趙鳳玲 李盼盼 高翔 羅宇馨 王潤(rùn)萍 高靜

摘 要：目的：了解北京市通州區(qū)不同包裝、不同采樣場(chǎng)所即食非發(fā)酵豆制品微生物污染情況，為本地區(qū)食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。方法：采集即食非發(fā)酵豆制品70份，采用GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)、菌落總數(shù)、致病菌的檢測(cè)；對(duì)檢測(cè)出的致病菌檢測(cè)其毒力基因和血清分型，并進(jìn)行藥敏分析和PFGE分子分型。結(jié)果：預(yù)包裝的微生物檢測(cè)合格率均高于散裝，預(yù)包裝致病菌檢出率低于散裝，超市的微生物合格率高于網(wǎng)店和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。本次共檢出致病菌14株，沙門氏菌5株；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌4株，血清型為1/2a有3株，1/2b有1株，且所檢測(cè)的6對(duì)毒力基因均為陽(yáng)性；致瀉大腸埃希氏菌5株，均攜帶astA毒力基因，為腸聚集性大腸埃希菌。結(jié)論：北京市通州區(qū)即食非發(fā)酵豆制品污染較為嚴(yán)重，部分豆制品中檢測(cè)出了食源性致病菌，存在較高的食物安全隱患，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管力度，保障食品安全。

關(guān)鍵詞：非發(fā)酵豆制品；微生物污染；毒力基因；血清分型

Abstract： Objective： To investigate the microbial contamination of ready-to-eat non-fermented soybean products in different packaging and sampling sites in Tongzhou district， Beijing， and to provide a basis for the risk assessment of foodborne diseases in this area. Method： 70 copies of ready-to-eat non-fermented soy products were collected， and the coliform count， total number of colonies and pathogenic bacteria were detected by GB 4789 series standard methods. The virulence genes and serotyping of the detected pathogenic bacteria were detected， and the susceptibility analysis and PFGE molecular typing were performed. Result： The pass rate of prepackaged microbial detection was higher than that of bulk， the detection rate of prepackaged pathogenic bacteria was lower than that of bulk， and the microbial qualification rate of supermarkets was higher than that of online stores and farmers markets. A total of 14 strains of pathogenic bacteria were detected， 5 strains of Salmonella; 4 strains of Listeria monocytogenes， 3 strains of serotype 1/2a， 1 strain of 1/2b， and the 6 pairs of virulence genes detected were all positive; 5 strains of Escherichia coli causing diarrhea， all of which carry the astA virulence gene as enteroaggregative Escherichia coli. Conclusion： The pollution of ready-to-eat non-fermented soy products in Tongzhou district， Beijing is serious， and foodborne pathogenic bacteria have been detected in some soy products， which has high food safety risks， and relevant departments should strengthen supervision to ensure food safety.

Keywords： non-fermented soy products; microbial contamination; virulence genes; serotyping

大豆及其制品的蛋白質(zhì)含量居植物蛋白之首，有防癌、護(hù)肝、降血壓、增強(qiáng)免疫力等保健作用[1]，其含有的大豆異黃酮和大豆皂苷在治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、抗腫瘤等方面有積極的效果[2]，越來(lái)越受到消費(fèi)者推崇。但豆制品中所含豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又為微生物提供了理想的生長(zhǎng)條件，如果保存不當(dāng)受到微生物的污染很容易大量增殖，會(huì)給消費(fèi)者的健康帶來(lái)極大的威脅[3]。即食非發(fā)酵豆制品日常消費(fèi)量很大，包括豆腐、豆?jié){、豆絲、豆干、涼拌菜等，因?yàn)槠渲苯尤肟诘奶攸c(diǎn)，致病微生物的污染會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成極大的傷害。本研究基于2020年底對(duì)北京市通州區(qū)開(kāi)展的一次即食非發(fā)酵豆制品的微生物污染狀況監(jiān)測(cè)，分析了北京市通州區(qū)不同包裝、不同采樣場(chǎng)所即食非發(fā)酵豆制品微生物污染情況，以期為當(dāng)?shù)厥吃葱约膊〉娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 即食非發(fā)酵豆制品樣品采集

利用無(wú)菌操作技術(shù)在北京市通州區(qū)大型超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、網(wǎng)店采集即食非發(fā)酵豆制品共70份，采樣量≥250 g/份，大型超市30份，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)30份，網(wǎng)店10份，其中散裝45份、預(yù)包裝25份，采樣后立即低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 材料與儀器

