郭玉翠 韓鐫竹 邱月 高鐸 李欣南

【摘要】探討飼用屎腸球菌生物安全性評價方法，初步掌握市售屎腸球菌生物安全現(xiàn)狀。采用生化鑒定技術、PCR技術、藥敏檢測分析等方法，對市售10個生產企業(yè)的屎腸球菌開展質粒篩查、溶血分析、耐藥性檢測和毒力分析。結果顯示10株屎腸球菌均不含有質粒，也不存在溶血反應。對監(jiān)測的27種藥物中苯唑西林、克林霉素、泰妙菌素、磺胺異惡唑的耐藥率較高，分別為70%、60%、80%和60%，其余藥物均敏感。耐藥基因檢測結果與藥敏結果基本一致。毒力基因結果顯示屎腸球菌均攜帶毒力基因gelE、asal、esp，均不攜帶毒力基因ace，優(yōu)勢組合為gelE+asal+esp+ccf。屎腸球菌的耐藥機制和毒力基因存在情況較為復雜，潛在細胞黏附和細胞毒性侵襲風險，急需建立飼用屎腸球菌的生物安全性的監(jiān)測手段和評價標準。

【關鍵詞】屎腸球菌；耐藥性；毒力基因；飼料添加劑；安全性評價

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.01.028

【基金項目】遼寧省自然科學基金項目（2019-ZD-0845）。

Quality and Safety Analysis of Microbial Feed Additive Enterococcus Faecium

GUO Yu-cui，HAN Juan-zhu，QIU Yue，GAO Duo，LI Xin-nan

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China）

Abstract：To explore the biosafety evaluation method of feeding Enterococcus faecium，and preliminarily grasp the biosafety status of Enterococcus faecium in the market. Plasmid screening，hemolysis analysis，drug resistance detection and virulence analysis of Enterococcus faecium from 10 commercial enterprises were carried out by means of biochemical identification technology，PCR technology and drug sensitivity detection and analysis. The results showed that none of the 10 strains of Enterococcus faecium contained plasmid and hemolytic reaction. Among the 27 drugs monitored，the drug resistance rates of oxacillin，clindamycin，tylosin and sulfaisoxazole were 70%，60%，80% and 60% respectively. The other drugs were sensitive. The results of drug resistance gene detection were basically consistent with the results of drug sensitivity. The results of virulence gene showed that Enterococcus faecium carried virulence genes gelE，asal and esp，and none carried virulence gene ace. The dominant combination was gelE+asal+esp+ccf. The drug resistance mechanism and virulence genes of Enterococcus faecium are complex， and there is a potential risk of cell adhesion and cytotoxic invasion. It is urgent to establish the monitoring means and evaluation criteria for the biosafety of feeding Enterococcus faecium.

Key words：Enterococcus faecium；drug resistance；virulence gene；feed additive；safety evaluation

屎腸球菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，屬于腸球菌屬[1]。2013年我國農業(yè)農村部發(fā)布的《飼料添加劑品種目錄》，將屎腸球菌列為允許使用的飼用菌種之一[2]，廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖。研究表明屎腸球菌有助于幫助機體消化和腸道代謝，從而增強動物免疫能力，促進動物生長，提高飼料轉化率[3-4]。但它也是一種條件性致病菌，常引起人和動物尿路感染等疾病，其耐藥性產生與傳遞會造成動物整體耐藥水平的提高，增加患病動物的臨床治療難度[5-7]。近些年，市售含屎腸球菌的飼料添加劑產品越來越多，其安全性和穩(wěn)定性也引起了相關管理部門的高度重視[8-9]。本文對10株飼用屎腸球菌開展了27種藥物耐藥性分析，并對6種腸球菌關鍵毒力基因分布情況進行了系統(tǒng)分析，以期為該類產品的安全性評價提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株及樣品來源

質控菌株糞腸球菌ATCC 29212中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所贈送；屎腸球菌飼料添加劑樣品市售。

1.2培養(yǎng)基與試劑

糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術有限公司）；哥倫比亞血瓊脂基礎（北京路橋生物科技股份有限公司）；革蘭氏陽性鑒定卡（梅里埃診斷產品有限公司）；革蘭氏陽性藥物敏感性測定板（上海星佰生物技術有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司）；2×Taq PCR MasterMix、DL1000、瓊脂糖（大連寶生物工程有限公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3儀器設備

