朱玉紅,張疏桐,李志玲,徐雨蓓,楊雪贏,張貴東,韋國(guó)山,甘 玲,2*,郭建華,2*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,重慶402460;2.西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心,重慶 402460)

牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)是一類多種病原、多種誘因?qū)е碌膫魅拘约膊?可引起牛肺炎、運(yùn)輸熱、支氣管炎等病癥[1],嚴(yán)重危害肉牛養(yǎng)殖業(yè)[2]。導(dǎo)致牛呼吸道疾病綜合征的細(xì)菌性病原主要是多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、睡眠嗜血桿菌等巴氏桿菌科革蘭陰性菌[2]。其中,曼氏桿菌屬細(xì)菌是巴氏桿菌科中引起B(yǎng)RDC最重要的一個(gè)屬[3]。

曼氏桿菌屬(Mannheimia),原歸屬于溶血巴氏桿菌A型[4-5],ANGEN等[6]根據(jù)Southern雜交及16S rRNA序列分析的結(jié)果,建議建立這一新屬,至少包含5個(gè)種,分別為:溶血性曼氏桿菌(Mannheimiaheamolytica)、肉芽腫曼氏桿菌(Mannheimiagranulomatis)、葡萄糖苷曼氏桿菌(Mannheimiaglucosida)、反芻動(dòng)物曼氏桿菌(Mannheimiaruminalis)、多源曼氏桿菌(Mannheimiavarigena)。其中,多源曼氏桿菌為多種反芻動(dòng)物的上呼吸道及腸道的正常菌群,但當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力下降時(shí),可引起牛的肺炎及乳腺炎,對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)是一些革蘭陰性菌中暴露于外膜的脂蛋白,是巴氏桿菌科一些細(xì)菌重要的毒力因子,相對(duì)分子質(zhì)量通常在60～100 kDa之間,TbpB作為外周蛋白, 具有一定的抗原性,易表達(dá)純化而成為一個(gè)良好的疫苗設(shè)計(jì)的靶點(diǎn),引起廣泛的研究興趣[8-10]。

本研究通過對(duì)某養(yǎng)殖場(chǎng)黃牛進(jìn)行鼻拭子采集,從黃牛的鼻拭子中分離得到1株曼氏桿菌,并對(duì)該菌進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)、16S rDNA PCR擴(kuò)增及測(cè)序,并對(duì)其TbpB基因進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,旨在鑒定該病原菌的藥物敏感性和致病性,為疫病防制和疫苗研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料采集及病原分離某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)老齡牛,呼吸困難、喘粗氣、流膿樣鼻涕、咳嗽劇烈、被毛粗亂、四肢乏力、便血、站立不穩(wěn)(圖1),剖檢發(fā)現(xiàn)肺纖維化嚴(yán)重,表面有白色滲出物,取剖檢后鼻咽拭子、肺內(nèi)容物等材料進(jìn)行細(xì)菌細(xì)菌分離。將病料用無菌棉簽劃線接種于10%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基,置于恒溫培養(yǎng)箱中,37℃燭缸培養(yǎng)24 h。經(jīng)分離純化后,得到1株細(xì)菌,命名為RC2110。

A.病牛臨床表現(xiàn);B.肺臟剖檢病變

1.2 形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察挑取培養(yǎng)物中灰白色針尖大小可疑菌落,挑取該菌落,于5 mL BHI(腦心浸出液肉湯)培養(yǎng)基中37℃,220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,取37℃振蕩培養(yǎng)12 h的菌液2.5 μL進(jìn)行涂片,分別進(jìn)行革蘭染色、瑞氏-姬姆薩染色、孔雀石綠-番紅染色,鏡檢。取BHI培養(yǎng)基中菌種,稀釋至約109CFU/mL(D600=1.200),吸取菌液500 μL,加入500 μL 60%無菌甘油,置于-80℃保存。溶血性試驗(yàn),取5 μL菌液,劃線接種于10%綿羊血鮮血瓊脂培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察其是否出現(xiàn)溶血。