革蘭陽(yáng)性/陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板（上海星佰）；沙門氏菌診斷血清（丹麥SSI）；單增李斯特菌血清分型抗體（日本DenkaSeiken）；致瀉大腸埃希氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（北京良潤(rùn)）；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力基因和分型引物，由上海生工合成；AscI和XbaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶（TAKARA）。

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；VITEK2 COMPACT30全自動(dòng)細(xì)菌生化分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）；普通PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche Diagnostics Ltd）；全自動(dòng)DNA/RNA分析系統(tǒng)（QIAGEN）；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 同時(shí)期參比致病菌株

2020年6月—12月北京市通州區(qū)食源性疾病腹瀉病例中分離的沙門氏菌；2018—2020年北京市通州區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌病例監(jiān)測(cè)中分離的菌株；2020年6月—12月北京市通州區(qū)食源性疾病腹瀉病例中分離的致瀉大腸埃希氏菌。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目和方法

檢驗(yàn)項(xiàng)目為菌落總數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和致瀉大腸埃希氏菌，均按GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn)[4-9]進(jìn)行檢測(cè)。致病菌鑒定均用全自動(dòng)細(xì)菌生化分析系統(tǒng)VITEK2 COMPACT30。

1.5 致病菌分離株的分析方法

利用血清凝集方法測(cè)定血清型；用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏分析；用PCR方法分析毒力基因；參考國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)技術(shù)規(guī)范將豆制品中分離的菌株與同時(shí)期通州區(qū)食源性疾病腹瀉病例中分離的同類菌株進(jìn)行PFGE分子分型。

1.6 結(jié)果判定

1.6.1 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 面筋制品》（GB 2711—2014）[10]、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)豆制品》（GB 2712—2014）[11]、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[12]以及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[13]評(píng)價(jià)豆制品微生物污染情況；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 24.0軟件，計(jì)數(shù)資料均用率表示，卡方檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6.2 藥物敏感性

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)致病菌的藥敏結(jié)果，獲得相應(yīng)敏感（S）、中度敏感（I）和耐藥（R）的結(jié)果。

1.6.3 PFGE圖譜

用Bionumerics 7.6軟件分析菌株間的親緣性，采用非加權(quán)配對(duì)平均法，位置容許度為1.5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食非發(fā)酵豆制品的微生物檢測(cè)情況

樣品共計(jì)70份，總合格率38.57%（27/70），菌落總數(shù)合格率38.57%（27/70），大腸菌群合格率85.71%（60/70）。致病菌檢出率20.00%（14/70），其中5株沙門氏菌（7.14%），4株單核細(xì)胞增生李斯特菌（5.71%），5株致瀉大腸埃希氏菌（7.14%）。

2.2 不同包裝即食非發(fā)酵豆制品的檢測(cè)情況

預(yù)包裝菌落總數(shù)合格率顯著高于散裝樣品（χ2=18.341，P＜0.05）；預(yù)包裝大腸菌群合格率稍高于散裝樣品（χ2=2.180，P＞0.05）；預(yù)包裝致病菌檢出率顯著低于散裝樣品（χ2=6.222，P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

2.3 不同采樣場(chǎng)所即食非發(fā)酵豆制品的檢測(cè)情況

3類采樣場(chǎng)所樣品的合格率分別為農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)20.00%、超市56.67%、網(wǎng)店40.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.520，P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 致病菌分離結(jié)果

2.4.1 沙門氏菌

（1）血清分型。5株沙門氏菌中2株為鼠傷寒沙門氏菌，1株為腸炎沙門氏菌，1株為阿姆斯特丹沙門氏菌，1株為德?tīng)柋吧抽T氏菌。

（2）耐藥情況。受試的15種抗生素中，所有菌株對(duì)亞胺培南、頭孢西丁、慶大霉素、阿奇霉素和環(huán)丙沙星的敏感率為100%，對(duì)氨芐西林、氨芐舒等呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，見(jiàn)表3。

（3）PFGE分型。將豆制品中分離沙門菌株及同時(shí)期腹瀉病例分離沙門菌株進(jìn)行PFGE分析，菌株間條帶相似度介于57.3%～100.0%，來(lái)源于市場(chǎng)的3號(hào)豆制品的菌株與來(lái)源于病例的2、3、4、5號(hào)菌株帶型相似度為88.7%，來(lái)源于市場(chǎng)的1號(hào)豆制品的菌株與來(lái)源于病例的1號(hào)菌株帶型相似度達(dá)77.4%，見(jiàn)圖1。

