農(nóng)珍珍蒙揚(yáng)輝陳肇聰蔣美君孫若鵬朱鵬覃波忠鐘方杰張斌嚴(yán)雪瑜

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西 欽州 535011；2.欽州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 欽州 535000)

香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis)俗稱“白蠔”，具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛養(yǎng)殖，其主要繁殖生長(zhǎng)于我國(guó)南方低緯度、暖水性的沿海近岸[1]。隨著牡蠣養(yǎng)殖行業(yè)的迅速壯大，其產(chǎn)量大幅度提升，但香港牡蠣出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、種質(zhì)退化等問(wèn)題變得嚴(yán)峻[2]，提高香港牡蠣的數(shù)量及質(zhì)量迫在眉睫，成為當(dāng)今熱點(diǎn)研究方向。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族是一組調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、受損組織修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能廣泛的細(xì)胞激素[3，4]。TGF-β超家族的成員數(shù)量眾多[5]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、作用與受體的不同，可分為T(mén)GF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)、激活素(activins)、肌肉抑制素(myostatins)等，其中BMPs是TGF-β超家族里最大的亞家族成員[6]。誘導(dǎo)骨形成是BMP蛋白家族中最早被發(fā)現(xiàn)的功能，后被廣泛用于兔、鼠、牛及人類(lèi)等脊椎動(dòng)物的研究。大量資料證明，BMP蛋白家族不僅促進(jìn)動(dòng)物骨骼相關(guān)方面的健康發(fā)育，還調(diào)控不同類(lèi)型細(xì)胞的生理過(guò)程[7，8]，如生物胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化等[9-11]。雖然BMP蛋白家族在脊椎動(dòng)物方面的研究比較透徹，但隨著時(shí)代發(fā)展的需求，其家族在軟體動(dòng)物的潛在功能的挖掘也得到了關(guān)注。原位雜交技術(shù)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，BMP2基因在外套膜高表達(dá)，推測(cè)BMP2基因參與合浦珠母貝的貝殼珍珠層形成[12]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)結(jié)果顯示，BMP2/4基因在D型幼蟲(chóng)期和稚貝中表達(dá)水平偏高，認(rèn)為BMP2/4基因與泥蚶的器官形成、生長(zhǎng)發(fā)育有緊密的相關(guān)性[13]。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)中，BMP2基因在幼體原腸期的表達(dá)量最高；BMP2基因在成體的各組織中均表達(dá)，暗示BMP2基因參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、肌肉等組織的分化和生長(zhǎng)等[6]。以上研究表明，BMP蛋白家族在軟體動(dòng)物體內(nèi)的胚胎發(fā)育調(diào)控及貝殼形成等生理過(guò)程起關(guān)鍵作用。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)可分析出各物種的不同發(fā)育時(shí)段、生理周期下某種基因時(shí)空表達(dá)模式的變化，進(jìn)而挖掘某些具有特殊生理功能的未知基因[14]。近年來(lái)，該技術(shù)已被大規(guī)模應(yīng)用于水產(chǎn)生物的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等方面的研究[15，16]。迄今，尚未有BMP蛋白家族在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)變化的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的香港牡蠣開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析BMP蛋白家族中關(guān)鍵基因的表達(dá)變化，以期探尋到與香港牡蠣器官形成、肌肉發(fā)育和個(gè)體生長(zhǎng)等方面關(guān)鍵候選基因，為培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的香港牡蠣，提供育種技術(shù)理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將廣西茅尾海自然海區(qū)香港牡蠣群體作為親本，在人工繁育條件下(鹽度20‰，溫度25℃)培育的香港牡蠣苗種投放到欽州大蠔保苗海區(qū)(E108°34′54.27″，N21°45′0.53″)中進(jìn)行自然養(yǎng)殖，并定期監(jiān)測(cè)香港牡蠣的生長(zhǎng)情況[17]，采集4月齡(4M)和12月齡(12M)的香港牡蠣閉殼肌組織樣品，置于液氮中速凍后儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及BMP蛋白家族基因表達(dá)分析

將香港牡蠣的閉殼肌樣品在干冰保存狀態(tài)下送往中國(guó)上海美吉生物技術(shù)公司進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建和mRNA測(cè)序，并對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的BMP蛋白家族的基因按照p-adjust<0.001和|log2FC|≥1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)分析，利用Graphpad prism 9軟件繪制基因表達(dá)箱線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMP1基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，BMP1基因在香港牡蠣4月齡(4M)時(shí)的相對(duì)表達(dá)量均值為9.52，在12月齡(12M)時(shí)的基因表達(dá)量均值為6.19，表明BMP1基因表達(dá)隨香港牡蠣的生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 BMP1基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況

2.2 BMP2基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化

BMP2基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化結(jié)果如圖2所示，在4M時(shí)BMP2基因的相對(duì)表達(dá)量均值為5.24，在12M時(shí)的基因表達(dá)量均值為2.53，表明BMP2基因表達(dá)隨香港牡蠣的生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；但轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果顯示BMP2基因在香港牡蠣4M和12M時(shí)期的組內(nèi)個(gè)體差異較大，其基因的時(shí)空表達(dá)情況仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 BMP2基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況

