王琦 朱夢婷 劉燕 張玲玲

(北京林業(yè)大學(xué),北京,10083) (南京農(nóng)業(yè)大學(xué))

山丹(LiliumpumilumDC.),又稱細(xì)葉百合,為百合科百合屬多年生草本,原產(chǎn)于中國北部、東西伯利亞、朝鮮、韓國和蒙古[1],自然分布于海拔400～2 600 m的山地、草坡或裸露的巖石間[2-3]。其生性強(qiáng)健,適應(yīng)性強(qiáng),耐寒、耐熱、耐半陰,尤其具有很強(qiáng)的抗旱性,在百合抗性育種中起著重要的作用[4]。

目前,由于過度放牧、采集以及對自然棲息地的破壞,山丹種質(zhì)資源正面臨滅絕的風(fēng)險(xiǎn)[5]。山丹種質(zhì)資源的保存方法有遷地保存和離體保存2種方式[6]。車飛[7]將陜西秦巴山區(qū)的山丹引種到楊陵西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場百合資源圃后進(jìn)行遷地保存;Zhang et al.[8]對山丹的體細(xì)胞胚胎和不定芽進(jìn)行了組織培養(yǎng)離體保存。然而,遷地保存容易受到外界環(huán)境影響,不適用于種質(zhì)資源長期保存。組培物離體保存需要多次繼代,投入大量的人力和物力,同時(shí)植物材料存在著遺傳變異的風(fēng)險(xiǎn),因此離體保存也不能實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的長期保存[9]。本研究旨在建立山丹種質(zhì)資源的超低溫保存體系,實(shí)現(xiàn)對其種質(zhì)資源的長期保存。

超低溫保存是1種利用液氮低溫(-196 ℃或-165～-190 ℃液氮蒸氣)對種質(zhì)資源進(jìn)行長期保存的理想方法[10]。在這種極端低溫條件下,植物細(xì)胞的新陳代謝基本停止,因此植物材料可以被長期保存[11-12]。其中玻璃化法較適合組培物的超低溫保存[13]。玻璃化法是指利用高濃度且黏稠的冷凍保護(hù)劑對植物細(xì)胞進(jìn)行滲透脫水,當(dāng)溫度降低至極端溫度時(shí),植物細(xì)胞就會(huì)轉(zhuǎn)化為無定形的玻璃化結(jié)構(gòu),而不會(huì)受到冰晶損傷[14]。由于玻璃化法操作簡便,凍存率高,適應(yīng)性廣,因此得到了廣泛應(yīng)用[15]。目前已有200多種植物的體細(xì)胞胚、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體、莖尖等實(shí)現(xiàn)了玻璃化法超低溫保存[10]。在實(shí)現(xiàn)超低溫保存的植物材料中,莖尖通常比細(xì)胞懸浮液和愈傷組織更適合保存遺傳資源,因?yàn)榍o尖具有更高水平的遺傳穩(wěn)定性,其生長發(fā)育成的植株與原始植株完全相同[16-17]。

百合屬植物莖尖玻璃化超低溫保存研究始于20世紀(jì)90年代,Matsumoto et al.[18]首先建立了日本百合(Liliumjaponicum)莖尖的玻璃化超低溫保存體系,再生率達(dá)到80%,并在5個(gè)東方百合(LiliumOriental hybrids)品種中成功應(yīng)用,再生率為40%～85%。Bouman et al.[19]對3個(gè)東方百合品種、2個(gè)亞洲百合(LiliumAsiatic hybrids)品種及麝香百合(Liliumlongiflorum)等進(jìn)行了玻璃化超低溫保存,存活率由5%到93%不等。隨后,卷丹百合(Liliumlancifolium)[6,20]、東方百合‘西伯利亞’(LiliumOriental hybrids ‘Siberia’)[20-21]等也實(shí)現(xiàn)了玻璃化超低溫保存。然而,目前實(shí)現(xiàn)玻璃化超低溫保存的百合屬植物種類依然很少,且不同種或品種的百合屬植物超低溫保存后的存活率和再生率差異很大。因此,對不同百合屬植物建立特異性的玻璃化超低溫保存體系是很有必要的。

