蔣運斌， 黃婷， 陳瑞鑫， 陳文莉， 張燕飛， 蔣桂華

1. 西南大學(xué) 藥學(xué)院/中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400715；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，成都 611137；3. 西藏藏醫(yī)藥大學(xué) 藏醫(yī)藥研究所，拉薩 850000

“以藥制藥”應(yīng)用于中醫(yī)藥已有十分悠久的歷史, 最早可追溯至東漢張仲景《金匱要略方論》中記載的阿膠經(jīng)蒲黃炒后可增效、 川烏經(jīng)蜜制后可減毒, 其是以一些藥物炮制另一些藥物, 以達到減毒、 增效/存效等效果的傳統(tǒng)制藥技術(shù)[1]． 目前可用于炮制其他藥物的藥物較多, 如生姜、 蛤蚧粉、 蜂蜜、 蒲黃、 吳茱萸、 甘草[1]． 具有調(diào)和諸藥功能的甘草備受關(guān)注, 其在“以藥制藥”領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用廣泛, 可使被炮制的藥物減毒、 增效/存效, 如甘草制雷公藤、 款冬花等[2-3]．

細辛Asari Radix et Rhizoma為馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.、 漢城細辛AsarumsieboldiiMiq. var.seoulenseNakai或華細辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根莖, 為中醫(yī)臨床常用中藥． 受“馬兜鈴酸腎病”的影響, 其臨床用藥的安全性受到關(guān)注; 同時大量研究表明, 細辛長期大劑量服用會對肝腎等重要臟器產(chǎn)生毒性[4-6]． 炮制是一種能使中藥減毒并存效或增效的有效方法[7], 目前關(guān)于炮制對細辛成分、 藥效、 毒性的影響報道較少, 相關(guān)研究亟待加強． 有研究分析了不同炮制方法(鹽制、 炒焦、 米泔水制、 堿制、 甘草制、 醋制、 姜制、 酒制、 堿醋制、 蜜制)對細辛毒性成分(馬兜鈴酸A、 黃樟醚)含量的影響, 結(jié)果表明細辛炮制后, 馬兜鈴酸A和黃樟醚的量均有不同程度的降低[8]． 據(jù)報道, 細辛經(jīng)堿(NaHCO3)制后, 其急性毒性降低, 抗炎鎮(zhèn)痛作用增強[9]． 綜上, 本研究擬基于“以藥制藥”理念, 通過急性毒性實驗、 長期毒性實驗、 大鼠硝酸甘油偏頭痛模型, 對細辛經(jīng)甘草炮制前后的毒性、 藥效變化進行剖析, 以提升細辛臨床用藥的安全性和有效性．

1 材料

BS200生化分析儀, 邁瑞醫(yī)療國際有限公司; 352酶標分析儀, 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司; Sorvall ST 40冷凍離心機, 美國Thermo Fisher公司; CX22光學(xué)顯微鏡, 日本OLMPUS公司; BP121S電子分析天平, 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司; RM2235石蠟切片機, 德國Leica公司．

細辛購于重慶市解放路中藥材專業(yè)市場, 經(jīng)重慶市中藥研究院秦松榮研究員鑒定為馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.的干燥根和根莖． 大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT, 批號202012)、 門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST, 批號202012)、 肌酐(Cr, 批號202012)、 尿素氮(BUN, 批號202012)生化試劑盒, 上海篤瑪生物科技有限公司; 大鼠一氧化氮(NO, 批號200739M)、 一氧化氮合成酶(NOS, 批號200760M)、 降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP, 批號200734M)、 5-羥色胺(5-HT, 批號200787M)、 去甲腎上腺素(NE, 批號200765M)ELISA試劑盒, 江蘇酶免實業(yè)有限公司． 蘇木素(批號420699)、 伊紅(批號392155), 美國Thermo Fisher公司． 水合氯醛(批號2018103001), 成都市科隆化學(xué)品有限公司; 鹽酸氟桂利嗪膠囊(商品名西比靈, 批號180909075), 西安楊森制藥有限公司; 硝酸甘油注射液(批號20180522), 北京益民藥業(yè)有限公司．