2.3 BMP3基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化

BMP3基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化結(jié)果如圖3所示，在4M時(shí)BMP3基因的相對(duì)表達(dá)量均值為4.11，在12M時(shí)的基因表達(dá)量均值為1.06，表明BMP3基因表達(dá)隨香港牡蠣的生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；但轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果顯示BMP3基因在香港牡蠣4M和12M時(shí)期的組內(nèi)個(gè)體差異較大，其基因的時(shí)空表達(dá)情況仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3 BMP3基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況

2.4 BMP7基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化

BMP7基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化結(jié)果如圖4所示，在4M時(shí)BMP7基因的相對(duì)表達(dá)量均值為5.79，在12M時(shí)的基因表達(dá)量均值為4.16，表明BMP7基因表達(dá)隨香港牡蠣的生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；但轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果顯示BMP7基因在香港牡蠣4M和12M時(shí)期的組內(nèi)個(gè)體差異較大，其基因的時(shí)空表達(dá)情況仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 BMP7基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況

2.5 BMP10基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化

BMP10基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化結(jié)果如圖5所示，在4M時(shí)BMP10基因的相對(duì)表達(dá)量均值為1.09，在12M時(shí)的基因表達(dá)量均值為1.44，提示BMP10基因表達(dá)隨香港牡蠣的生長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。

圖5 BMP10基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況

3 討論

BMP蛋白家族中的基因在各生物體的細(xì)胞生長(zhǎng)周期、胚胎發(fā)育等生理反應(yīng)表現(xiàn)出一定的差異表達(dá)水平。相關(guān)報(bào)道表明，BMP1基因在爪蟾的桑椹胚到蝌蚪時(shí)期該基因表達(dá)逐漸增加[18]。BMP1基因在水牛的各組織中都有表達(dá)[19]。本研究中，BMP1基因在香港牡蠣4M時(shí)表達(dá)量極高。以上研究結(jié)果闡明，BMP1基因在不同物種胚胎發(fā)育前期可能發(fā)揮重要作用。對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)BMP2基因早期的表達(dá)量高于后期，且斑馬魚(yú)的BMP2基因被敲低導(dǎo)致其器官發(fā)育緩慢或畸形，結(jié)果表明，BMP2基因在斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用[20]。對(duì)九孔鮑進(jìn)行試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)九孔鮑的BMP2基因于7個(gè)時(shí)期均表達(dá)，表達(dá)量主要集中于受精卵、4細(xì)胞、8細(xì)胞、原腸胚、稚鮑時(shí)期，推測(cè)BMP2基因在九孔鮑生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成中具有重要作用[21]。本研究中，香港牡蠣的BMP2基因在4月齡時(shí)表達(dá)量相對(duì)較高，表明BMP2基因可能在牡蠣的生長(zhǎng)發(fā)育前期發(fā)揮關(guān)鍵作用。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)相關(guān)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)BMP3基因具有抑制骨骼形成作用[22]。在合浦珠母貝試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)BMP3基因在幼體的擔(dān)輪幼蟲(chóng)期及變態(tài)期高表達(dá)；BMP3基因在成體的外套膜和鰓高表達(dá)，說(shuō)明BMP3基因參與合浦珠母貝細(xì)胞的分化及貝殼形成[23]。本研究中，BMP3基因在香港牡蠣4M時(shí)高表達(dá)，12M時(shí)其表達(dá)量下降。BMP3基因在脊椎動(dòng)物和軟體動(dòng)物的細(xì)胞分化、生長(zhǎng)發(fā)育等生理活動(dòng)中存在差異，原因可能是BMP3基因在各物種間生長(zhǎng)發(fā)育中生理反應(yīng)機(jī)制不同。RT-PCR技術(shù)分析結(jié)果顯示，BMP7基因在泥蚶的各個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá)[24]；本研究中，BMP7基因在香港牡蠣不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)模式均顯示，貝類(lèi)各時(shí)期的生理調(diào)控離不開(kāi)BMP7基因的參與。周代志等[25]發(fā)現(xiàn)，BMP10基因在合浦珠母貝中高表達(dá)于擔(dān)輪期和變態(tài)期；段勝華的研究發(fā)現(xiàn)，BMP10基因在三角帆蚌的不同組織都有表達(dá)[26]；BMP10基因在香港牡蠣12M時(shí)的表達(dá)量最高，推測(cè)該基因參與貝類(lèi)的變態(tài)發(fā)育、組織分化、生長(zhǎng)發(fā)育等。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)利用轉(zhuǎn)錄組高通量技術(shù)對(duì)香港牡蠣BMP蛋白家族關(guān)鍵基因開(kāi)展時(shí)空表達(dá)差異分析，為BMP蛋白家族的功能探索奠定一定的理論基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP1、BMP2、BMP3、BMP7基因在香港牡蠣4M時(shí)的表達(dá)量顯著高于12M，說(shuō)明這4個(gè)基因可能參與了香港牡蠣前期的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。BMP10基因在香港牡蠣12M時(shí)的表達(dá)量高于4M時(shí)期，基因時(shí)空表達(dá)呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明該基因可能在香港牡蠣后期的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP蛋白家族中的BMP1、BMP2、BMP3、BMP7和BMP10等基因在香港牡蠣不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段具有表達(dá)差異，表明BMP蛋白家族可能參與了香港牡蠣的生長(zhǎng)調(diào)控過(guò)程，為牡蠣的生長(zhǎng)機(jī)理研究提供了新的思路。