Nu-425-400S生物安全柜（美國NUAIRE公司）；GR85DA高壓蒸汽滅菌器（美國ZEALWAY）；恒溫培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）；VITEK2 Compact細菌鑒定及藥敏分析儀（BIOMERIEUX公司）；430-A全自動菌液接種儀（美國Sensititve）、ULTI1386-3-V41超低溫冰柜（美國THERMO公司）；CF16RN高速低溫冷凍離心機（日本HITACHI）；TC-512PCR儀（北京德力萊）；DYY-6C型電泳儀（北京六一）；170-8170型紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD）。

1.4方法

1.4.1細菌鑒定

樣品溶解于0.9%無菌生理鹽水中，經梯度稀釋后涂布于糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上，控制平板上菌落數(shù)在30～300范圍內，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h[10-11]，選取疑似菌落接種于哥倫比亞血瓊脂基礎培養(yǎng)基上，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分離獲得的細菌進行細菌生化鑒定。

1.4.2藥敏試驗

藥敏試驗采用肉湯稀釋法。取新鮮培養(yǎng)物使用無菌生理鹽水調節(jié)菌液濃度至0.5麥氏，再做200倍稀釋獲得菌懸液，使用全自動菌液接種儀加樣，藥敏板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，藥敏試驗結果依據(jù)美國臨床實驗室標準協(xié)會（CLSI）標準判讀[12]。

1.4.3質粒提取

采用質粒提取試劑盒對屎腸球菌進行質粒DNA提取，瓊脂糖凝膠的濃度為1.0%，質粒DNA的上樣體積為10μL，電壓 110 V，電泳時間30 min。

1.4.4溶血試驗

采用脫纖維綿羊血制備哥倫比亞血瓊脂，將試驗菌株涂布于血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h。

1.4.5毒力基因和耐藥基因的PCR檢測

采用細菌基因組DNA提取試劑盒對屎腸球菌進行基因組提取，作為PCR模板，模板濃度A260/A280均在1.8～2.0之間。6種腸球菌關鍵毒力基因別為明膠酶E（gelatinase，gelE）、聚集物質（aggregation substance，asal）、膠原蛋白黏附素（collagen-binding-adesin of Enterococcal，ace）、表面蛋白（enterococcal surface protein，esp）、溶血素（cytolysin，cylA）、性信息素（sex pheromone，ccf），引物的設計參照文獻[13-14]方法。毒力基因引物信息詳見表1。

12種腸球菌耐藥基因分別為氨基糖苷類耐藥基因Aac（6）/aph（2）、aph（3）-Ⅲ、ant（4-4）；四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetC、tetM；β-內酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCTX-M；糖肽類耐藥基因VanA、VanB；噁唑烷酮類耐藥基因optrA；紅霉素耐藥基因ermB，引物的設計參照文獻[15-16]方法，引物序列見表2。PCR反應體系為50μL體積，PCR Mix25μL，上、下游引物各0.5μL（10μM），DNA模板液1.5μL，雙重蒸餾水22.5μL。PCR擴增條件為95℃預變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火60 s（其中cylA退火溫度為60℃），72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠的濃度為1.5%，PCR擴增產物的上樣體積為10μL，電壓110 V，電泳時間30 min。

2結果與分析

2.1細菌分離鑒定結果

分離獲得飼用屎腸球菌10株。分離株在糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上為磚紅色菌落，邊緣光滑，結果見圖1。在5%哥倫比亞血瓊脂基礎上為灰白色菌落，表面晶瑩，邊緣光滑，結果見圖2。采用細菌檢定儀進行屎腸球菌生化鑒定，鑒定百分率（ID%）達99%，詳細結果見表3。

2.2藥敏試驗結果

對10株屎腸球菌開展了27種抗菌素的藥敏試驗，其中19種在CLSI上給出了判定標準。藥敏結果顯示屎腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、青霉素、復方新諾明、萬古霉素、替米考星、紅霉素、氟苯尼考、四環(huán)素、強力霉素（多西霉素）、利奈唑胺均敏感，耐藥率為0%；對慶大霉素、頭孢噻呋、恩諾沙星、氧氟沙星輕度耐藥，耐藥率分別為10%、10%、20%、10%；對苯唑西林、克林霉素、泰妙菌素、磺胺異惡唑的耐藥率較高，分別為70%、60%、80%和60%；對頭孢西丁的耐藥率達100%，而腸球菌對頭孢菌素、苯唑西林、單環(huán)類等抗生素天然耐藥，所以頭孢西丁耐藥率會達到100%。

