abstract：Objective：To study the antioxidant activity of Qingxi turtle peptide in vivo and in vitro. Methods：the scavenging effects of Qingxi turtle peptide on DPPH，·OH and·O2-free radicals in vitro were determined. The aging model mice induced by D-galactose were established. Qingxi turtle peptide was given by gavage. The contents of MDA（malondialdehyde），cat（catalase），T-SOD（superoxide dismutase）and GSH-PX（glutathione peroxidase）in plasma and liver were measured to study the antioxidant activity of Qingxi turtle peptide in vivo. Results：Qingxi soft shelled turtle peptide had strong scavenging ability for DPPH，·OH and·O2-free radicals. The IC50 were 2.45 mg/mL，4.36 mg/mL and 6.95 mg/mL respectively. Moreover，the Qingxi turtle peptide can significantly reduce the content of MDAin the liver and plasma of the model mice，and can effectively improve the activities of CAT，SOD and GSHPx. Conclusion：Qingxi turtle peptide has good antioxidant activity in vivo and in vitro.

Key words：Qingxi turtle；peptide；antioxidant

衰老的分子機(jī)制復(fù)雜，其中Denham Harman提出的自由基損傷理論是目前廣泛研究和認(rèn)可的衰老學(xué)說[1]。機(jī)體在正常情況下，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可以清除多余的自由基，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，包括谷胱甘肽（Glutathione，GSH）系統(tǒng)和超氧化物酶等。如果細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡被打破，體內(nèi)自由基積攢過多，會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生丙二醛（malondialdehyde，MDA），進(jìn)而會(huì)加速機(jī)體衰老。研究表明，生物活性肽可以通過清除自由基從而保護(hù)細(xì)胞的正常功能，具有很好的延緩衰老的作用[2]。如樸美子等人發(fā)現(xiàn)中華真地鱉酶解短肽對(duì)常見自由基有較強(qiáng)的清除作用。如對(duì)·O2-、·OH和DPPH等自由基清除明顯，IC50可以分別達(dá)到8.73、0.40、1.32 mg/mL[3]。鮑魚內(nèi)臟抗氧化肽對(duì)DPPH、羥自由基、ABTS自由基的IC50分別為4.6、16.24、17.41 mg/mL[4]。清溪花鱉肽是從清溪花鱉中得到的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，已有研究發(fā)現(xiàn)清溪花鱉肽對(duì)尿酸鈉所致大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用[5]，但清溪花鱉肽對(duì)其他生物活性尤其是抗氧化活性的研究還未見報(bào)道。本研究將從體內(nèi)和體外兩方面探討清溪花鱉肽的抗氧化作用。

1材料與方法

1.1材料與試劑

清溪花鱉肽（浙江德溪生物科技有限公司），DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）（如無特殊說明，化合物購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司），三羥甲基氨基甲烷（Tris）（美國(guó)Sigma），抗壞血酸（aladdin），CAT（過氧化氫酶）試劑盒、MDA（丙二醛）試劑盒、GSH-Px（谷胱甘肽過氧化物酶）試劑盒及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒羥、自由基（·OH）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)主要用到的儀器

Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；DFY-250A高速組織粉碎機(jī)；MSE型分析電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH）能力的測(cè)定

1.3.3清除超氧自由基（·O2-）能力的測(cè)定

取0.1 mL不同濃度的樣品溶液加到25℃預(yù)熱的4.5 mL 0.1 M的Tris-HCl（pH 8.2）中，再加入0.3 mL 3mM鄰苯三酚溶液，25℃反應(yīng)3 min，320 nm下測(cè)定吸光度。對(duì)照組以同等體積的蒸餾水代替樣品溶液，以同等體積的HCl代替鄰苯三酚做空白調(diào)零。每組濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，測(cè)量后取平均值。按照如下公式計(jì)算清除率：

清除率%=（A對(duì)照-A樣品）/A對(duì)照×100

1.3.4體內(nèi)抗氧化活性能力的測(cè)定

選用成年健康清潔級(jí)雄性小鼠60只，隨機(jī)分為陽性對(duì)照組、空白組、模型組，清溪花鱉肽高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組測(cè)10只?？瞻捉M皮下注射生理鹽水0.1 mL/（10 g·d），其余各組小鼠皮下注射D-半乳糖200 mg/（kg·d），以建立衰老模型。同時(shí)，清溪花鱉肽低劑量組、中劑量組、高劑量組以100、200、400 mg/（kg·d）的劑量灌胃給予清溪花鱉肽；陽性對(duì)照組以100 mg/（kg·d）的劑量灌胃給予Vc陽性藥；造模組和空白組用等體積的生理鹽水灌胃。每日注射或者灌胃一次并連續(xù)6周處理。小鼠末次注射、灌胃后禁食12 h，眼球取血，脫頸椎處死。血液3000 rpm離心20 min，吸取上層血漿，-20℃存放備用。取小鼠肝臟，稱重，研磨。肝臟組織和血清中的MDA含量通過硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，SOD活力采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定，CAT活力采用鉬酸銨法測(cè)定，GSHPx活力采用比色法測(cè)定，具體操作步驟按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。顯著性差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)，P值小于0.05為顯著差異，P值小于0.01為極顯著差異。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1清溪花鱉肽的體外抗氧化能力

