趙會敏 姚新轉 張傳明 呂立堂

(貴州大學,貴陽,550025)

城鄉(xiāng)綠化土壤中的氮元素分布并不均勻[1],過量的補充氮素也會對土壤環(huán)境造成影響[2],這為人工補充氮元素帶來了極大的困難。同時,氮素作為植物生長和生產中的限制性養(yǎng)分之一,缺少或過量都會對其生長和發(fā)育產生嚴重影響[3-4]。因此,培育可以耐受低氮環(huán)境的林木品種,對于城鄉(xiāng)綠化具有重要意義。楊樹是林業(yè)研究領域的模式植物,其基因組相對較小,易于進行遺傳研究;同時其適應性強,生長速度快,具有優(yōu)良的實驗特性,已利用基因工程技術對其進行了抗病蟲、抗寒凍、抗旱、抗鹽堿等機制研究[5-6]。由于具有樹干通直挺拔、根系發(fā)達、枝葉長勢繁茂、抗寒抗旱能力強、生長速度快、壽命長等優(yōu)點,被廣泛用于速生用材林和防護林[7]。有研究發(fā)現(xiàn),毛楊樹具有較強的抗空氣中粉塵及有毒氣體的效果[8],是一種比較理想的城鄉(xiāng)綠化樹種。

由于植物吸收、同化和利用土壤中的氮是通過多種途徑進行的[9],而高親和、低親和的硝酸鹽轉運系統(tǒng)同化和吸收硝態(tài)氮是其主要途徑[10-11]。通常情況下,植物通過低親和轉運系統(tǒng)調控高氮環(huán)境中氮的吸收同化,通過高親和轉運系統(tǒng)調控低氮環(huán)境中氮的吸收同化[12]。因此,利用植物這種調節(jié)自身相關基因表達量以適應外界低氮脅迫環(huán)境的作用機制[13],通過轉入外源基因誘導植物氮代謝相關基因表達量發(fā)生變化[14],是一種切實有效的提高植物氮素利用率的途徑[15]。Fang et al.[16]在對低親和力硝酸根轉運家族PTR/NRT1(NPF)中的小肽轉運蛋白OsPTR9進行研究時發(fā)現(xiàn),OsPTR9在水稻各個組織均有表達,其表達量與外源氮素含量具有明顯的相關性;同時,在同樣條件下培養(yǎng)的OsPTR9基因的超表達、RNA干涉和敲除植株,其氮素吸收利用和相關表型與野生型植株出現(xiàn)了明顯差異,并且其表達量與水稻吸收銨密切相關。

小肽轉運蛋白OsPTR9可以促進水稻中銨的吸收并提高其氮代謝效率,但關于其在木本植物中的功能的研究較少。為此,本研究以三倍體毛白楊(PopulusL.)為試驗研究對象,采用農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的遺傳轉化方法將OsPTR9基因轉入楊樹中,經聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定獲得15株轉基因植株;以野生型楊樹無菌苗葉片為材料進行遺傳轉化繼代培養(yǎng)的野生型楊樹無菌組培苗為對照;參考霍格蘭營養(yǎng)液配方配置低氮營養(yǎng)液,選取長勢基本一致的4個楊樹株系進行低氮脅迫處理,觀測其低氮脅迫表型、測定其氮磷鉀質量分數(shù)和氮代謝相關基因表達量,分析轉基因楊樹植株對低氮環(huán)境的耐受性。旨在為探索楊樹應對低氮脅迫的調控機制、后續(xù)開展植物的氮調控相關研究提供參考。

1 材料與方法

試驗所用毛白楊品種為三倍體毛白楊(PopulusL.),來源于金華職業(yè)技術學院師范學院,培養(yǎng)條件:光周期為16 h光照(28 ℃)、8 h黑暗(25 ℃),光合有效輻射為90 μmol·m-2·s-1。

OsPTR9超表達載體委托武漢伯遠生物有限公司構建,農桿菌菌株LB4404由本實驗室保存,相關引物由北京攀科新業(yè)生物技術有限公司合成。

楊樹遺傳轉化及分子鑒定方法:采用農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的遺傳轉化方法轉化楊樹[17]。以野生型楊樹無菌苗葉片為材料進行遺傳轉化,4周后愈傷組織長出,進行繼代培養(yǎng)獲得抗性芽,抗性芽長至2～3 cm,然后將抗性芽切下,置于生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。4周后待無菌苗長至7～10 cm煉苗2 d后移栽到礫土盆中。從楊樹葉片中提取DNA,利用OsPTR9基因序列設計檢測引物。