2.4.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌

（1）毒力基因及血清分型。分離出的4株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，3株血清型為1/2a，1株血清型為1/2b，所有菌株6對(duì)毒力基因（prfA、plcA、iap、hly、plcB、inlA）均為陽(yáng)性。

（2）耐藥情況。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在受試的15種抗生素中，對(duì)多數(shù)抗生素敏感，但對(duì)苯唑西林、環(huán)丙沙星、頭孢西丁100%耐藥，見(jiàn)表4。

（3）PFGE分型。將豆制品分離株及近3年病例檢測(cè)出的菌株進(jìn)行PFGE分析，菌株間條帶相似度介于56.9%～90.9%。來(lái)源于豆制品的3號(hào)帶型與來(lái)源于病例的6號(hào)帶型只相差2個(gè)條帶，相似度達(dá)90.9%，與7號(hào)帶型相差3個(gè)條帶，相似度達(dá)86.4%；來(lái)源于豆制品的2號(hào)帶型與來(lái)源于病例的5號(hào)帶型相差4個(gè)條帶，相似度達(dá)80.0%，見(jiàn)圖2。

2.4.3 致瀉大腸埃希氏菌

（1）毒力基因及血清分型。5株致瀉大腸埃希氏菌均攜帶astA毒力基因，為腸聚集性大腸埃希菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）。

（2）耐藥情況。受試的15 種抗生素中，5株致瀉大腸埃希氏菌對(duì)頭孢他啶、氨芐舒、亞胺培南、頭孢西丁、頭孢噻肟、慶大霉素、阿奇霉素的敏感率為100%，對(duì)頭孢唑林和環(huán)丙沙星的敏感率為80%，對(duì)四環(huán)素和復(fù)方磺胺呈現(xiàn)不同程度的耐藥，見(jiàn)表5。

（3）PFGE分型。將豆制品5株致瀉大腸埃希氏菌分離菌株及同時(shí)期腹瀉病例致瀉大腸埃希氏菌分離菌株進(jìn)行PFGE分析，菌株間條帶相似度介于62.5%～77.3%，來(lái)源于豆制品的菌株與同期病例菌株未見(jiàn)較近的親緣關(guān)系，見(jiàn)圖3。

3 討論

3.1 總體情況

此次檢測(cè)非發(fā)酵性即食豆制品共計(jì)70份，合格率僅為38.57%，表明北京市通州區(qū)非發(fā)酵性即食豆制品衛(wèi)生質(zhì)量不容樂(lè)觀。這與呂秋艷等[14]在北京市門頭溝區(qū)非發(fā)酵豆制品微生物污染調(diào)查分析中的合格率25%相比較高，與劉曉娟[15]在邯鄲市非發(fā)酵豆制品微生物污染調(diào)查分析中的合格率39.16%結(jié)果相近。菌落總數(shù)合格率僅38.57%，說(shuō)明產(chǎn)品在加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和售賣等環(huán)節(jié)均可能有微生物污染。并且檢出14株致病菌，表明非發(fā)酵即食豆制品有引起食物中毒的潛在危險(xiǎn)。

3.2 散裝和預(yù)包裝

預(yù)包裝豆制品合格率為72.00%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于散裝豆制品的20.00%，與雷少華[16]的研究結(jié)果相一致。衛(wèi)生指標(biāo)菌（菌落總數(shù)和大腸菌群）散裝樣品合格率僅為20.00%，而預(yù)包裝產(chǎn)品合格率72.00%，提示散裝產(chǎn)品在加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、售賣等各個(gè)環(huán)節(jié)中更容易受到微生物的污染。特別是檢出的14株致病菌，有13株來(lái)自散裝豆制品，致病菌檢出率為28.89%，說(shuō)明散裝即食非發(fā)酵豆制品存在很大的食品安全隱患。為了保障食品安全，應(yīng)該進(jìn)一步研究探討微生物污染的來(lái)源，采取相應(yīng)的控制措施，提高產(chǎn)品的衛(wèi)生合格率。也提示產(chǎn)品包裝是防止微生物污染的有效手段，為相關(guān)部門對(duì)豆制品的安全管理提供依據(jù)。