1.3 生化特性鑒定分離菌RC2110分別接種于葡萄糖、山梨醇、半乳糖、七葉苷、枸櫞酸鹽等生化反應(yīng)管,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,進(jìn)行生化鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn)吸取0.5麥?zhǔn)蠞舛染?00 μL,均勻涂布于BHI瓊脂平板,待菌液吸收后,37℃燭缸培養(yǎng)24 h后測(cè)量各藥物抑菌圈的大小(mm),根據(jù)藥敏紙片說明書及抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對(duì)各種藥物的敏感程度。

1.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)吸取1×109CFU/mL 分離株RC2110菌液0.2 mL,腹腔注射3周齡C57小鼠(體質(zhì)量約20 g),每只注射0.2 mL,對(duì)照組小鼠注射0.2 mL生理鹽水,每隔2 h觀察小鼠行為;若小鼠死亡,立即剖檢觀察并取病變器官進(jìn)行涂片、瑞氏染色、鏡檢。

1.6 16S rDNA PCR與轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B(tbpB)基因的擴(kuò)增用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取細(xì)菌基因組根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的16S rDNA通用引物及 GenBank中多源曼氏桿菌基因組,進(jìn)行16S rDNA和tbpB基因PCR擴(kuò)增,引物見表1,反應(yīng)體系均為25 μL:Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye) 12.5 μL,上、下游引物(10 mmol/L,由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成)各1.0 μL,菌液(108CFU/mL)0.5 μL,以及將ddH2O補(bǔ)至25.0 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸90 s,共35個(gè)循環(huán);72℃10 min,4℃保溫。將PCR產(chǎn)物用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收后,送至重慶市擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S-27F單向測(cè)序和tbpB序列測(cè)通。

表1 試驗(yàn)相關(guān)引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.7 16S rDNA基因序列及TbpB氨基酸序列進(jìn)化分析根據(jù)GenBank中檢索巴氏桿菌科各種菌的代表菌株16S rDNA序列,與分離株RC2110進(jìn)行序列比對(duì)分析,并構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí),將測(cè)通后的tbpB基因序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后,找到分離株RC2110 TbpB開放閱讀框,在NCBI上檢索流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、副豬嗜血桿菌(Haephilusparasuis)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)、海藻糖比伯斯坦菌(Bibersteiniatrehalosi)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae) 等的tbpB,通過生物信息學(xué)軟件MEGA 7.0進(jìn)行N-J系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.8 TbpB的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析通過I-tasser在線預(yù)測(cè),以已經(jīng)發(fā)表的豬胸膜肺炎放線桿菌TbpB晶體結(jié)構(gòu)為模板,對(duì)分離株RC2110 TbpB三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),保存為pdb格式。

2 結(jié)果

2.1 分離株RC2110生長(zhǎng)狀況及形態(tài)

2.1.1分離株RC2110生長(zhǎng)狀況 病牛鼻拭子培養(yǎng)物在巧克力瓊脂平板上可見生長(zhǎng)良好,光滑、灰白色、透明、微凸起菌落,直徑2～3 mm,在10%綿羊血鮮血瓊脂上生長(zhǎng)良好,有較明顯的溶血現(xiàn)象,在BHI液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,可在麥康凱瓊脂上貧瘠生長(zhǎng),48 h后可產(chǎn)生針尖大小紅色菌落,LB瓊脂不生長(zhǎng)(圖2)。

A.10%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基;B.10%綿羊血鮮血培養(yǎng)基;C.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基;D.LB瓊脂培養(yǎng)基

2.1.2分離株RC2110鏡檢形態(tài) 如圖3所示,革蘭染色可見革蘭陰性、短棒狀桿菌,可聚集成細(xì)長(zhǎng)桿狀;瑞氏-姬姆薩染色可見明顯兩極著染桿菌,孔雀石綠-番紅染色未見芽孢。

