佘姣姣，張寶獻，龔志明，何小鋒，劉澤彬，高 語，譚 娜，劉 利，楊 柳

（華蘭生物工程重慶有限公司，重慶 408100）

熱原是人血白蛋白質(zhì)量檢測的重點項目之一。在人血白蛋白的整個生產(chǎn)過程中，包括采漿融漿、分離純化、超濾濃縮、制備原液、稀配半成品和分裝成品等生產(chǎn)環(huán)節(jié)。其中越接近最終成品的環(huán)節(jié)越容易引入細菌內(nèi)毒素，可以直接進入成品的成分、分裝成品的內(nèi)包材和環(huán)境為檢查重點。制備半成品所使用的原液、制備原液前相關環(huán)節(jié)（如純化環(huán)節(jié)、超濾環(huán)節(jié)）的取樣、原輔料（如稀配成品的溶液、穩(wěn)定劑）、半成品和分裝用的內(nèi)包材均為重點檢測樣品。目前，各生產(chǎn)單位多以細菌內(nèi)毒素檢查法對人血白蛋白進行熱原檢查。由于鱟試劑的特異性，相關人血白蛋白生產(chǎn)過程pH 值的變化較大，這可能對內(nèi)毒素的檢測造成影響，從而引起假陰性；鱟試劑靈敏度改變、檢查用水中內(nèi)毒素含量超標、反應條件（空氣流動性、pH）及內(nèi)毒素工作標準品的穩(wěn)定性差均可影響檢測結果；人血白蛋白中組成成分極其復雜，任何離子干擾（Fe3+、Al3+等離子）或非內(nèi)毒素的鱟反應等都可能造成假陽性[1-2]。目前，中國藥典中并沒有針對細菌內(nèi)毒素檢查法假陰性和假陽性問題的有效解決方案，只能在實驗中采用適當?shù)姆椒ㄏ驕p少假陰性和假陽性的出現(xiàn)。有研究指出，可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過過濾、中和、透析、加熱處理等方法排除相關干擾。本文以《中國藥典》（四部）2020 年版（以下簡稱《中國藥典》）通則中的“1143 細菌內(nèi)毒素檢查法”“9251細菌內(nèi)毒素檢查法”為指導原則，采用凝膠法對人血白蛋白熱原檢測所需的鱟試劑生產(chǎn)廠家、靈敏度，供試品稀釋倍數(shù)進行選擇，旨在為建立該品種的細菌內(nèi)毒素檢查法提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CU-600 型電熱恒溫水槽( 武漢恒豐中欣生物有限公司)；T246 型漩渦混合儀振蕩器( 上海瀚默機電科技有限公司)；SFG-02B 型電熱恒溫鼓風干燥箱( 湖北恒豐醫(yī)療制藥設備有限公司) ；其他器皿包括試管、移液器及移液器配套的槍頭(無熱原) 等。

1.2 藥品與試劑

人血白蛋白〔Human Albumin；批號202008056，規(guī)格：10 g/ 瓶（10 g/L，50 mL）；批號202008058，規(guī)格：10 g/ 瓶（10 g/L，50 mL）；批號202008059，規(guī)格：10 g/ 瓶（10 g/L，50 mL）；批號202008057，規(guī)格：5 g/ 瓶（5 g/L，50 mL）；批號202008060，規(guī)格：5 g/ 瓶（5 g/L，50 mL）；批號202008063，規(guī)格：5 g/ 瓶（5 g/L，50 mL）〕；鱟試劑(A 廠家，0.03 EU·mL-1、批號2006122，0.06 EU·mL-1、批號2002213/2009093/2012243，0.125 EU·mL-1、批號2005062，0.25 EU·mL-1、批號2003112，規(guī)格0.1 mL/支；B 廠家，0.03 EU·mL-1、批號20081029，0.06 EU·mL-1、批號20051022，0.125 EU·mL-1、批號20091032，0.25 EU·mL-1、批號20081030，規(guī)格0.1 mL/ 支) ；細菌內(nèi)毒素工作標準品(A 廠家，批號1912102，規(guī)格10 EU/支)；細菌內(nèi)毒素檢查用水(Water for Bacterial Endotoxins Test，以下簡稱BET 水，A 廠家，批號1906270，規(guī)格5 mL/ 支)。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

A、B 兩個廠家分別取4 批鱟試劑靈敏度的標示值(λ)，將細菌內(nèi)毒素工作標準品用BET 水溶解，置漩渦混合器上混勻5 min，然后制成濃度為2 λ、1 λ、0.5 λ 和0.25 λ 四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應在漩渦混合器上混合30 s。取不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，分別與等體積（0.1 mL）的鱟試劑溶液混合，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4 管；另外取2管加入等體積的BET 水作為陰性對照。按《中國藥典》通則中“1143 細菌內(nèi)毒素檢查法”復核本試驗所用鱟試劑的靈敏度，結果兩個廠家各4 批鱟試劑靈敏度的測定值(λc)均在0.5 ～2.0 λ 范圍內(nèi)，符合《中國藥典》中的規(guī)定，可用于細菌內(nèi)毒素檢查，詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果匯總

