王紅玲 黃瑞芳 施士爭

(江蘇省林業(yè)科學研究院,南京,211153)

柳樹是我國廣泛種植的一種楊柳科(Salicacea)柳屬(Salix)樹種,為落葉喬木,種類繁多,具有生長快、耐水濕、抗逆性強等特征,既能作為園林觀賞植物,也是農(nóng)田防護林的常用樹種,具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟價值[9-11]。柳樹的根系發(fā)達、適應性較強,在很多不良的生境下都能生長[12]。近些年來,對于柳樹耐鹽堿的研究逐漸增多[13],但關(guān)于銨態(tài)氮對柳樹影響的機理研究報道較少。

代謝組學是一項高效多靶點的研究生物體在某個階段各種小分子代謝產(chǎn)物及其動態(tài)變化的技術(shù),可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學[14]。靶向代謝組學利用前期已建立的代謝物數(shù)據(jù)庫,能夠?qū)δ繕舜x物進行絕對定量分析,具有準確度高、特異性強等優(yōu)點[15]。非靶向代謝組學可以全面分析生物體內(nèi)的已知、未知代謝物,并進行定量分析,從而對生物現(xiàn)象進行總體認識,有利于發(fā)現(xiàn)新的代謝通路[16]。近些年來,基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學在植物研究領(lǐng)域受到廣泛重視,已大量應用于氮素變化對植物影響的研究中[17-18]。Das et al.[19]研究了干旱和熱脅迫下大豆葉片中代謝物的變化,結(jié)果表明,調(diào)節(jié)碳水化合物代謝、氨基酸代謝、肽代謝、嘌呤和嘧啶生物合成的各種細胞過程的代謝產(chǎn)物都受到顯著影響。

本研究通過非靶向代謝組學技術(shù),對低濃度、高濃度銨態(tài)氮脅迫處理的柳樹苗根系的整體代謝物動態(tài)變化進行分析,并進一步分析差異代謝物參與的代謝通路與生物學功能,有助于了解銨態(tài)氮脅迫處理柳樹的機理,為將來提高柳樹的抗逆水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本研究使用柳樹無菌苗,在江蘇省林業(yè)科學研究院的溫室中進行充氧水培,水培盒容積為10 L,初始水培溶液為1/8霍格蘭營養(yǎng)液,培養(yǎng)溫度為10～25 ℃,光強為2 000 lx,光照時間為06:00—18:00。水培20 d,水培苗平均株高達15～20 cm,挑選其中生長一致的水培苗開始脅迫處理。設(shè)置3種處理方式:低質(zhì)量濃度(2 mg·L-1的NH4Cl溶液)銨態(tài)氮脅迫、高質(zhì)量濃度(20 mg·L-1的NH4Cl溶液)銨態(tài)氮脅迫、對照處理(無銨態(tài)氮脅迫),在3種處理中分別放入10株水培苗,設(shè)置3個重復。每周更換1次培養(yǎng)液,培養(yǎng)5周后,收割不同處理的水培苗根部,液氮保存。

主要試劑:甲醇、水、甲酸、乙腈,均購自Sigma公司,且達到色譜純級別。

樣品處理:將前期準備好的銨態(tài)氮脅迫處理的柳樹幼苗樣品,每個樣品稱取500 mg,放入5 mL離心管中。向離心管中加入2顆小鋼珠和2.5 mL冷甲醇溶液(V(甲醇)∶V(水)=4∶1),在冰箱內(nèi)-80 ℃預冷2 min后,放入研磨機中研磨(60 Hz)2 min,取出后超聲提取30 min,隨后高速離心(12 000 r·min-1,4 ℃)10 min,取上清液裝入新的離心管中。把所有樣本的提取液等體積混合制備成質(zhì)控樣本,每個質(zhì)控樣本的體積與樣本相同。用冷凍濃縮離心干燥器揮干樣品,然后用200 μL甲醇溶液(V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)=80∶19∶1)充分復溶,經(jīng)過0.22 μm濾頭過濾,將樣品轉(zhuǎn)移到樣品瓶中,待上機。