A.革蘭染色 B.瑞氏-姬姆薩染色 C.孔雀石綠-番紅染色

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)由分離株RC2110生化試驗(yàn)結(jié)果,可知分離株RC2110甲基紅、二乙酰、靛基質(zhì)等試驗(yàn)為陰性,觸酶試驗(yàn)、β-半乳糖苷試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性,不發(fā)酵阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、麥芽糖等(表2),結(jié)合細(xì)菌生長(zhǎng)狀況可鑒定為多源曼氏桿菌,與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的生化結(jié)果一致。

表2 分離株RC2110生化鑒定結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)如表3所示,該分離菌株對(duì)氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類抗生素有較強(qiáng)的耐藥性,對(duì)頭孢哌酮和氟喹諾酮類藥物敏感。

2.4 分離株動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果注射菌液2 h后,小鼠精神沉郁、被毛粗亂、行動(dòng)遲緩、呼吸急促,呈現(xiàn)腹式呼吸;4 h后,小鼠死亡1/2;6 h后小鼠全部死亡。將死亡小鼠剖檢,結(jié)果如圖4所示,與對(duì)照組(圖4A)相比,注射菌液死亡小鼠肺部腫脹,出血嚴(yán)重(圖4B),取肺臟組織進(jìn)行觸片,瑞氏染色,油鏡下可見兩極著染桿菌(圖4C,紅圈處),與預(yù)期結(jié)果相符。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 16S rDNA與tbpB基因PCR結(jié)果如圖5所示,分離株RC2110 16S rDNA 和tbpBPCR擴(kuò)增片段大小均與預(yù)期相符。

2.6 16S rDNA與TbpB系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果采用Neighbor-Joining(NJ)法,利用生物信息學(xué)軟件MEGA7.0 對(duì)已完成測(cè)序分離株RC2110 16S rDNA和TbpB進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,結(jié)果分別見圖6,7,結(jié)果顯示分離株16S rDNA基因序列與牛曼氏桿菌ZY190616株、肉芽腫曼氏桿菌ATCC49244株、多源曼氏桿菌10299株相似性最高,位于同一簇內(nèi),相似性超過97%,與腔隙莫拉菌相似性最低。分離株TbpB序列與溶血曼氏桿菌、多源曼氏桿菌相似性較高,位于同一簇內(nèi),但與其他菌的TbpB序列相似性較低。

A.對(duì)照組小鼠;B.注射菌液死亡小鼠;C.死亡小鼠肺臟觸片瑞氏染色結(jié)果

圖6 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 TbpB結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果分離株RC2110 TbpB是由586個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的雙葉蛋白,由羧基端小葉(C-lobe)和氨基端小葉(N-lobe)組成,其中C-lobe有243個(gè)氨基酸殘基(綠色),N-lobe有278個(gè)氨基酸(洋紅色),紅色線狀結(jié)構(gòu)為N末端,約66個(gè)氨基酸殘基,被稱為“錨定”結(jié)構(gòu),插入細(xì)菌外膜(圖8A)。每個(gè)小葉均由1個(gè)β-筒結(jié)構(gòu)域(青色)和1個(gè)手柄結(jié)構(gòu)(黃色)構(gòu)成(圖8B)。

A.表面結(jié)構(gòu)圖;B.卡通結(jié)構(gòu)圖

3 討論

巴氏桿菌科細(xì)菌主要寄生于哺乳動(dòng)物和鳥類上呼吸道和消化道黏膜上,產(chǎn)生致病作用,多為需氧及兼性厭氧菌[11]。曼氏桿菌屬作為巴氏桿菌科的一個(gè)屬,最初被認(rèn)定為溶血巴氏桿菌,1999年,ANGEN等[6]通過Southern雜交和16S rRNA序列分析,確立了新的曼氏桿菌屬并將Mannheimiavarigena等6個(gè)種歸為新的曼氏桿菌屬[12]。

