向軍軍 秦紅玲 盧健鋒 楊璧璘 鄧秋媚 陳煒 胡躍強(qiáng)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023;2.南寧市第一人民醫(yī)院,廣西 南寧 530023;3.廣西賀州市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 賀州 530023;4.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530023)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)已成為了繼阿爾茨海默病后最常見的癡呆類型[1-2],然其具體發(fā)病機(jī)制尚未明了,目前認(rèn)為神經(jīng)元和突觸可塑性損傷可能是導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵因素[3]。

研究[4-6]表明,Ras同源基因?qū)嶒?yàn)成員(Ras homolog gene family member A, RhoA)/Rho關(guān)聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶2(Rho-associated coiled coil-forming protein kinase 2,ROCK2)通路是參與大腦神經(jīng)軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵通路,而ROCK2表達(dá)變化與炎癥誘導(dǎo)的突觸可塑性損傷密切相關(guān)。因此,干預(yù)ROCK2基因表達(dá)有望成為治療VaD的新靶點(diǎn)。使用腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)載體表達(dá)短發(fā)夾架構(gòu)RNA(Short hairpin RNA,shRNA)能夠長效敲低基因,具有特異、高效等優(yōu)點(diǎn),且通過血腦屏障效率高,逐漸成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病實(shí)驗(yàn)研究的新熱點(diǎn)[7]。本研究探討AAV9-ROCK2-shRNA對VaD大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用,探索一個(gè)適宜的腺相關(guān)病毒注射滴度,以期實(shí)現(xiàn)對VaD的精準(zhǔn)治療。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑及器材 腺相關(guān)病毒原液AAV9-ROCK2-shRNA(由上海吉滿生物科技有限公司提供);水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號302-17-0);蘇木精-伊紅染色試劑盒由索萊寶有限公司提供;Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海軟隆科技發(fā)展有限公司,型號BW-MMM101);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司,IX73型)大鼠腦立體定位儀(日本成茂公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年SPF級健康雄性SD大鼠40只,體重250±50g,由湖南斯萊克景達(dá)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物許可證號:SCXK湘2019-0004。隨機(jī)分為:正常組、PBS對照組(PBS液體代替病毒制劑)、低滴度組、中滴度組和高滴度組,每組8只,各組大鼠正常喂養(yǎng),術(shù)后4周取材。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物喂養(yǎng)及取材等操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.3 方法

1.3.1 腺相關(guān)病毒稀釋 AAV9-ROCK2-shRNA腺相關(guān)病毒原液的滴度為1.14E+13 VG/mL,按照2倍及10倍稀釋,滴度分別為5.07E+12 VG/mL、1.14E+12 VG/mL。

1.3.2 腦立體定向注射 參照文獻(xiàn)[8],采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法制備VaD模型。造模后第2 d評估模型成功后,立即進(jìn)行立體定位手術(shù),給予注射低滴度、中滴度、高滴度腺相關(guān)病毒4 μL,持續(xù)5 min。注射位置:坐標(biāo)(以前囟為0點(diǎn))-皮質(zhì)(前):向前1.0 mm,右側(cè)旁開2.0 mm,深度1.2 mm;皮質(zhì)(后)向后3.0 mm,右側(cè)旁開1.5 mm,深度1.2 mm;海馬:向后3.5 mm,右側(cè)旁開2.5 mm,深度3.0 mm。PBS對照組則以生理鹽水代替注射。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材及處理 腦立體注射術(shù)后4周,以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定后,取海馬組織,每組中4只行石蠟切片,用于HE染色和Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改變及尼氏小體數(shù)量;另4只進(jìn)行免疫組化觀察炎癥因子IL-1β蛋白表達(dá)情況及綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP),并通過Image Pro Plus 6.0軟件測量分析熒光強(qiáng)度。