SPF級KM小鼠130只, 體質(zhì)量20 ± 2 g, 雌雄各半; SD大鼠90只, 體質(zhì)量200 ± 20 g, 雌性25只, 雄性65只, 成都達碩實驗動物有限公司, 許可證號SCXK(川)2015-030, 實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d． 實驗動物飼養(yǎng)條件: 室內(nèi)溫度20～26 ℃, 相對濕度40%～70%, 12 h白天, 12 h夜晚, 自由進食、 飲水． 實驗操作符合成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會標準．

2 方法

2.1 甘草汁及細辛炮制品的制備

2.1.1 甘草汁的制備

據(jù)文獻[10]和2015年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》, 取甘草片, 10倍量水煎煮2次, 每次45 min, 合并煎煮液, 濃縮至濃度約為1.5 g/mL, 即得炮制用甘草汁．

2.1.2 細辛炮制品的制備

取細辛段300 g, 加入300 mL甘草汁, 拌勻, 悶潤, 待甘草汁被吸盡后, 置烘箱內(nèi)25 ℃烘干, 即得． 在獲得甘草制細辛后, 將細辛生品、 炮制品分別進行粉碎, 過5號篩, 備用． 臨用時, 將細辛生品、 炮制品粉末用蒸餾水配制成所需濃度．

2.2 炮制前后細辛急性毒性的測定

2.2.1 動物分組、 給藥

將130只KM小鼠隨機均分為13組, 雌雄各半, 包括6個生細辛組(7.87, 6.30, 5.04, 4.03, 3.23, 2.58 g/kg), 6個甘草制細辛組(9.40, 7.52, 6.02, 4.81, 3.85, 3.08 g/kg), 1個空白對照組． 按30 mL/kg灌胃給藥1次, 給藥后連續(xù)觀察14 d． 空白對照組小鼠灌胃給予等體積的蒸餾水． 生細辛、 甘草制細辛劑量是在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上, 按0.8組距進行設(shè)置．

2.2.2 動物一般情況觀察、 解剖及分析

每天早晨, 對中毒反應(yīng)(如煩躁、 蹦跳、 呼吸困難、 痙攣等)進行記錄, 并記錄各組小鼠的死亡數(shù)目, 對死亡小鼠進行解剖, 觀察臟器是否異常． 觀察14 d后, 采用頸椎脫臼法將剩余小鼠處死并進行解剖, 觀察臟器是否異常． Bliss法計算半數(shù)致死量(LD50)．

2.3 炮制前后細辛長期肝腎毒性的測定

2.3.1 動物分組、 給藥

將50只SD大鼠隨機均分為5組, 雌雄各半, 包括空白對照組(蒸餾水)、 生細辛低劑量組(0.42 g/kg)、 生細辛高劑量組(1.67 g/kg)、 甘草制細辛低劑量組(0.42 g/kg)、 甘草制細辛高劑量組(1.67 g/kg)． 按10 mL/kg灌胃給藥, 每天1次, 連續(xù)28 d．

2.3.2 動物一般情況觀察

給藥后觀察并記錄大鼠行為、 食欲、 分泌物、 皮毛、 糞便等情況．

2.3.3 肝腎功能血液生化指標檢測

末次給藥24 h后, 測定大鼠體質(zhì)量, 腹腔注射10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)進行麻醉, 腹主動脈采血5 mL, 血液4 ℃靜置3 h, 4 ℃下4 000 r/min離心20 min, 取血清, 置-80 ℃保存?zhèn)溆茫?按生化試劑盒說明書, 檢測血清中ALT, AST, Cr和BUN的含量．

2.3.4 臟器系數(shù)測定

腹主動脈取血后, 立即對大鼠進行解剖, 觀察肝腎組織的外觀形狀, 隨后對肝腎進行剝離, 用濾紙輕輕擦拭干凈, 稱質(zhì)量, 按公式計算各臟器系數(shù)．

I肝=W肝/W×100%

(1)

I腎=W腎/W×100%

(2)

式中,I肝表示肝臟臟器系數(shù),I腎表示腎臟臟器系數(shù),W肝表示肝臟質(zhì)量(g),W腎表示腎臟質(zhì)量(g),W表示體質(zhì)量(g)．

2.3.5 組織病理學(xué)觀察

取各大鼠肝或腎的同一部位, 以4%多聚甲醛固定, 再經(jīng)脫水、 透明、 浸蠟、 包埋、 切片, 隨后行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色, 在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠的肝腎組織病理學(xué)變化．