多源曼氏桿菌為革蘭陰性短桿菌,不發(fā)酵大多數(shù)糖、醇類物質(zhì)[4,7,13]。隨著貿(mào)易的發(fā)展,多源曼氏桿菌引起的疾病在國(guó)內(nèi)外時(shí)有發(fā)生,在我國(guó)吉林省[7]、愛爾蘭[14]、印度[6]和日本[15]均有該菌的分離報(bào)告。通過相關(guān)文獻(xiàn)可知,該菌可引起牛肺臟、腎臟、腦膜炎、乳房炎[16-17]等病變,并導(dǎo)致牛的死亡[14],可在牛乳中分離到該菌[13]。該菌對(duì)養(yǎng)牛業(yè)危害極大,但目前在我國(guó)報(bào)道較少。目前,細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥問題相當(dāng)突出,細(xì)菌可通過減少抗生素流入量或增加抗生素外排、改變抗生素的分子性狀、修飾抗生素的靶標(biāo)位點(diǎn)等方式使其產(chǎn)生抗生素耐藥性[17]。針對(duì)抗生素耐藥性,可通過使用抗菌肽、增強(qiáng)細(xì)菌代謝、選擇抗生素佐劑、選擇合適的細(xì)菌抗生素酶抑制劑、聯(lián)合用藥等[18-19]。結(jié)合本菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果,可選擇喹諾酮類藥物和頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉進(jìn)行聯(lián)合用藥抗菌治療。

TbpB是一種存在于細(xì)菌外膜表面的可溶性脂蛋白,2009年,有研究豬胸膜肺炎放線桿菌TbpB結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),豬胸膜肺炎放線桿菌TbpB為雙亞基蛋白,有N-lobe(橙色)和C-lobe(黃色)2個(gè)亞基,每個(gè)亞基都含有1個(gè)8條肽鏈構(gòu)成的β筒和1個(gè)富含β折疊結(jié)構(gòu)的手柄結(jié)構(gòu)域[20]。N-lobe位于細(xì)菌膜外,能與來自宿主的轉(zhuǎn)鐵蛋白直接進(jìn)行結(jié)合[21]。TbpB包含1個(gè)N-末端延伸(藍(lán)色),稱為“錨定結(jié)構(gòu)”,TbpB通過該結(jié)構(gòu)插入細(xì)菌外膜[8,22]。此外,LEE等[23]發(fā)現(xiàn),TbpB作為外膜蛋白有較好的免疫原性,且在細(xì)菌鐵獲取中發(fā)揮重要作用,是細(xì)菌亞單位疫苗開發(fā)的理想蛋白。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的不斷深入,越來越容易通過改變核酸堿基來改變蛋白結(jié)構(gòu),特別是在特定的位點(diǎn)改變重要氨基酸,來賦予新的蛋白新的功能。目前基于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為靶點(diǎn)的疫苗開發(fā)設(shè)計(jì)主要圍繞著TbpB進(jìn)行,因?yàn)門bpB外在蛋白,直接暴露在細(xì)菌外膜外面,很容易在大腸桿菌表達(dá)與純化,被認(rèn)為理想的疫苗設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。一系列的TbpB結(jié)構(gòu)被解析,各種來源的TbpB在結(jié)構(gòu)上有保守性,通過在線預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià),本研究顯示曼氏桿菌TbpB結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)鐵蛋白一樣,也具有2個(gè)小葉組成:氨基端小葉(N-lobe)和羧基端小葉(C-lobe),且2個(gè)小葉各擁有1個(gè)β筒結(jié)構(gòu)域和手柄結(jié)構(gòu)域。

本研究對(duì)牛源多源曼氏桿菌進(jìn)行了分離鑒定,并對(duì)其TbpB結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬,為后續(xù)疫苗研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。