3.3 銷售場(chǎng)所

不同銷售場(chǎng)所菌落總數(shù)合格率分別為超市56.67%、網(wǎng)店40.00%、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)20.00%。超市的合格率最高，這可能是因?yàn)槌袑?duì)于產(chǎn)品質(zhì)量把控嚴(yán)格，進(jìn)貨渠道正規(guī)，儲(chǔ)存條件適宜；合格率最低的是農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，這可能與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)衛(wèi)生狀況較差，沒(méi)有良好的防塵、防蠅措施以及冷藏條件有關(guān)；網(wǎng)店是新興事物，還缺乏相關(guān)的管理規(guī)范，衛(wèi)生條件良莠不齊，總體合格率也不高。此外農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣品致病菌檢出率最高，劉琴等[17]的研究表明沙門氏菌等致病菌的污染在一定程度上是由農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)較差的衛(wèi)生條件所致，提示衛(wèi)生管理部門應(yīng)對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)衛(wèi)生條件較差的小攤位加強(qiáng)監(jiān)督管理，堅(jiān)決取締不合格的經(jīng)營(yíng)攤點(diǎn)。此外應(yīng)盡快出臺(tái)對(duì)網(wǎng)店的監(jiān)管措施，做好食品安全工作，保證消費(fèi)者的身體健康。

3.4 致病菌情況

（1）沙門氏菌。在分離出的沙門氏菌中，有2株鼠傷寒沙門氏菌，1株腸炎沙門氏菌，調(diào)查顯示鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是導(dǎo)致人群感染沙門氏菌病的主要血清型[18]，這些沙門氏菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑林等呈現(xiàn)不同程度耐藥性。在PFGE聚類分析中，來(lái)源于市場(chǎng)的3號(hào)豆制品PFGE條帶與來(lái)源于病例的2、3、4、5號(hào)條帶相似度為88.7%，表明為同一克隆群，因缺少病例流行病學(xué)資料未能成功溯源，但提示該豆制品可能為沙門氏菌感染性腹瀉相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)食品。

（2）單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。資料顯示，在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中，常見(jiàn)的能夠致病的血清型為1/2a、1/2b和4b[19]。本研究中分離出的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中，3株血清型為1/2a，1株血清型為1/2b，是常見(jiàn)致病血清型。此外，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌致病性與毒力基因密切相關(guān)，prfA是調(diào)控基因，缺失后會(huì)使單增菌毒力喪失[20]，plcB產(chǎn)生磷脂酰膽堿磷脂酶促進(jìn)細(xì)菌在宿主間的擴(kuò)散[21]，inlA是內(nèi)化素基因與細(xì)菌的侵襲力有關(guān)[22]，iap產(chǎn)生p60蛋白[23]，hiy產(chǎn)生溶血素，plcA基因編碼一個(gè)特異作用于磷脂酰肌的磷脂酶，它主要協(xié)同plcB發(fā)揮作用[24]，本次檢測(cè)所有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌6對(duì)毒力基因均為陽(yáng)性。在PFGE聚類分析中，有病例菌株和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豆制品菌株條帶相似度達(dá)90%以上，說(shuō)明可能是同一克隆來(lái)源的菌株，且致病的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可能在本地區(qū)長(zhǎng)期存在，散裝即食豆制品是風(fēng)險(xiǎn)食品。

（3）致瀉大腸埃希氏菌。在分離的大腸埃希氏菌中，所有菌株均攜帶astA毒力基因?yàn)镋AEC，與李梅基等[25]調(diào)查的優(yōu)勢(shì)菌株類型和毒力基因一致。在伊朗、巴西兒童腹瀉病例致瀉大腸埃希氏菌的研究中，EAEC的檢出率居首位[26]。豆制品分離出的EAEC對(duì)復(fù)方磺胺和四環(huán)素耐藥，這為今后臨床治療兒童腹瀉病例提供了方向。

4 結(jié)論

北京市通州區(qū)即食非發(fā)酵豆制品污染較為嚴(yán)重，將檢出的食源性致病菌和病例菌株進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)存在食品安全隱患；網(wǎng)店作為新興購(gòu)物渠道，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有即食非發(fā)酵豆制品網(wǎng)店樣本的相關(guān)報(bào)道，本研究做了初步的探索，發(fā)現(xiàn)與超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等常規(guī)采樣場(chǎng)所對(duì)比，樣品檢驗(yàn)合格率處于居中水平，但整體合格率較低。本次即食非發(fā)酵豆制品的采樣量比較小，分析還不夠透徹，且沒(méi)有分析季節(jié)變化對(duì)污染狀況的影響，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)完善相關(guān)研究數(shù)據(jù)。

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[12]國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量：GB 29921—2021[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2021.

[13]國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量：GB 31607—2021[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2021.

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基金項(xiàng)目：北京市通州區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（KJ2023CX083）。

作者簡(jiǎn)介：趙鳳玲（1981—），女，河北廊坊人，碩士，主管技師。研究方向：病原微生物檢測(cè)。