其余抗生素屬于促生長抗生素，主要考察此類抗生素的MIC范圍，經試驗發(fā)現(xiàn)桿菌肽的MIC值介于4～64μg/mL之間；吉他霉素MIC值介于0.5～8μg/mL之間；阿維拉霉素MIC值介于0.5～16μg/mL之間，那西肽MIC值介于0.015～0.06μg/ mL之間，維吉尼亞霉素MIC值介于0.25～1μg/mL之間；黃霉素MIC值在16μg/mL以上；喹烯酮MIC值均>64μg/mL；同時，對恩拉霉素藥敏結果差異較大，部分細菌藥敏結果≤0.25μg/mL，部分>64μg/mL。

2.3質粒測定結果

10株屎腸球菌均不攜帶質粒，具體結果見圖3。

2.4溶血試驗結果

10株屎腸球菌均不溶血，具體結果見圖4。

2.5毒力基因結果分析

通過對6種腸球菌關鍵毒力基因的檢測發(fā)現(xiàn)10株屎腸球菌均攜帶明膠酶gelE、聚集物質asal、表面蛋白esp毒力基因，攜帶率為100%；其次為ccf，攜帶率為60%；對毒力基因cylA的攜帶率為10%；10株屎腸球菌均不攜帶毒力基因ace。10株屎腸球菌毒力基因優(yōu)勢組合為gelE+asal+esp+ccf，詳見表4。

2.6耐藥基因結果分析

通過對12種腸球菌耐藥基因的檢測發(fā)現(xiàn)10株屎腸球菌均攜帶tetC，攜帶率為100%；其次為Aac（6）/aph（2）和blaCTX-M，攜帶率分別為90%和50%；對耐藥基因tetA和blaTEM的攜帶率為10%；10株屎腸球菌均不攜帶耐藥基因aph（3）-Ⅲ、ant（4-4）、tetM、VanA、VanB、optrA、ermB，具體結果詳見表5。耐藥基因檢測結果與藥敏結果基本一致。以樣品4為例，耐藥基因檢測結果見圖5。

3討論

細菌耐藥性是阻礙獸醫(yī)臨床治療的關鍵問題，而大量飼用微生物的使用則潛在耐藥性流行與傳播的風險。目前，屎腸球菌雖然作為飼用益生菌大量應用于養(yǎng)殖業(yè)中，但我們仍要關注其毒力與抗性的突變。本研究結果表明監(jiān)測的飼用屎腸球菌未檢測到VRE耐藥表型，利奈唑胺均敏感。對頭孢西丁的耐藥率達100%，是屎腸球菌的天然的抗性，這與相關報道一致[17]。此外，國內外學者研究發(fā)現(xiàn)腸球菌屬毒力基因esp和ace與生物被膜的形成具有密切相關性，而asal、cylA、gelE和ccf則與細胞毒性密切相關[18-20]。本研究中發(fā)現(xiàn)監(jiān)測的屎腸球菌均不攜帶ace，均攜帶gelE、asal和esp毒力基因，存在多種毒力基因組合，其優(yōu)勢組合為gelE+asal+esp+ccf，說明監(jiān)測的屎腸球菌毒力基因存在情況較為復雜，潛在細胞黏附和細胞毒性侵襲風險。當前我國飼用微生物均是通過安全性評價和審批后投入生產，但上市后的監(jiān)管仍然滯后。飼用微生物的安全使用需要更多的監(jiān)測手段和方法，急需建立飼用腸球菌安全性評價的標準，這對于保障養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展與公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

4結論

屎腸球菌的耐藥機制和毒力基因存在情況較為復雜，潛在細胞黏附和細胞毒性侵襲風險，急需建立使用中的飼用屎腸球菌的生物安全性的監(jiān)測手段和評價標準。

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【作者簡介】

郭玉翠，女，1994年出生，助理畜牧師，學士，研究方向為功能型微生物、養(yǎng)殖投入品與食品質量安全檢測技術。

通訊作者：李欣南，女，1978年出生，正高級畜牧師，博士，研究方向為功能型微生物、動物源細菌耐藥性、養(yǎng)殖投入品與食品質量安全檢測技術。E-mail：lixinnanli@163.com，手機號碼：13840472601。

（編輯：李加鵬）