吳易雨格,龔凌益,陳盈盈,彭 燦,王 晨,賀茂芳,2,秦 蓓,2,張 博,2**

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021;2.西安醫(yī)學(xué)院 藥物研究所,陜西 西安 710021)

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)在體內(nèi)不能合成,由進(jìn)食含硫基氨基酸的蛋白質(zhì)在體內(nèi)代謝生成[1]。致病機(jī)理主要包括損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、影響凝血系統(tǒng)及脂質(zhì)代謝[2],高同型半胱氨酸血癥(高于15 mmol/L,HHcy)可導(dǎo)致心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病[3-8]。目前,同型半胱氨酸最主要的2種檢測(cè)方法為高效液相(HPLC)法和熒光偏振免疫檢測(cè)(FPLA)法[9-10],但這些方法操作繁瑣、儀器昂貴、需要專(zhuān)業(yè)的操作者等因素難以推廣使用。因此,開(kāi)發(fā)一種操作便捷、低成本且具有高選擇性、高靈敏度的Hcy檢測(cè)方法尤為重要。

熒光碳量子點(diǎn)(carbon quantum dots,CQDs)是繼富勒烯、碳納米管及石墨烯之后最熱門(mén)的碳納米材料之一[11]。這種納米材料可應(yīng)用于潛指紋的增強(qiáng)成像[12],強(qiáng)靈敏的熒光響應(yīng)可用于檢測(cè)環(huán)境污染物[13],與傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比,具有良好的生物相容性、無(wú)毒、環(huán)境友好等特點(diǎn),在細(xì)胞內(nèi)可用于Fe3+、Cu2+等的微量檢測(cè)[14-15]。研究以檸檬酸為碳源、乙二胺為氮源,采用一步水熱法合成氮摻雜碳量子點(diǎn),構(gòu)建CQDs-Hg2+猝滅體系,以Hg2+介導(dǎo)建立關(guān)-開(kāi)法,可高效地控制碳量子點(diǎn)熒光的猝滅與恢復(fù),為同型半胱氨酸的檢測(cè)提供了新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

檸檬酸:天津市天力化學(xué)試劑有限公司;同型半胱氨酸:上海源葉生物科技有限公司;乙二胺、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O):上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硝酸鉻、硝酸鉛、氯化鋅:天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;無(wú)水氯化鈣:天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;三氯化鐵:上海麥克林生化科技有限公司;甲醇:天津益力化學(xué)試劑有限公司;氯化汞:貴州省銅仁化工研究所;以上試劑均為分析純;去離子水:實(shí)驗(yàn)室自制;透析袋:500 Da,西安優(yōu)博生物科技有限公司。

熒光分光光度計(jì):F-4600,日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)那珂事業(yè)所;紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):Cary60,美國(guó)安捷倫科技有限公司;傅里葉變換紅外光譜儀:TENSOR27,德國(guó)布魯克公司;鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9245A,真空干燥箱:DZF-6050,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;冷凍干燥機(jī):LAB-1C-50,上海甄明科學(xué)儀器有限公司;電子天平:SQP,賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光碳量子點(diǎn)的合成

參考文獻(xiàn)[15]的合成方法,修訂了純化方法。稱(chēng)取檸檬酸約4.0 g溶于40 mL的去離子水中,加入2.0 mL乙二胺,攪拌超聲溶解,充分混勻后轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜,擰緊密封,置于鼓風(fēng)干燥箱中200 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后,烘箱溫度自然冷卻至低于50 ℃,取出深棕色的制備液裝入500 Da透析袋中,外透析液采用去離子水,間隔10 min更換,透析約2 h,得到黃色澄清碳量子點(diǎn)內(nèi)透析液。內(nèi)透析液平鋪于培養(yǎng)皿中,液層厚度小于10 mm,在冰箱中先凍冰,然后再真空冷凍干燥,即得碳量子點(diǎn)棕色粉末,于冰箱冷凍保存。

1.2.2 構(gòu)建CQDs-Hg2+猝滅體系

配制2.0 mg/mL CQDs、10 mmol/L Hg2+和10 mmol/L Hcy作為儲(chǔ)備液,t=4 ℃保存?zhèn)溆?。?5 μL CQDs儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中,加去離子水稀釋至質(zhì)量濃度為1.7 μg/mL;分別取1.0 mL Hg2+、Hcy儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中,加去離子水稀釋至濃度為1 000 μmol/L作為工作液。