色譜條件:流動相A是水(含體積分數(shù)0.1%甲酸),B是乙腈(含體積分數(shù)0.1%甲酸);色譜柱,ACQUITY UPLC BEH C18(100.0 mm×2.1 mm,1.7 μm);按照體積比進行梯度洗脫,洗脫梯度0～1.0 min、體積分數(shù)為2%的乙腈,2.0～4.0 min、體積分數(shù)25%～60%的乙腈,7.5～12.5 min、體積分數(shù)90%～99%的乙腈,12.7～16.0 min、體積分數(shù)2%的乙腈。柱溫45 ℃,流速0.4 mL·min-1,進樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)正、負離子模式分別掃描進行樣品質(zhì)譜信號采集,毛細管電壓3 kV或-2.5 kV,采樣錐40 V,震源偏移80 V,源溫120 ℃,脫溶劑溫度450 ℃,脫溶劑氣流800 L·h-1,錐孔氣流50 L·h-1,掃描時間0.1 s。

使用MassLynx 4.1軟件進行數(shù)據(jù)處理;使用代謝組學分析軟件(Progenesis QI V2.3)對原始數(shù)據(jù)進行定性、相對定量分析;采用統(tǒng)計學分析軟件(Ezinfo 3.0)進行統(tǒng)計學分析,包括主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)、S-Plot分析、差異倍數(shù)分析等。差異代謝物篩選標準同時滿足以下條件:P≤0.05,VIP值>1,S-Plot值>0.8或<-0.8,差異倍數(shù)>2.5倍或<0.4倍。將獲得的差異代謝物通過京都基因與基因組百科全書(KEGG,https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫進行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 可信度統(tǒng)計分析

基于主成分分析可以觀察3種處理組(對照處理、質(zhì)量濃度2、20 mg·L-1的銨態(tài)氮)間的差異。主成分分析結(jié)果中正離子、負離子模式下,同一處理組內(nèi)的多個重復樣品聚集在一起,表明樣品具有較好的實驗代表性,可信度較好(圖1)。此外,不同處理樣品均間隔較遠,分離明顯,表明不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理的柳樹幼苗樣品和對照樣品具有特定的代謝譜。

圖1 不同處理樣品和質(zhì)控樣品的主成分分析

2.2 差異代謝物的篩選與鑒定

為了提高代謝物的差異可靠性,本研究以差異倍數(shù)>2.5倍或<0.4倍為標準,進行差異分析。結(jié)果表明,與對照樣品相比,低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(2 mg·L-1)脅迫處理的柳樹幼苗根系樣品中篩選出28種差異顯著的代謝物(表1),包括12種上調(diào)、16種下調(diào)的代謝物。上調(diào)的代謝物主要包括(S)-大風子油酸、氟考酸、α-亞麻酸、葫蘆素F、葫蘆素O、攀打胺等,其中(S)-大風子油酸的上調(diào)倍數(shù)最高。此外,下調(diào)的代謝物主要包括去氫保幼酮、大黃素甲醚8-梔子苷、β-天麻素、尿膽素原、皂皮酸等,其中,去氫保幼生物酮的下調(diào)倍數(shù)最高,在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫時降低了178倍。

表1 低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(2 mg·L-1)處理時鑒定的差異代謝物

采用相同的方法,在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(20 mg·L-1)脅迫處理的柳樹幼苗根系樣品中篩選出216種差異顯著的代謝物,差異變化較大的前30個代謝物見表2,其數(shù)量顯著比低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時鑒定到的差異代謝物數(shù)量多,表明銨態(tài)氮的質(zhì)量濃度越高,對柳樹幼苗根系的代謝物影響越大。進一步對高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理的差異代謝物進行分析,上調(diào)代謝物有117種,占種類比為54%;下調(diào)代謝物有99種,占種類比為46%?；诓町惐稊?shù),上調(diào)倍數(shù)最高的10種代謝物包括絲石竹皂甙元、皂皮酸、葫蘆素F、葫蘆素O、去氫保幼酮、大豆皂醇F、保幼激素三酸、5,6-去氫羽扇豆堿、美普清、葫蘆素L,其中絲石竹皂甙元在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時,上調(diào)了310倍。下調(diào)倍數(shù)最高的10種代謝物包括N-2-乙?；顾?、他非諾喹、氟考酸、弗斯特羅定、十三酸、3b-石膽酸、納德米定、金鏈菌素、噻前列素、羥甲睪酮,其中N-2-乙?；顾卦诟哔|(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時,下調(diào)了3 329倍。