本研究以山丹無菌苗莖尖為試驗(yàn)材料,建立玻璃化超低溫保存基本程序。在此基礎(chǔ)上,對預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、裝載時(shí)間、脫水時(shí)間等步驟進(jìn)行優(yōu)化,建立最佳的超低溫保存技術(shù)程序,實(shí)現(xiàn)其種質(zhì)資源的長期保存。

1 材料與方法

超低溫保存試驗(yàn)材料為繼代2～4次的山丹無菌苗莖尖。山丹初代無菌苗由北京林業(yè)大學(xué)國家花卉工程研究中心提供。以初代無菌苗鱗片為外植體材料進(jìn)行組織培養(yǎng),獲得第2～4代山丹無菌苗。

山丹無菌苗的組織培養(yǎng):山丹組織培養(yǎng)參照Zhang et al.[8]的方法,并加以優(yōu)化。將山丹初代無菌苗鱗片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(6-BA)2.0 mg/L+萘乙酸(NAA)0.2 mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%)上,誘導(dǎo)形成小鱗莖。隨后將誘導(dǎo)出的小鱗莖轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+蔗糖3%+瓊脂0.6%)中誘導(dǎo)生根,獲得第2代山丹組培苗。之后每2個(gè)月取山丹組培苗鱗片繼代1次,分別獲得第3代、第4代山丹組培苗。

山丹莖尖玻璃化超低溫保存基本程序:在課題組前期研究基礎(chǔ)上,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)查閱和預(yù)試驗(yàn),設(shè)計(jì)基本玻璃化超低溫保存程序。

(1)預(yù)培養(yǎng):取苗齡2個(gè)月左右、繼代2次的山丹無菌苗,剝除外層鱗片,僅保留貼近莖尖的1～2層鱗片,接種至含有0.3 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上,4 ℃、黑暗條件預(yù)培養(yǎng)4 d。

(2)裝載處理:在超凈臺(tái)體視顯微鏡下切取長2 mm左右的山丹莖尖,將其放在裝有1 mL裝載溶液(MS培養(yǎng)基+蔗糖0.4 mol/L+丙三醇2 mol/L)的1.5 mL離心管中,25 ℃處理20 min。

(3)保護(hù)劑溶液處理:吸去裝載溶液,加入預(yù)冷的保護(hù)劑溶液(PVS2溶液:MS培養(yǎng)基+蔗糖0.4 mol/L+丙三醇30%+乙二醇15%+二甲基亞砜(DMSO)15%),0 ℃處理100 min。

(4)冷凍:PVS2溶液處理后,更換新鮮的PVS2溶液,將冷凍離心管迅速投入液氮保存。

(5)化凍:從液氮中取出裝有莖尖的離心管,37 ℃水浴快速化凍60 s。

(6)去裝載處理:吸去PVS2溶液,25 ℃條件用去裝載溶液(MS培養(yǎng)基+蔗糖1.2 mol/L)分2次清洗,每次10 min,共20 min。

(7)存活率測定:采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法測定細(xì)胞活力。將去裝載后的莖尖,移入裝有4 g/L的TTC溶液的離心管中,37 ℃、黑暗條件水浴處理30 min。

存活率=(被染至紅色的莖尖個(gè)數(shù)/所有經(jīng)TTC處理的莖尖個(gè)數(shù))×100%。

(8)再生率測定:選擇存活率最高的處理組,將凍存后的莖尖接種到恢復(fù)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+蔗糖3%+瓊脂0.6%)上,暗培養(yǎng)1周后,莖尖由白色逐漸變?yōu)榫G色,且長度明顯增長,暗培養(yǎng)2周后,轉(zhuǎn)到正常光照條件恢復(fù)培養(yǎng),并統(tǒng)計(jì)再生率。

再生率=(再生莖尖數(shù)/化凍莖尖總數(shù))×100%。

山丹莖尖玻璃化超低溫保存技術(shù)程序優(yōu)化:在已設(shè)定的玻璃化超低溫保存程序基礎(chǔ)上,采用單因素試驗(yàn)的方法對該保存程序進(jìn)行優(yōu)化。