低氮脅迫楊樹幼苗的試驗設計:參考霍格蘭營養(yǎng)液配方[18],配置低氮營養(yǎng)液(見表1)。楊樹轉基因幼苗和野生型幼苗移栽培養(yǎng)初期,施加低氮營養(yǎng)液100 mL/盆,同時補充適量的硝酸銨,待其生長穩(wěn)定后,逐步削減硝酸銨補加量,直至降為0.01 mg/L后,開始進行低氮脅迫處理。植株低氮處理期間,低氮營養(yǎng)液3 d添加1次,同時補充足量水分;處理60 d后,觀察超量表達OsPTR9基因的楊樹與野生型楊樹的表型差異;采取楊樹頂端往下的第四片葉片,液氮速凍后,-80 ℃保存用于后續(xù)試驗。

表1 借鑒霍格蘭營養(yǎng)液配方配置的低氮營養(yǎng)液配方的各種化合物溶液的母液添加量

低氮脅迫處理后楊樹氮、磷、鉀質量分數(shù)測定方法:將保存在-80 ℃的楊樹葉片樣本烘干研磨粉碎后,采用消煮法檢測其氮、磷、鉀質量分數(shù)。用H2SO4-H2O2消解樣品后,應用凱氏定氮儀在堿性條件下(NaOH)測定N元素質量分數(shù),應用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法定量測定P元素質量分數(shù),應用NH4OAc浸提-火焰光度計法定量測定K元素質量分數(shù)[19-20]。

氮代謝途徑相關基因表達量檢測方法:提取保存在-80 ℃的楊樹葉片總RNA,反轉錄得到cDNA。以Actin為內參基因,利用熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測氮代謝相關基因的相對表達量[17],引物見表2。

表2 相關基因反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)引物序列

數(shù)據處理:采用EXCEL軟件、GraphPad Prism 8對試驗數(shù)據進行處理,試驗經3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 轉基因楊樹植株的獲得

長勢基本一致的8株超量表達OsPTR9基因的楊樹,聚合酶鏈式反應鑒定結果均為陽性(見圖1),表明OsPTR9基因成功導入楊樹中;對進行低氮脅迫處理的4個轉基因株系中OsPTR9基因的定量結果(見表3),表明OsPTR9基因在楊樹中超量表達。

WT為野生型楊樹植株;LN1～LN8為8株超量表達OsPTR9基因的楊樹植株。

表3 OsPTR9基因在楊樹不同株系中的表達量

2.2 超量表達OsPTR9基因對低氮脅迫時楊樹生長發(fā)育的影響

選取3個超量表達OsPTR9基因的楊樹株系(LN1、LN2、LN3)進行低氮耐受型試驗,發(fā)現(xiàn)低氮脅迫處理28 d后,野生型楊樹幼苗出現(xiàn)了明顯的低氮癥狀,葉片泛黃、枯萎、直至脫落;超量表達OsPTR9基因的楊樹幼苗無明顯低氮癥狀(見圖2)。此外,選取低氮脅迫60 d后的1個株系(LN4)和野生型楊樹,觀察表型發(fā)現(xiàn),野生型楊樹葉片偏小(見圖3a)、植株矮小(見圖3b),發(fā)育遲緩;而轉OsPTR9基因楊樹葉片偏大(見圖3a)、植株健壯(見圖3b)。其中,LN4株系最大葉片長度為野生型最大葉片長度的1.8倍、最大葉片寬度為野生型最大葉片寬度的2.4倍、株高為野生型株高的2.1倍(見表4)。表明超量表達OsPTR9基因提高了楊樹對低氮脅迫的耐受性,可以有效促進低氮脅迫時楊樹的生長發(fā)育。