表2 高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(4 mg·L-1)處理鑒定的前30個差異代謝物

2.3 不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮處理的差異代謝物比較

將低質(zhì)量濃度、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理鑒定出的差異代謝物進行比較,發(fā)現(xiàn)有21種代謝物在低、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時都呈現(xiàn)顯著差異,其中葫蘆素F、葫蘆素O、攀打胺這3種代謝物在不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時均上調(diào),但在高質(zhì)量濃度處理時的上調(diào)倍數(shù)更高;此外,β-天麻素、玉米赤霉醇、3b-石膽酸、十三酸這4種代謝物在不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時均下調(diào)。剩余的14種代謝物在低、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理的變化趨勢截然相反。除了上述21種代謝物在低、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時都呈現(xiàn)差異,有7種代謝物只在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮處理呈現(xiàn)差異,且均為下調(diào);另外193種代謝物只在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理顯著差異,表明不同質(zhì)量濃度的銨態(tài)氮脅迫處理導致柳樹幼苗根系中的代謝物變化差異較大。有研究報道,糖、多元醇、脂肪酸類小分子物質(zhì)的積累可以有效調(diào)節(jié)植物細胞滲透壓,提高細胞膜的穩(wěn)定性,是植物應對氮素脅迫、鹽脅迫等逆境環(huán)境的一種有效策略[20]。在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理,柳樹幼苗根系中的UDP-葡萄糖(上調(diào)2.61倍)、大豆皂醇A(上調(diào)12.37倍)、大豆皂醇F(上調(diào)49.02倍)、阿法前列醇(上調(diào)8.26倍)、澤瀉醇A(上調(diào)3.24倍)、表二氫膽甾醇(上調(diào)2.99倍)以及保幼激素三酸(上調(diào)39.99倍)、密擠青霉酸(上調(diào)13.51倍)、夫西地酸(上調(diào)10.44倍)、藤黃酸(上調(diào)6.73倍)等脂肪酸均上調(diào),表明上述代謝物的積累是柳樹幼苗應對銨態(tài)氮脅迫的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2.4 差異代謝物的通路分析

為了進一步研究低質(zhì)量濃度、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理對柳樹幼苗根系的影響,將上述鑒定到的差異代謝物比對京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫,并進行通路富集分析。在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理,差異代謝物主要分布在9條代謝途徑中;而在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理,差異代謝物主要分布在64條代謝途徑中,表明高質(zhì)量濃度的銨態(tài)氮處理影響了柳樹根系的多條代謝通路。其中最富集的代謝通路包括次生代謝產(chǎn)物的合成、α-亞麻酸的代謝、植物激素的合成、植物激素的信號轉(zhuǎn)導、谷胱甘肽代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、萘的降解、倍半萜和三萜類化合物的合成、糖胺聚糖生物合成、嘌呤代謝、類胡蘿卜素的生物合成等。將上述富集的代謝通路與相關(guān)組件、關(guān)鍵酶進行整合(圖2),相對聚集的代謝通路包括不飽和脂肪酸的生物合成、植物激素的合成與信號轉(zhuǎn)導、α-亞麻酸的代謝、糖胺聚糖生物合成,表明柳樹幼苗根系主要通過調(diào)節(jié)上述代謝通路來應對銨態(tài)氮脅迫。