(1)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和蔗糖濃度的篩選:設(shè)置預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1、4、7、10、13 d,共5個(gè)處理;預(yù)培養(yǎng)基蔗糖濃度為0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L,共5個(gè)處理,其余步驟同“山丹莖尖玻璃化超低溫保存基本程序”。

(2)裝載溶液處理時(shí)間的篩選:設(shè)置裝載溶液處理時(shí)間為0、20、40、60、80 min,共5個(gè)處理。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和蔗糖濃度為步驟(1)篩選出的最佳結(jié)果,其余步驟同“山丹莖尖玻璃化超低溫保存基本程序”。

(3)PVS2溶液處理時(shí)間的篩選:設(shè)置PVS2溶液處理時(shí)間為40、60、80、100、120 min,共5個(gè)處理。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度、裝載處理時(shí)間為步驟(1)和步驟(2)篩選出的最佳結(jié)果,其余步驟同“山丹莖尖玻璃化超低溫保存基本程序”。

每個(gè)處理取10個(gè)莖尖,重復(fù)3次。

不同代次組培苗莖尖超低溫保存效果對比:對2代、3代、4代山丹組培苗莖尖分別進(jìn)行玻璃化超低溫保存,并對各代莖尖存活率進(jìn)行比較,保存程序?yàn)椤吧降でo尖玻璃化超低溫保存技術(shù)程序優(yōu)化”篩選出的最佳保存程序。

數(shù)據(jù)處理:使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,用SPSS 26.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和最小顯著差異法(LSD)多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 山丹無菌苗組織培養(yǎng)體系的建立

以山丹無菌苗的鱗片(圖1A)為外植體材料,接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(圖1B)上。1個(gè)月左右,鱗片上有芽點(diǎn)形成(圖1C),之后芽點(diǎn)逐漸發(fā)育成小鱗莖(圖1D),將小鱗莖從鱗片上切取,轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上(圖1E),15 d左右生根(圖1F)。

A為山丹無菌苗鱗片;B為接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基的山丹鱗片;C為山丹鱗片誘導(dǎo)出芽點(diǎn);D為不定芽逐漸發(fā)育成小鱗莖;E為接種于生根培養(yǎng)基的小鱗莖;F為小鱗莖生根。

2.2 預(yù)培養(yǎng)對山丹莖尖玻璃化法超低溫保存存活率的影響

預(yù)培養(yǎng)是超低溫保存的首要步驟,它可以對植物材料進(jìn)行一段時(shí)間的冷鍛煉和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),初步降低植物內(nèi)部組織的含水量,以增強(qiáng)植物材料的抗凍能力和抗脫水能力,有利于后期玻璃化狀態(tài)的形成。

由表1可知,經(jīng)過蔗糖預(yù)培養(yǎng)處理過的山丹莖尖超低溫保存存活率顯著高于對照組(P<0.05),且隨著預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加,莖尖存活率逐漸上升。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度為0.5 mol/L時(shí),莖尖存活率達(dá)到最大,為68.89%,之后降低,但預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L時(shí),莖尖存活率之間差異不顯著。后續(xù)試驗(yàn)選用0.5 mol/L蔗糖濃度作為預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度。

表1 不同預(yù)培養(yǎng)條件的山丹莖尖超低溫保存后的莖尖存活率

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間也對山丹莖尖超低溫保存存活率有較大影響。隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加,莖尖超低溫保存存活率逐漸提高,培養(yǎng)7 d時(shí)存活率最高,達(dá)70.91%,但預(yù)培養(yǎng)4、7、10、13 d,莖尖存活率之間差異不顯著。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間選用7 d。

2.3 裝載處理時(shí)間對山丹莖尖玻璃化法超低溫保存存活率的影響

經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的材料需要用裝載液進(jìn)行裝載,以實(shí)現(xiàn)保護(hù)性滲透脫水。由表2可知,當(dāng)裝載時(shí)間為20 min時(shí),山丹莖尖超低溫保存存活率顯著提高(P<0.05),莖尖存活率達(dá)到最大值,為70.91%。裝載時(shí)間超過20 min時(shí),存活率開始下降,裝載處理20、40、60、80 min,莖尖存活率無顯著差異。試驗(yàn)裝載處理適宜時(shí)間為20 min。