WT為野生型楊樹植株;LN1、LN2、LN3為3株超量表達OsPTR9基因的楊樹植株。

WT為野生型楊樹植株;LN4為超量表達OsPTR9基因的楊樹植株。

表4 低氮脅迫處理60 d后野生型、轉基因型楊樹的葉片尺寸和植株高度

2.3 轉基因型楊樹與野生型楊樹葉片的氮、磷、鉀質量分數(shù)差異

超量表達OsPTR9基因的楊樹葉片氮、磷、鉀質量分數(shù),均高于野生型楊樹(見表5),其中氮質量分數(shù)增加了15%、磷質量分數(shù)增加了19%、鉀質量分數(shù)增加了21%;說明超量表達OsPTR9基因,可以促進植物在葉片儲存更多的N、P、K,緩解低氮脅迫時的生存壓力。

表5 低氮脅迫處理60 d后野生型楊樹和轉基因型楊樹葉片的氮、磷、鉀質量分數(shù)

2.4 超量表達OsPTR9基因對楊樹中氮代謝相關基因表達的影響

為進一步分析超量表達OsPTR9基因在楊樹低氮脅迫時的作用機制,對轉基因和野生型楊樹中一些氮代謝相關基因的相對表達量進行了檢測。結果表明,楊樹中氮代謝相關基因在轉基因株系和野生型中的表達量出現(xiàn)了明顯差異(見表6)。其中,轉基因株系中,高親和力硝酸鹽轉運蛋白(NRT2.5)基因表達量,為野生型的10.6倍;高親和力鉀轉運蛋白(HAK5)基因的表達量,為野生型的1.9倍;谷氨酸合成酶(GOGAT1、GOGAT2)基因表達量,是野生型的1.5倍、2.7倍;谷氨酰胺合成酶(GS1.1、GS1.2、GS1.3、GS2)基因表達量,是野生型的79.7倍、10.9倍、27.2倍、5.3倍;PTR1.2、PTR2.11、PTR3.1、PTR6.3基因表達量,分別為野生型的3.6倍、2.2倍、2.1倍和2.5倍。綜合以上結果,說明超量表達OsPTR9基因促進了楊樹中氮代謝相關基因的表達;促進高親和力硝酸鹽轉運蛋白、谷氨酰胺合成酶基因的高表達,是OsPTR9基因調控楊樹在低氮脅迫時生長發(fā)育的主要途徑。

表6 氮代謝相關基因在轉基因型株系和野生型楊樹中的表達量

3 討論與結論

超量表達氮代謝相關的基因,是一種非常有效的可以改變植物低氮耐受性的方法。在煙草[21]、擬南芥[14]等模式植物中得到了驗證。本研究將水稻中發(fā)現(xiàn)的與氮吸收和氮代謝相關的OsPTR9基因[16],通過農桿菌介導的葉盤轉化法導入楊樹中,隨后對獲得的轉基因楊樹進行低氮脅迫處理。結果表明,轉OsPTR9基因楊樹表現(xiàn)出了明顯的低氮耐受性,缺氮癥狀出現(xiàn)時間比野生型明顯延后,低氮處理時生長狀況明顯優(yōu)于野生型,說明OsPTR9基因可以提高植物對低氮脅迫的耐受性;但其相應的作用機制尚待進一步的研究。

氮、磷、鉀對植物的生長發(fā)育和抗逆性有著重要的影響。通常情況下,植物在低氮脅迫時,會通過減少磷的攝入降低代謝水平,以維持其基本的生存[22],促進鉀的吸收以提高氮利用率[23-24]。而葉片作為植物儲存和同化氮磷鉀的重要器官,葉片氮磷鉀質量分數(shù)可以在一定程度上反映出植物整體的氮磷鉀質量分數(shù)[25]。已有研究表明,OsPTR9的表達受銨態(tài)鹽的調控,并且OsPTR9基因表達量降低對植株冠根、株高、生長量有負面影響[16]。本研究結果表明,低氮處理后轉基因楊樹植株高度和葉片大小,顯著高于野生型;轉基因葉片中的氮磷鉀質量分數(shù),顯著高于野生型。在低氮環(huán)境下超量表達OsPTR9基因促進了銨的攝取,增加了根中和葉片中的氨基酸質量分數(shù),保證了楊樹植株正常的生長發(fā)育,并使其生物量增加,從而提高楊樹的耐受性。但目前對于氮、磷、鉀在葉片存儲量的增加,是通過從外界環(huán)境中吸收氮、磷、鉀這一途徑,還是通過提高楊樹中氮、磷、鉀的代謝效率從而降低氮、磷、鉀的損耗的方式,還有待探究。