2.4 炮制前后細辛抗偏頭痛藥效的測定

2.4.1 動物分組、 給藥、 造模

將40只SD雄性大鼠隨機均分為5組, 包括空白對照組(蒸餾水)、 模型組(蒸餾水)、 西比靈組(1 mg/kg)、 生細辛組(330 mg/kg)、 甘草制細辛組(330 mg/kg)． 按10 mL/kg灌胃給藥, 每天1次, 連續(xù)7 d． 末次給藥30 min后, 空白對照組大鼠后頸部皮下注射等量的生理鹽水, 其余各組大鼠后頸部均皮下注射硝酸甘油(10 mg/kg), 從注射硝酸甘油起, 出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、 頻繁撓頭和甩頭等現(xiàn)象, 表明偏頭痛造模成功．

2.4.2 血NO, NOS和CGRP

造模4 h后, 腹腔注射10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)進行麻醉, 腹主動脈采血約8 mL, 其中5 mL室溫下靜置20 min, 4 ℃下3 000 r/min離心20 min, 取血清, 置-20 ℃冰箱保存, 用于測定NO和NOS的水平． 另3 mL以乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)作為抗凝劑, 混合20 min后, 4 ℃下3 000 r/min離心20 min, 取血漿, 置-20 ℃保存, 用于測定CGRP的水平, 按ELISA試劑盒說明書進行測定．

2.4.3 腦5-HT和NE檢測

大鼠取血后處死, 取腦組織, 迅速在液氮中冷凍, 稱質(zhì)量, 按質(zhì)量體積比1∶9 g/mL加入9倍體積的生理鹽水, 用手工玻璃勻漿器在冰浴上研磨勻漿, 4 ℃下3 000 r/min離心20 min, 收集上清液, -20 ℃保存, 按ELISA試劑盒說明書, 檢測腦組織上清液中5-HT和NE的水平．

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果與分析

3.1 甘草制對細辛急性毒性的影響

與空白對照組比較, 生細辛各劑量組、 甘草制細辛各劑量組小鼠在給藥后不同程度上出現(xiàn)了煩躁、 蹦跳、 呼吸困難及全身痙攣等中毒癥狀; 與生細辛組比較, 甘草制細辛組開始出現(xiàn)上述癥狀的時間整體延后． 小鼠解剖后, 肉眼觀察各臟器, 未發(fā)現(xiàn)明顯異常． 經(jīng)Bliss法計算LD50, 結(jié)果表明甘草制細辛的LD50(5.69 g/kg)大于生細辛的LD50(4.83 g/kg), 見表1．

表1 生細辛及甘草制細辛的急性毒性實驗結(jié)果

3.2 甘草制對細辛長期肝腎毒性的影響

3.2.1 動物一般情況

給藥第2周, 生細辛高劑量組開始出現(xiàn)精神萎靡、 食欲不振、 眼部分泌物增加等現(xiàn)象． 給藥第3周, 甘草制細辛高劑量組開始出現(xiàn)精神萎靡、 食欲不振、 呼吸困難等現(xiàn)象． 各組大鼠皮毛、 糞便無明顯異常．

3.2.2 肝腎功能血液生化指標、 臟器系數(shù)變化

與空白對照組比較, 生細辛高劑量組的ALT, AST和BUN水平升高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01,p<0.05); Cr水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義; 生細辛低劑量組、 甘草制細辛低、 高劑量組的ALT, AST, BUN和Cr水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義． 與生細辛低或高劑量組比較, 甘草制細辛低或高劑量組的ALT, AST, BUN和Cr水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但整體來看, 甘草制可以減輕細辛對肝腎功能相關(guān)指標的影響(表2)．

表2 生細辛及甘草制細辛對大鼠肝腎血液生化指標的影響

與空白對照組比較, 生細辛低、 高劑量組和甘草制細辛高劑量組的肝臟臟器系數(shù)升高(p<0.05,p<0.01), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 生細辛高劑量組的腎臟臟器系數(shù)升高(p<0.01), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義, 其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義． 與生細辛高劑量組比較, 甘草制細辛高劑量組肝臟臟器系數(shù)降低(p<0.05), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 腎臟臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但有降低趨勢． 與生細辛低劑量組比較, 甘草制細辛低劑量組的肝臟、 腎臟臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但也有降低趨勢(表3)．