表2 不同裝載時(shí)間和脫水時(shí)間的山丹莖尖超低溫保存后的莖尖存活率

表3 不同代次的山丹莖尖超低溫保存后莖尖存活率

2.4 PVS2溶液處理時(shí)間對山丹莖尖玻璃化法超低溫保存存活率的影響

PVS2溶液處理是超低溫保存的關(guān)鍵步驟之一。經(jīng)過高濃度的PVS2溶液處理,可顯著降低植物細(xì)胞內(nèi)自由水的質(zhì)量分?jǐn)?shù),當(dāng)溫度快速降低時(shí),植物細(xì)胞會(huì)形成無定形的玻璃化結(jié)構(gòu),從而避免冰晶損傷。

由表2可知,PVS2溶液處理時(shí)間可以顯著影響超低溫保存后山丹莖尖的存活率(P<0.05)。PVS2溶液在0 ℃冰浴上處理40和60 min時(shí),莖尖存活率無顯著變化;但時(shí)間延長至80 min時(shí),莖尖存活率開始顯著提高(P<0.05),100 min時(shí)達(dá)到最高存活率,為71.82%,但與處理80 min時(shí)無顯著差異。因此,為降低PVS2溶液對山丹莖尖的毒害作用,選擇PVS2溶液處理時(shí)間為80 min。

2.5 材料代次對山丹莖尖玻璃化法超低溫保存存活率的影響

液氮保存材料的生理狀態(tài)對保存效果有明顯影響,不同代次的材料生理活性可能有差異。使用代次2、3、4代的山丹無菌苗莖尖進(jìn)行超低溫保存,其存活率無顯著差異,說明代次2、3、4代材料對山丹莖尖超低溫保存后的存活率無顯著影響。

2.6 莖尖恢復(fù)培養(yǎng)與植株再生

經(jīng)超低溫保存后的莖尖接種于恢復(fù)培養(yǎng)基上(圖2B),暗培養(yǎng)1周后,成活莖尖轉(zhuǎn)為綠色(圖2C),死亡莖尖表現(xiàn)為褐色(圖2D);暗培養(yǎng)2周后,統(tǒng)計(jì)山丹莖尖再生率,可達(dá)51.85%,且觀察到成活的莖尖有明顯的伸長(圖2E);將其轉(zhuǎn)瓶至正常光照條件培養(yǎng),2個(gè)月后可發(fā)育成完整植株(圖2F)。

A為用于超低溫保存的山丹莖尖;B為超低溫保存后接種于恢復(fù)培養(yǎng)基的山丹莖尖;C為超低溫保存后存活的山丹莖尖;D為超低溫保存后死亡的山丹莖尖;E為超低溫保存后暗培養(yǎng)2周的山丹莖尖;F為超低溫保存后培養(yǎng)2個(gè)月的山丹莖尖。

3 結(jié)論與討論

玻璃化超低溫保存技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的植物種質(zhì)資源長期保存的方法[10],其保存步驟通常包括預(yù)培養(yǎng)、裝載溶液處理、PVS2溶液脫水處理、液氮冷凍-解凍、洗滌和恢復(fù)培養(yǎng)等。因此,其保存效果受到多種因素的影響,如預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度高低、各處理步驟的時(shí)間長短等。