1.3.4 轉(zhuǎn)染效率計(jì)算 熒光顯微鏡下直接觀察綠色熒光蛋白GFP)的表達(dá),每張切片隨機(jī)取10個(gè)100倍視野,計(jì)算GFP陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比,即為估算的轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 術(shù)前各組大鼠潛伏期及跨越平臺次數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1周,與正常組比較,PBS對照組潛伏期顯著延長、跨越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05);PBS對照組與低、中、高滴度相互之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后4周,與正常組比較,PBS組潛伏期顯著延長及跨越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05);與PBS組比較,中滴度組潛伏期縮短、跨越平臺次數(shù)增加(P<0.05),低、高滴度組潛伏期及跨域平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與中滴度組比較,低、高滴度組潛伏期延長、跨越平臺次數(shù)減少(P<0.05)。與術(shù)前比較,術(shù)后1周的正常組潛伏期縮短、跨越平臺次數(shù)增加(P<0.05),PBS對照組、低滴度、高滴度組潛伏期與跨越平臺次數(shù)無明顯差異(P>0.05);與術(shù)后1周比較,術(shù)后4周正常組、中滴度組潛伏期時(shí)間縮短、跨越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05),而PBS對照組、低滴度及高滴度組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1周與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮跨越平臺次數(shù)比較Table 1 Comparison of crossing platform times in Morris water maze in each group

2.2 各組HE染色比較 正常組海馬區(qū)神經(jīng)元排列緊湊、飽滿、圓潤,細(xì)胞核清晰;PBS對照組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞排列散亂、稀疏,可見細(xì)胞核腫脹破裂,部分胞漿濃縮;低滴度組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)有明顯改善,但細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰,可見胞膜破裂,仍稍有腫脹;中滴度組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元飽滿、圓潤,胞體較大且胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核清晰,排列緊湊;高滴度組海馬組織區(qū)域結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異常增生及條索化,出現(xiàn)核固縮染色加深。見圖1。

圖1 4周后各組大鼠海馬組織HE染色(100×)Figure 1 HE staining was performed on the hippocampal tissues of each group after 4 weeks注:A.正常組;B.PBS對照組;C.低滴度組;D.中滴度組;E.高滴度組。

圖2 4周后各組大鼠海馬組織Nissl染色(200×)Figure 2 After 4 weeks, Nissl staining was performed on the hippocampus of each group注:A.正常組;B. PBS對照組;C.低滴度組;D.中滴度組;E.高滴度組。

2.3 各組Nissl染色比較 正常組海馬組織中尼氏小體結(jié)構(gòu)排列整齊、緊密,且結(jié)構(gòu)清晰;PBS對照組組織中尼氏小體排列散亂、尼氏小體數(shù)較正常組明顯減少(P<0.05);與PBS組比較,低滴度組神經(jīng)元仍稀疏松散、尼氏小體數(shù)量少差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與低滴度組比較,中滴度組中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、排列整齊,可見豐富的尼氏小體;與中滴度組比較,高滴度組海馬神經(jīng)元損傷程度增加、組織結(jié)構(gòu)不清晰,尼氏小體變小,數(shù)目較中滴度明顯減少(P<0.05)。

2.4 各組海馬組織IL-1β表達(dá)情況比較 IL-1β陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色,背景為淡黃色。正常組海馬區(qū)IL-1β棕色表達(dá)量少;與正常組比較,PBS對照組海馬組織IL-1β蛋白含量高,在海馬各區(qū)陽性表達(dá)多(P<0.001)。與PBS對照組比較,低、中、高組IL-1β表達(dá)明顯減少(P<0.05);與中滴度比較,低、高滴度IL-1β表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 4周后各組大鼠海馬區(qū)IL-1β表達(dá)情況(100×)Figure 3 Four weeks after each rat hippocampus IL-1 beta expression注:A.正常組;B. PBS對照組;C.低滴度組;D.中滴度組;E.高滴度組。