以340 nm為激發(fā)波長(zhǎng)(λex),438 nm為熒光波長(zhǎng)(λem),激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。取2.0 mL CQDs工作液,加入到熒光比色杯中,測(cè)定熒光強(qiáng)度F0,再加入Hg2+工作液250 μL,搖勻,靜置15 min,測(cè)定熒光強(qiáng)度Fq。依據(jù)ΔF1=F0-Fq計(jì)算熒光強(qiáng)度差值。

1.2.3 熒光關(guān)-開(kāi)法檢測(cè)Hcy

在熒光比色杯中加入CQDs工作液2.0 mL,Hg2+工作液250 μL,搖勻并靜置15 min,測(cè)定熒光強(qiáng)度Fq。再加入Hcy工作液,混合均勻,在室溫下靜置10 min,測(cè)定恢復(fù)的熒光強(qiáng)度Fr。依據(jù)ΔF2=Fr-Fq計(jì)算熒光強(qiáng)度差值。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳量子點(diǎn)的表征與光學(xué)性能

量子點(diǎn)的合成方法和光學(xué)性能參考文獻(xiàn)[15],修訂的純化過(guò)程見(jiàn)1.2.1。

2.2 猝滅體系的篩選

選擇Cu2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Hg2+、Cr3+、Ca2+、Pb2+(其他離子與1.2.2中Hg2+的配制和檢測(cè)條件一致)8種金屬離子,分別考察對(duì)CQDs的猝滅行為,并研究加入Hcy后的恢復(fù)效果。記錄各離子加入后CQDs的熒光強(qiáng)度,通過(guò)比較篩選出Hg2+和Fe3+猝滅效果最好,見(jiàn)圖1。制備CQDs-Fe3+和CQDs-Hg2+2種猝滅體系,分別加入Hcy 150 μL,按照η=(Fr-Fq)/Fq計(jì)算恢復(fù)率,最終篩選出合適體系,見(jiàn)圖2～圖3。

圖1 不同金屬離子對(duì)CQDs猝滅效果

λ/nm

λ/nm

由圖1～圖3可知,Fe3+對(duì)CQDs的熒光猝滅效果最好,其次是Hg2+,但在后續(xù)的熒光恢復(fù)實(shí)驗(yàn)中,CQDs-Fe3+體系恢復(fù)效率低,不能達(dá)到預(yù)期效果,因此將其淘汰。然而,CQDs-Hg2+體系的恢復(fù)率可以達(dá)到51%,通過(guò)Hg2+介導(dǎo),利用熒光信號(hào)關(guān)與開(kāi)的特點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Hcy的檢測(cè),因此,選擇CQDs-Hg2+體系。

2.3 CQDs-Hg2+體系優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),ρ(碳量子點(diǎn))較高時(shí),熒光強(qiáng)度大,隨著Hg2+加入量逐漸增加,猝滅現(xiàn)象會(huì)越發(fā)明顯,但是在Hcy加入后恢復(fù)效果并不理想,推測(cè)在溶液中,碳量子點(diǎn)的微觀分散顆粒數(shù)與Hg2+的數(shù)目存在某種匹配性,在該條件下,加入Hcy,才有利于熒光恢復(fù)。

2.3.1 優(yōu)化ρ(碳量子點(diǎn))

通過(guò)稀釋碳量子點(diǎn)儲(chǔ)備液,選擇熒光強(qiáng)度F0=200、300、600附近3種質(zhì)量濃度(1.2、1.7、3.4 μg/mL)的碳量子溶液2.0 mL,分別加入200 μL Hg2+工作液,搖勻,靜置15 min,充分反應(yīng)后測(cè)定熒光強(qiáng)度Fq。依據(jù)η=(F0-Fq)/F0計(jì)算熒光猝滅率,考察ρ(碳量子點(diǎn))對(duì)猝滅率的影響,見(jiàn)圖4。

ρ(碳量子點(diǎn))/(μg·mL-1)

由圖4可知,碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度F0≈200,猝滅率約為42%,F0≈300,猝滅率約為50%,ρ(碳量子點(diǎn))進(jìn)一步增大,F0≈600,猝滅率沒(méi)有提高,反而降低至約23%,說(shuō)明ρ(碳量子點(diǎn))進(jìn)一步增加,由于碳量子點(diǎn)的微觀分散顆粒數(shù)更多,不利于Hg2+對(duì)其猝滅。因此,選擇F0≈300的ρ(碳量子點(diǎn))=1.7 μg/mL作為工作液。