表3 生細辛及甘草制細辛對大鼠臟器系數(shù)的影響

3.2.3 肝組織病理學(xué)變化

通過對各組大鼠肝組織病理學(xué)進行全面觀察, 發(fā)現(xiàn)肝細胞腫脹是各組大鼠肝組織間的主要差異性病理損傷, 正常肝組織及各種肝細胞腫脹表現(xiàn)見圖1． 根據(jù)肝細胞腫脹的程度, 將其分為Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ型, 見表4． 各組在肝細胞腫脹各分型中的動物數(shù)量分布見表5, 與空白對照組相比, 生細辛組或甘草制細辛組出現(xiàn)肝細胞腫脹的大鼠數(shù)量及嚴重程度均呈增加趨勢, 特別是生細辛高劑量組; 與生細辛低或高劑量組比較, 甘草制細辛低或高劑量組出現(xiàn)肝細胞腫脹的大鼠數(shù)量及嚴重程度均呈減弱趨勢．

圖1 正常肝組織及各種肝細胞腫脹表現(xiàn)顯微圖(HE染色, 200×)

表4 肝細胞腫脹的病理損傷分型

表5 生細辛及甘草制細辛對大鼠肝臟細胞腫脹分型的影響(n=10)

3.2.4 腎組織病理學(xué)變化

通過對各組大鼠腎組織病理學(xué)進行全面觀察, 發(fā)現(xiàn)各組大鼠腎組織間的主要差異性病理損傷包括: ① 腎小管上皮細胞變性/壞死: 腎小管上皮細胞腫脹、 顆粒變性、 水泡變性, 部分細胞壞死、 脫落, 進入腎小管管腔內(nèi); ② 充血: 間質(zhì)小靜脈和毛細血管擴張充血、 腎小球充血, 致體積增大、 腎小囊囊腔不同程度狹窄; ③ 部分腎小管管腔內(nèi)見有濃厚的深染紅色的蛋白管型． 正常腎組織及各種病理損傷表現(xiàn)見圖2．

圖2 正常腎組織及各種病理損傷表現(xiàn)顯微圖(HE染色, 200×)

各組在不同腎組織病理損傷中的動物數(shù)量分布見表6, 與空白對照組相比, 生細辛組或甘草制細辛組出現(xiàn)各腎組織病理損傷的大鼠數(shù)量呈增加趨勢; 與生細辛低或高劑量組比較, 甘草制細辛低或高劑量組出現(xiàn)各腎組織病理損傷的大鼠數(shù)量呈降低趨勢．

表6 生細辛及甘草制細辛對大鼠腎組織病理損傷的影響(n=10)

3.3 甘草制對細辛抗偏頭痛藥效的影響

3.3.1 血NO, NOS和CGRP水平的變化

與空白對照組比較, 模型組大鼠血中NO, NOS和CGRP水平升高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)． 與模型組比較, 西比靈組、 生細辛組、 甘草制細辛組大鼠血中NO, NOS和CGRP水平降低, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)． 與生細辛組比較, 甘草制細辛組大鼠血中NO, NOS和CGRP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表7)．

表7 細辛及甘草制細辛對偏頭痛大鼠血中NO, NOS和CGRP水平的影響

3.3.2 腦5-HT和NE水平的變化

與空白對照組比較, 模型組大鼠腦組織中5-HT和NE水平升高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)． 與模型組比較, 西比靈組、 生細辛組和甘草制細辛組大鼠腦組織中5-HT和NE水平降低, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)． 與生細辛組比較, 甘草制細辛組大鼠腦組織中5-HT和NE水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表8)．