2.5 綠色熒光蛋白在海馬組織中的表達(dá) 不同滴度的腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染腦組織4周后,均可在針道周圍觀察到少量GFP表達(dá),其中陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的綠光。而在PBS對照組中則未見GFP表達(dá)。按照轉(zhuǎn)染率計(jì)算法可得出:低滴度組腺病毒轉(zhuǎn)染效率為(19.79±6.55) %,明顯低于中、高滴度注射組(P<0.05);而與中滴度(28.55±4.22) %比較,高滴度注射組(22.52±8.94)%的轉(zhuǎn)染效率較低,可見有細(xì)胞核破裂,形態(tài)不規(guī)則,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各觀察組轉(zhuǎn)染后4周缺血腦組織GFP表達(dá)(熒光顯微鏡100×)Figure 4 Expression of GFP in ischemic brain tissue 4 weeks after transfection注:A. PBS對照組;B.低滴度組;C.中滴度組;D.高滴度組。

3 討論

海馬神經(jīng)元炎癥損傷作為VaD發(fā)生、發(fā)展的重要因素,已得到普遍認(rèn)可[9];其中IL-1β作為炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要因子,正常生理情況下,其在腦組織內(nèi)的表達(dá)水平極低,而其高表達(dá)在神經(jīng)炎癥發(fā)生、發(fā)展和免疫反應(yīng)中起重要作用[10]。研究[11]表明,在顱腦內(nèi)IL-1β不僅參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生長調(diào)節(jié),也參與病理狀態(tài)下的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷過程,如腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病等。大量分泌的IL-1β可通過多個(gè)環(huán)節(jié)參與神經(jīng)元損傷,最主要是啟動(dòng)多種細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)[12]。文獻(xiàn)[13]報(bào)道,增加的IL-1β可能參與大鼠記憶障礙和抑制長時(shí)程突觸傳遞增強(qiáng)造成學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知障礙。有的研究[14-15]證實(shí),IL-1β的釋放受ROCK2的調(diào)控,因此,敲減或者沉默ROCK2的表達(dá)有可能抑制IL-1β的分泌,從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。本研究結(jié)果也證實(shí)ROCK2-shRNA中劑量組能顯著減少IL-1β陽性細(xì)胞,改善大鼠智能。

AAV載體具有較高的安全性、低免疫原性、可持續(xù)表達(dá)等特性,近年來逐漸成為神經(jīng)系統(tǒng)研究以及基因治療的重要工具之一[16]。但由于載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的限制、脫靶和給藥后中和抗體的產(chǎn)生等阻礙其進(jìn)入靶細(xì)胞,降低轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率,而高濃度的AAV病毒顆粒又可引發(fā)蛋白酶體介導(dǎo)的細(xì)胞降解和病毒顆粒的損失,降低其轉(zhuǎn)染效率。除此之外,AAV在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)時(shí)間也會(huì)對實(shí)驗(yàn)研究觀察周期帶來影響。因此,探索具有轉(zhuǎn)染率高、安全性好、毒副作用少的適宜滴度是當(dāng)前亟需解決的問題[17-19]。本研究采用低、中、高3種不同滴度的AAV9-ROCK2-shRNA進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周,各病毒注射組行為學(xué)、神經(jīng)功能缺損及各項(xiàng)監(jiān)測指標(biāo)均有所改善,而以中滴度組療效最為明顯。這與周斌等[20]采用AVV9病毒觀察對神經(jīng)元保護(hù)作用的影響的研究結(jié)果有相似之處。

本研究結(jié)果提示,可知適宜的腺相關(guān)病毒滴度是影響轉(zhuǎn)染效果的關(guān)鍵因素之一;當(dāng)?shù)味忍?會(huì)造成轉(zhuǎn)染不充分,造成轉(zhuǎn)染率太低,影響效果;當(dāng)?shù)味忍邥r(shí),細(xì)胞會(huì)因毒性太大而出現(xiàn)神經(jīng)元及周圍組織損傷。本研究采用3種滴度證實(shí)不同滴度存在的效果差別,篩選出中滴度可作為適宜的注射滴度,并且在一定程度上證實(shí)AAV9-ROCK2-shRNA成功轉(zhuǎn)染后可有效發(fā)揮其對海馬神經(jīng)元的保護(hù)功能,為后續(xù)研究RhoA/ROCK2信號通路對VaD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

中滴度AAV9-ROCK2-shRNA能高效、穩(wěn)定、低毒地轉(zhuǎn)染大鼠海馬組織,對VaD大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用最優(yōu)。