抗氧化肽的體外抗氧化活性可以通過研究抗氧化肽對(duì)自由基的清除能力來評(píng)價(jià)，如對(duì)DPPH自由基、·OH自由基和·O2-等自由基清除能力。如圖1所示，清溪花鱉肽對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧自由基的清除能力較好，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，IC50值分別為2.45 mg/mL，4.36 mg/mL和6.95 mg/mL。

2.2體內(nèi)抗氧化活性

2.2.1清溪花鱉肽對(duì)衰老小鼠肝臟組織的作用

與體外測(cè)定方法相比，利用動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)芨鼫?zhǔn)確的評(píng)價(jià)活性肽的生物學(xué)功能。衰老與活性氧有關(guān)，增強(qiáng)抗氧化酶活性可以抗衰老。體內(nèi)抗氧化酶有過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）[6]。丙二醛（MDA）是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，也是評(píng)價(jià)衰老的指標(biāo)之一[7]。由圖2可知，模型組的MDA含量極顯著高于空白組，同時(shí)SOD、CAT和GSH-Px活性極顯著降低，說明造模成功。清溪花鱉肽組與模型組相比，低劑量組中的MDA含量及SOD、GSH-Px活力沒有顯著變化，CAT活力顯著升高；中和高劑量組中的CAT、SOD和GSH-Px活力都顯著升高，MDA含量顯著降低。說明中、高劑量的清溪花鱉肽對(duì)小鼠肝臟氧化有較強(qiáng)的抑制作用。

2.2.2清溪花鱉肽對(duì)衰老小鼠血清的影響

如圖3所示，模型組小鼠與空白組相比，其血清中CAT、SOD和GSH-Px活力顯著降低，MDA含量顯著升高，說明造模成功。清溪花鱉肽中、高劑量組中的SOD、CAT和GSH-Px活力與模型組相比都顯著升高，MDA含量顯著降低，與陽性組無顯著差異。說明中、高劑量的清溪花鱉肽可以說增加小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活力，使機(jī)體更好的清除過量自由基。

3結(jié)論

衰老是機(jī)體組織結(jié)構(gòu)發(fā)生退化和生理功能喪失的過程。根據(jù)自由基理論，機(jī)體內(nèi)過量的活性氧對(duì)蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子造成損傷是誘發(fā)衰老的關(guān)鍵。在細(xì)胞的正常狀態(tài)下，常見的活性氧，如超氧陰離子、氧原子衍生物及羥基自由基等的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中。一方面它們會(huì)持續(xù)生成，另一方面機(jī)體會(huì)將它們及時(shí)清除。然而，當(dāng)人體機(jī)體衰老時(shí)，機(jī)體清除活性氧的能力就會(huì)下降，這就導(dǎo)致了未能及時(shí)被清除的活性氧的積累，進(jìn)而它們會(huì)對(duì)細(xì)胞的組織會(huì)產(chǎn)生損傷。因此，從來源上來說，補(bǔ)充外源性抗氧化劑或增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶活性就可以及時(shí)清除體內(nèi)累積的過量的活性氧，從而達(dá)到延緩衰老的目的。已經(jīng)有許多研究表明，一些天然活性物質(zhì)可以清除自由基，以達(dá)到延緩衰老、減少與衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。也正是基于前人發(fā)現(xiàn)的衰老與氧化壓力之間的密切關(guān)系，我們?cè)O(shè)計(jì)了本項(xiàng)目。理論的依據(jù)主要是基于之前的研究發(fā)現(xiàn)抗氧化肽可以通過激活抗氧化信號(hào)通路、清除過量的自由基以及提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性來延緩衰老。

本項(xiàng)目觀察了清溪花鱉肽體內(nèi)外的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)清溪花鱉肽對(duì)體外DPPH、·OH和·O2-自由基有較強(qiáng)的清除作用，其IC50分別為2.45 mg/ml，4.36 mg/ml和6.95 mg/mL。清溪花鱉肽中、高劑量組與模型組相比，小鼠血漿和肝臟中MDA含量、SOD、CAT和GSH-Px活力都有顯著性差異。說明清溪花鱉肽具有較強(qiáng)的體外內(nèi)抗氧化作用，可能通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少M(fèi)DA的生成并且在其代謝過程中激活多種內(nèi)源性抗氧化酶類，清除體內(nèi)的自由基。

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【作者簡(jiǎn)介】

萬曉君，女，1988年出生，主管藥師，碩士，研究方向?yàn)樗帉W(xué)。通訊作者：許激揚(yáng)，男，1956年出生，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)。

（本稿審讀：王震紅）