2.2 確定供試品最大有效稀釋倍數(shù)

我司主要在產(chǎn)的人血白蛋白的規(guī)格分別為蛋白質(zhì)濃度5 g/L、10 g/L，《中國藥典》（三部）2020 年版人血白蛋白檢定規(guī)程中規(guī)定其細菌內(nèi)毒素限值（L）應分別小于0.83 EU/mL、1.67 EU/mL。按《中國藥典》2020 年版通則中的“1143 細菌內(nèi)毒素檢查法”的規(guī)定，MVD=cL/λ，計算各靈敏度鱟試劑對應的樣品最大有效稀釋倍數(shù)(Maximum Valid Dilution，MVD) ：MVD0.03=27(5 g/L)、MVD0.03=55(10 g/L)、MVD0.06=13(5 g/L)、MVD0.06=27(10 g/L)、MVD0.125=6(5 g/L)、MVD0.125=13(10 g/L)、MVD0.25=3(5 g/L)、MVD0.25=6(10 g/L)；在不超過對應MVD 的稀釋倍數(shù)下進行細菌內(nèi)毒素檢查。

2.3 干擾試驗

采用A 廠家和B 廠家兩個廠家的鱟試劑，4 種靈敏度（0.03 EU/mL、0.06 EU/mL、0.125 EU/mL、0.25 EU/mL）對5 g/L 和10 g/L 人血白蛋白待包裝產(chǎn)品各3批進行干擾試驗確認。5 g/L 的產(chǎn)品加BET 水分別稀釋至初始濃度的1、6、13、27 倍備用；10 g/L 的產(chǎn)品加BET 水分別稀釋至初始濃度的2、13、27、55 倍備用。以相應供試品溶液作稀釋用液將細菌內(nèi)毒素標準品逐步配制成干擾試驗系列溶液：2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ；將細菌內(nèi)毒素標準品用BET 水逐步配制成鱟試劑標示靈敏度對照系列溶液：2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ。按細菌內(nèi)毒素檢查法進行干擾試驗，結果見表2。

表2 人血白蛋白鱟試劑干擾試驗結果

由表2 可知，靈敏度為0.06 EU/mL 的鱟試劑用于檢測人血白蛋白熱原的效果最佳，具有高靈敏度、少稀釋的優(yōu)勢。試驗結果表明，人血白蛋白對鱟試劑多表現(xiàn)為陰性干擾，即常出現(xiàn)假陰性，這可能與人血白蛋白中含有螯合劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑等有關。另外，不同規(guī)格人血白蛋白的干擾物質(zhì)有差異。

2.4 中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素檢查

我司人血白蛋白的生產(chǎn)工藝流程是：由融漿經(jīng)分離純化、超濾濃縮等步驟制備原液，再由原液加穩(wěn)定劑及稀釋液等稀配成半成品，再將經(jīng)巴氏滅活的半成品分裝為待包裝產(chǎn)品。生產(chǎn)過程中超濾等步驟可有效控制熱原含量。有研究指出，巴氏滅活也可一定程度降低熱原含量[3]。因此，理論上人血白蛋白待包裝產(chǎn)品的熱原含量最低。取5 g/L、10 g/L 人血白蛋白半成品、原液、待包裝產(chǎn)品為供試品，使用靈敏度λ 為0.06 EU·mL-1的鱟試劑，按所建立方法進行細菌內(nèi)毒素檢查，結果見表3、表4。

表3 5 g/L 中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素檢查結果

表4 10 g/L 中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素檢查結果

結果表明，待包裝產(chǎn)品的熱原含量最低，原液與半成品的熱原含量無必然關系。這是由于生產(chǎn)過程中原液經(jīng)超濾濃縮濾去了熱原物質(zhì)，但在配制半成品的過程中有添加輔料，存在引入熱原物質(zhì)的風險。因此，試驗結果與生產(chǎn)實際相符。

3 討論

由于人血白蛋白生產(chǎn)過程需要加入多種穩(wěn)定劑和稀釋液，因此其組成成分極為復雜。大分子量血漿蛋白的疏水基團結合脂多糖影響內(nèi)毒素活性、含有絲氨酸蛋白酶、Fe3+、Al3+等的干擾[4-5]以及非內(nèi)毒素的鱟反應均可能造成檢測結果的假陽性和假陰性，本文在盡可能少處理樣品的前提下，選出了適宜規(guī)格的鱟試劑及供試品稀釋方法。本次試驗結果表明，在對供試品作最少處理的前提下，選用靈敏度λ 為0.06 EU·mL-1的鱟試劑，可適應人血白蛋白細菌內(nèi)毒素檢查的不同質(zhì)量控制要求，具有簡便、靈敏、快速、準確等優(yōu)點。另外，巴氏滅活也可一定程度降低熱原含量。