2.3.2 優(yōu)化V(Hg2+)

在熒光比色杯中加入CQDs工作液2.0 mL,分別加入50、100、150、200、250、300 μL Hg2+工作液,搖勻并靜置15 min,測(cè)定熒光強(qiáng)度Fq,分析不同V(Hg2+)對(duì)碳量子點(diǎn)的猝滅率的影響,見(jiàn)圖5。

λ/nm

由圖5可知,碳量子點(diǎn)溶液中加入Hg2+后,熒光強(qiáng)度隨著V(Hg2+)的增加,開(kāi)始下降,且猝滅程度隨V(Hg2+)的增加不斷加大。V(Hg2+)=250 μL,猝滅率約為51%,繼續(xù)加入Hg2+,猝滅率無(wú)明顯變化,熒光光譜基本重合。考慮到后續(xù)熒光強(qiáng)度恢復(fù)效率和線性范圍,最佳體積為V(Hg2+)=250 μL。

2.4 熒光猝滅反應(yīng)時(shí)間動(dòng)力學(xué)

將250 μL Hg2+加入到2.0 mL碳量子點(diǎn)溶液中,室溫下改變反應(yīng)時(shí)間,考察其對(duì)熒光猝滅效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。

猝滅反應(yīng)時(shí)間/min

由圖6可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度先下降后保持穩(wěn)定,反應(yīng)時(shí)間為15 min,熒光強(qiáng)度基本不變達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,因此后續(xù)研究選定猝滅時(shí)間為15 min。

2.5 熒光恢復(fù)反應(yīng)時(shí)間動(dòng)力學(xué)

在2.0 mL碳量子點(diǎn)溶液中加入250 μL Hg2+,猝滅反應(yīng)15 min,然后將Hcy 20 μL加入該猝滅體系中,改變反應(yīng)時(shí)間,考察其對(duì)熒光恢復(fù)效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖7。

熒光恢復(fù)時(shí)間/min

由圖7可知,開(kāi)始加入Hcy,熒光迅速恢復(fù),說(shuō)明Hcy能夠很好地競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Hg2+,使熒光信號(hào)得以恢復(fù)。由于體積和微粒分散性的變化,熒光強(qiáng)度有一定波動(dòng),但隨著時(shí)間延長(zhǎng),反應(yīng)時(shí)間為10 min,熒光強(qiáng)度趨于平衡,最佳熒光恢復(fù)時(shí)間為10 min。

2.6 建立熒光關(guān)-開(kāi)方法

精密移取CQDs工作液2.0 mL,Hg2+工作液250 μL,加入熒光比色杯,搖勻并靜置15 min,待猝滅完全后測(cè)定熒光強(qiáng)度Fq。再加入Hcy工作液,使c(Hcy)=3、5、7.5、10、15、17.5、20 μmol/L,混合均勻,在室溫下靜置10 min,以340 nm為激發(fā)波長(zhǎng),438 nm為熒光波長(zhǎng),測(cè)定恢復(fù)的熒光強(qiáng)度Fr。依據(jù)ΔF2=Fr-Fq計(jì)算熒光強(qiáng)度差值,結(jié)果見(jiàn)圖8。

c(Hcy)/(μmol·L-1)

由圖8可知,c(Hcy)=3～20 μmol/L,碳量子點(diǎn)的熒光恢復(fù)程度與c(Hcy)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為y=7.059 4x-19.647,相關(guān)系數(shù)r=0.998 5,檢測(cè)限為0.06 μmol/L。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)以乙二胺為氮源、檸檬酸為碳源,采用一步水熱法合成氮摻雜碳量子點(diǎn)探針(CQDs)。該納米材料在激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm、熒光波長(zhǎng)為438 nm時(shí)具有很好的熒光強(qiáng)度,同時(shí)對(duì)Hg2+表現(xiàn)出選擇性的熒光猝滅效應(yīng),而Hcy可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Hg2+,使碳量子點(diǎn)的熒光得以恢復(fù),以熒光強(qiáng)度恢復(fù)程度和同型半胱氨酸濃度為線性關(guān)系,建立Hg2+介導(dǎo)的碳量子點(diǎn)熒光關(guān)-開(kāi)法測(cè)定同型半胱氨酸,該方法具有選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),可用于測(cè)定同型半胱氨酸。