預(yù)培養(yǎng)是超低溫保存過程中的關(guān)鍵步驟,在預(yù)培養(yǎng)階段,對植物材料進(jìn)行冷鍛煉和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),可以有效增強(qiáng)其對低溫和滲透的抗性[22]。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加的糖類主要為蔗糖,因?yàn)檎崽强梢院芎玫乇Ｗo(hù)膜脂結(jié)構(gòu),同時(shí)在低溫條件時(shí)穩(wěn)定蛋白質(zhì)[13]。已有研究表明,預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基蔗糖濃度為0.3～0.7 mol/L、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1～5 d的處理方式對超低溫保存是較為有效的,且蔗糖濃度多為0.3 mol/L[23]。已經(jīng)報(bào)道的實(shí)現(xiàn)超低溫保存的百合屬植物卷丹百合[6,20]、麝香百合[20]等,預(yù)培養(yǎng)蔗糖適宜濃度均為0.3 mol/L。而Yin et al.[21]將東方百合‘西伯利亞’接種于蔗糖濃度為0.5 mol/L的預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d,獲得了最佳存活率。本研究結(jié)果表明,在4 ℃時(shí),將山丹莖尖接種于蔗糖濃度為0.3～0.5 mol/L的MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng),莖尖超低溫保存后,存活率無顯著差異,預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度為0.5 mol/L時(shí),莖尖獲得最高存活率。

在用高濃度的PVS2溶液對植物材料進(jìn)行脫水之前,需要用含有甘油和蔗糖的裝載溶液對植物材料進(jìn)行保護(hù)性滲透脫水,否則預(yù)培養(yǎng)處理后的植物材料無法忍受高濃度PVS2溶液引起的強(qiáng)烈滲透壓沖擊[24]。不同物種的裝載溶液處理時(shí)間不同,大多處理時(shí)間為20 min[25]。相關(guān)研究表明,裝載時(shí)間對東方百合莖尖存活率有較大影響,裝載20 min可以獲得最佳的東方百合莖尖耐脫水和冷凍能力[21];而裝載時(shí)間為20～40 min時(shí),對麝香百合和卷丹百合的莖尖超低溫保存存活率無顯著影響[20]。本研究結(jié)果表明,裝載時(shí)間對山丹莖尖凍后存活率有顯著影響(P<0.05),裝載處理最佳時(shí)間為20 min。

玻璃化法超低溫保存能否成功主要取決于材料在低溫狀態(tài)時(shí)是否變?yōu)椴ＡЩ癄顟B(tài),而PVS2脫水處理時(shí)間的長短則是材料能否實(shí)現(xiàn)玻璃化的關(guān)鍵。處理時(shí)間過短,植物材料未充分脫水,無法形成玻璃化狀態(tài);處理時(shí)間過長,植物材料容易受到化學(xué)毒害作用[26]。不同百合屬植物超低溫保存,PVS2處理時(shí)間存在較大差異,如卷丹的PVS2脫水適宜時(shí)間為90～120 min[6,20],東方百合則需要3～4 h的PVS2脫水處理,超低溫保存效果最佳[21]。本研究中,經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)和裝載處理后,山丹莖尖需要在PVS2溶液中脫水處理80～100 min,達(dá)到最佳凍存效果。為減少PVS2溶液對材料的毒害作用,應(yīng)盡可能減少材料在PVS2溶液中的處理時(shí)間,因此,本研究選擇PVS2最佳處理時(shí)間為80 min。

組培苗在長期的繼代培養(yǎng)過程中,其生理生化水平可能會(huì)發(fā)生變化,進(jìn)而對超低溫保存效果產(chǎn)生影響。沈琛等[27]研究表明,卷丹繼代1～4次的試管苗,莖尖超低溫保存存活率具有顯著差異,2代試管苗存活率顯著高于其他3代。而不同繼代次數(shù)對扶芳藤(Euonymusfortunei(Turcz.) Hand.-Mazz.)莖尖玻璃化超低溫保存的成活率影響不大[28]。本研究結(jié)果表明,繼代次數(shù)為2～4次的山丹莖尖玻璃化法超低溫保存的成活率無顯著差異。但離體培養(yǎng)時(shí)間過長,繼代次數(shù)過多可能導(dǎo)致遺傳變異的發(fā)生[9],因此,應(yīng)避免對繼代次數(shù)過多的組培物進(jìn)行超低溫保存。

本研究建立了最佳的山丹莖尖玻璃化超低溫保存技術(shù)程序,該體系可獲得70.91%的莖尖存活率和51.85%的再生率,為山丹種質(zhì)資源提供了簡單易行、高效的長期保存方法。