morphine addiction為嗎啡癮;adenosine為腺苷酸;glutathionylspermidine為谷胱甘肽亞精胺;glutathione metabolism為谷胱甘肽代謝;glutathione disulfide為谷胱甘肽二硫化物;3beta,5beta-ketodiol為3β,5β-酮脂酰;insect hormone biosynthesis為昆蟲激素生物合成;juvenile hormone III acid為幼激素III酸;stearidonic acid為硬脂酸;etherolenic acid為羥乙磷酸;alpha-linolenic acid metabolism為α-亞麻酸代謝;colnelenic acid為亞麻酸;17-hydroxylinolenic acid為α-羥基油酸;(6Z,9Z,12Z)-octadecatrienoic acid為(6Z,9Z,12Z)-十八碳三烯酸;biosynthesis of unsaturated fatty acids為不飽和脂肪酸生物合成;plant hormone signal transduction為植物激素信號轉(zhuǎn)導;salicylate為水楊酸鹽;brassinolide為油菜素內(nèi)酯;biosynthesis of plant hormones為植物激素生物合成;(9Z,12Z,15Z)-octadecatrienoic acid為(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸;glycosaminoglycan biosynthesis為糖胺聚糖生物合成;heparan sulfate/heparin為硫酸乙酰肝素;adenosine 3’,5’-bisphosphate為3’,5’-二磷酸腺苷;chondroitin sulfate/dermatan sulfate為硫酸軟骨素/硫酸皮膚素;indole為吲哚;benzoxazinoid biosynthesis為苯并惡唑嗪酮生物合成。

3 討論與結(jié)論

氮素是農(nóng)林植物生長所需的重要營養(yǎng)元素,對生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。銨態(tài)氮作為植物生長所需的主要無機氮源,能與光合作用產(chǎn)物有機酸直接結(jié)合形成氨基酸和一些含氮有機化合物[21-22]。適量的銨態(tài)氮對植物是有益的,但當銨態(tài)氮過量存在時,會對大多數(shù)植物的生長產(chǎn)生毒性。柳樹作為一種具有生物量大、抗性強等特征的喬木,其在園林綠化、生態(tài)修復等方面發(fā)揮了重要作用。在此背景下,研究柳樹根系對銨態(tài)氮脅迫的影響,將為柳樹的遺傳改良和科學培育提供重要借鑒。

本研究采用非靶向代謝組學技術(shù),對正常培養(yǎng)與不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮處理時的柳樹幼苗根系的代謝物進行比較,從代謝組學角度出發(fā)篩選出關(guān)鍵的差異代謝物,研究銨態(tài)氮脅迫處理柳樹根系的代謝物變化。低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(2 mg·L-1)處理,鑒定出28種差異代謝物,說明低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮對柳樹根系的影響較小;而高濃度銨態(tài)氮(20 mg·L-1)脅迫處理,鑒定出216種差異代謝物,說明高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮對柳樹根系的影響較大?；谥暗难芯繄蟮?銨態(tài)氮過量存在時,對大多數(shù)植物產(chǎn)生毒害作用[23],因此,高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮對柳樹幼苗根系也是有害的。篩選出的差異代謝物中,包括UDP-葡萄糖、大豆皂醇A、大豆皂醇F、阿法前列醇、澤瀉醇A、表二氫膽甾醇以及保幼激素三酸、密擠青霉酸、夫西地酸、藤黃酸等脂肪酸均上調(diào),這些代謝物的積累可以有效調(diào)節(jié)植物細胞滲透壓,提高細胞膜的穩(wěn)定性,是柳樹根系應對銨態(tài)氮脅迫的一種有效策略。對差異代謝物進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫通路分析,結(jié)果表明,鑒定出的差異代謝物主要參與次生代謝產(chǎn)物的合成、α-亞麻酸的代謝、植物激素的合成、植物激素的信號轉(zhuǎn)導、谷胱甘肽代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、萘的降解、倍半萜和三萜類化合物的合成、糖胺聚糖生物合成、嘌呤代謝、類胡蘿卜素的生物合成等。綜上所述,本研究為挖掘和尋找銨態(tài)氮脅迫處理柳樹根系的關(guān)鍵代謝物提供了參考,并闡明了這些代謝物是通過參與一些重要的代謝通路,來進行調(diào)節(jié)和應對,這為進一步培育出高效抗逆的柳樹新種質(zhì)提供了數(shù)據(jù)支撐。