表8 細辛及甘草制細辛對偏頭痛大鼠腦組織中5-HT和NE水平的影響

4 討論與結(jié)論

本研究基于“以藥制藥”理念, 以減毒、 存效/增效為目的, 研究了甘草制對細辛毒效的影響． 通過急性毒性實驗、 長期毒性實驗, 以動物一般情況、LD50、 肝腎功能血液生化指標(ALT, AST, Cr和BUN)、 肝腎臟器系數(shù)、 肝腎組織病理學(xué)變化為指標, 對細辛經(jīng)甘草炮制前后的毒性變化進行闡釋． 基于大鼠硝酸甘油偏頭痛模型, 以血NO, NOS, CGRP和腦5-HT, NE水平為指標, 對細辛經(jīng)甘草炮制前后的抗偏頭痛藥效變化進行分析, 結(jié)果表明甘草制可使細辛減毒存效．

LD50是表征藥物急性毒性的常用指標[11]． 急性毒性實驗研究顯示細辛經(jīng)甘草炮制后, 出現(xiàn)毒性的時間延后,LD50增加, 表明甘草炮制降低了細辛的急性毒性． 相對于急性毒性, 細辛長期大劑量服用容易引起肝腎等重要臟器受損[4-6]． ALT和AST是表征肝功能的經(jīng)典指標, 當肝功能受損后, 血液中ALT和AST水平均上升[12]． Cr和BUN是表征腎功能的重要指標, 腎功能受損后, 血液中Cr和BUN水平均升高[13]． 臟器系數(shù)是實驗動物某臟器的質(zhì)量與體質(zhì)量的比值, 正常狀態(tài)時動物各臟器與體質(zhì)量的比值相對恒定, 當動物染毒后, 受損臟器因充血、 水腫、 萎縮等原因, 導(dǎo)致對應(yīng)臟器系數(shù)發(fā)生改變, 目前臟器系數(shù)是毒理實驗中常用的指標[14]． 當臟器受損后, 針對其進行病理組織學(xué)觀察, 可以直觀、 有效地反映出臟器受損情況, HE染色是目前最基本、 應(yīng)用最廣泛的病理組織學(xué)染色技術(shù)[15]． 長期毒性實驗研究顯示細辛經(jīng)甘草炮制后, 出現(xiàn)毒性的時間延后, 對肝腎功能血液生化指標(ALT, AST, Cr和BUN)、 臟器系數(shù)的影響減弱; 同時病理組織學(xué)結(jié)果顯示, 甘草制可減輕細辛對肝腎的損傷． 綜上, 甘草制可降低細辛的長期毒性．

2020版《中國藥典》記載, 細辛具有解表散寒、 祛風止痛、 通竅、 溫肺化飲的功效, 主要用于治療風寒感冒、 頭痛、 牙痛、 鼻塞流涕、 鼻鼽、 鼻淵、 風濕痹痛、 痰飲喘咳． 研究顯示, 細辛善于治療偏頭痛, 其在臨床治療偏頭痛用藥中使用頻率排在第6位[16], 故本研究基于大鼠硝酸甘油偏頭痛模型, 以血NO, NOS, CGRP和腦5-HT, NE水平為指標, 考察了甘草制對細辛藥效的影響． 硝酸甘油偏頭痛模型支持偏頭痛發(fā)病機制的三叉神經(jīng)血管學(xué)說, 三叉神經(jīng)傳出神經(jīng)纖維受到刺激后釋放神經(jīng)肽類物質(zhì)(如CGRP)作用于腦血管壁, 進而引起神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的發(fā)生, 最終導(dǎo)致頭痛[17-18]． NO也是一種血管活性物質(zhì), 不僅可擴張腦血管, 也可刺激三叉神經(jīng)釋放CGRP, 進而引起偏頭痛的發(fā)生[19]． NOS參與了NO的合成, 故其在激發(fā)偏頭痛和維持偏頭痛持續(xù)中顯得非常重要[20]． 此外, 腦中5-HT和NE等的代謝紊亂也會促進偏頭痛的發(fā)生[21-22]． 本研究顯示, 生細辛和甘草制細辛具有明顯抗偏頭痛的作用． 相對于生細辛, 甘草制細辛的血NO, NOS, CGRP和腦5-HT, NE水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 即甘草制對細辛抗偏頭痛藥效沒有明顯影響, 保持了細辛的藥效．

本研究基于“以藥制藥”理念, 通過急性毒性實驗、 長期毒性實驗、 大鼠硝酸甘油偏頭痛模型, 闡釋了甘草制可使細辛減毒存效, 可促進細辛臨床用藥的安全性、 有效性, 但其炮制減毒機制有待進一步研究．