馮繼鵬， 胡洲， 張曼曼， 汪小利，易倩， 朱世平， 趙曉春

1. 西南大學(xué) 柑桔研究所/國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712；2. 西部(重慶)科學(xué)城種質(zhì)創(chuàng)制大科學(xué)中心，重慶 401329

柑橘是我國(guó)最重要的水果, 主要種植在南方各省市的山地和丘陵地區(qū)． 柑橘產(chǎn)區(qū)橫跨幾個(gè)氣候帶, 許多柑橘產(chǎn)區(qū)的降雨量季節(jié)分配不均勻, 因此季節(jié)性缺水造成的干旱是制約我國(guó)許多地區(qū)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要因素[1]． 植物有多種抗旱和耐旱機(jī)制應(yīng)對(duì)干旱脅迫, 以維持正常的生長(zhǎng)和發(fā)育． 近年的研究發(fā)現(xiàn), 一些小分子RNA不僅與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān), 而且在植物的抗旱中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]． 小分子RNA主要有3種類型, siRNAs,miRNAs和piRNAs, 其中miRNAs是目前生物體內(nèi)存在最廣泛的, 也是研究最多的一類小RNA． 這些小RNA長(zhǎng)度大約在20～24個(gè)核苷酸, 它們通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因結(jié)合, 進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá), 促使mRNA降解或抑制其翻譯, 起負(fù)調(diào)控靶基因的作用[3-4]． miRNA通過調(diào)控靶基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)[5], 許多研究報(bào)道指出, 有多種miRNA參與植物的干旱脅迫響應(yīng)． miR196g是最早在水稻中被發(fā)現(xiàn)的與干旱相關(guān)的miRNA[6], 豇豆中發(fā)現(xiàn)了有近20個(gè)miRNA以不同的方式響應(yīng)干旱脅迫[7], 干旱逆境誘導(dǎo)碧桃葉片及根部中262和368個(gè)miRNA差異表達(dá)[8], miR168和miR396在擬南芥和煙草中的表達(dá)也受干旱脅迫誘導(dǎo)[9]． 在模式植物擬南芥中, miR171在干旱、 低溫、 低氧、 低磷、 低硫等脅迫下表達(dá)量都會(huì)發(fā)生變化[10]． 豆科植物中miR171也響應(yīng)干旱脅迫[11]． 在水稻中, 過表達(dá)osa-miR171f可以通過調(diào)控類黃酮生物合成基因的表達(dá)來增強(qiáng)水稻的耐旱性[12], 它通過調(diào)節(jié)SCL6-I和SCL6-II的轉(zhuǎn)錄水平在抗旱性中發(fā)揮作用． 在蘋果中, 敲除mdm-miR171i和過表達(dá)它的靶基因MsSCL26.1均可增強(qiáng)其抗旱性[13]． 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), mdm-miR171通過調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)和抗壞血酸代謝來響應(yīng)干旱脅迫． 以上研究結(jié)果表明, miR171家族成員響應(yīng)植物的干旱脅迫． 目前的研究表明, miR171家族的功能高度保守． 因此可以推測(cè)柑橘中的Cre-miR171也可能響應(yīng)干旱脅迫, 但柑橘中Cre-miR171是否響應(yīng)干旱脅迫以及調(diào)控的靶基因的研究還未見報(bào)道．

為明確Cre-miR171對(duì)柑橘耐旱的作用, 本研究通過對(duì)Cre-miR171在不同柑橘砧木品種、 組織及根系不同部位、 發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征進(jìn)行分析, 對(duì)Cre-miR171過表達(dá)的柑橘砧木枳和模式植物擬南芥進(jìn)行耐旱性及根系形態(tài)評(píng)價(jià), 探究Cre-miR171對(duì)植物響應(yīng)干旱脅迫的影響． 并在轉(zhuǎn)基因柑橘中對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行表達(dá)分析, 為深入研究Cre-miR171調(diào)控柑橘耐旱性的分子機(jī)理提供參考．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

柑橘砧木品種枳(PoncirustrifoliataRaf.)、 扁平橘(CitrusdepressaHayata. ‘Shiikuwasha’)、 紅檸檬(C.limoniaOsbeck. ‘Canton Lemon’)的種子采自國(guó)家果樹種質(zhì)柑橘圃(重慶, 北碚)． 本氏煙(Nicotianabenthamiana)、 擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子為本實(shí)驗(yàn)室自繁．

DNA提取試劑盒(植物基因組DNA快速提取試劑盒), 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit), RNA提取試劑盒(天根DP504), 限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher scientific), DNA Marker (Takara), 引物合成和測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成．

1.2 試驗(yàn)方法

將枳、 扁平橘和紅檸檬的種子去除種皮后于(28±1) ℃下保濕催芽． 挑選萌芽一致的種子播種于膨脹珍珠巖∶蛭石(體積比1∶1)的基質(zhì)中, 在溫室(25±1) ℃中培養(yǎng)． 選取一月齡左右的不同砧木幼苗, 取其根、 莖、 葉用于Cre-miR171的組織表達(dá)分析． 分別于枳種子播種后30 d, 60 d和90 d, 取全根用于根的不同發(fā)育時(shí)期Cre-miR171的表達(dá)分析． 于枳種子播種后45 d, 取根尖和側(cè)根發(fā)生區(qū)樣品用于Cre-miR171在根不同部位的表達(dá)分析． 于枳種子播種后60 d, 取莖、 葉、 側(cè)根發(fā)生區(qū)以及根尖用于Cre-miR171靶基因的表達(dá)分析． 以上取樣各5株, 設(shè)5個(gè)生物學(xué)重復(fù)．

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的1月齡枳的水培幼苗, 分別用15%的PEG6000及100 μM的脫落酸(ABA)水溶液進(jìn)行脅迫處理, 在處理的0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h分別采集全根作為樣品, 用于脅迫處理下Cre-miR171的表達(dá)分析． 選取播種后2個(gè)月、 長(zhǎng)勢(shì)一致的盆栽枳幼苗于溫室內(nèi)進(jìn)行干旱處理, 在干旱處理的0 d, 5 d, 10 d, 15 d分別采集根尖區(qū)與側(cè)根發(fā)生區(qū)的組織樣品, 用于干旱脅迫下Cre-miR171的表達(dá)分析．

1.3 生物信息學(xué)分析

Cre-miR171的前體序列來自本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的小RNA文庫(kù)． 利用Tbtools對(duì)Cre-miR171前體序列與從柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到的克里曼丁橘(C.clementina)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì), 獲得Cre-miR171前體序列上游3 000 bp啟動(dòng)子序列, 其順式作用元件通過PlantCARE(http: //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析． 利用psRNATarget: A Plant Small RNA Target Analysis Server (2017 Update) 在線網(wǎng)站psRNATarget(2017 update)軟件進(jìn)行小RNA靶基因的互補(bǔ)配對(duì), 以miRNA的5′端為種子序列與參考基因組克里曼丁橘的轉(zhuǎn)錄本3’UTR區(qū)對(duì)Cre-miR171的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)． 靶基因序列從在線網(wǎng)站Phytozome(https: //phytozome-next.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上獲取．

1.4 過表達(dá)Cre-miR171載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

采用Primer 3在線軟件設(shè)計(jì)1對(duì)Cre-miR171前體序列的特異引物, 分別在序列的兩端加上SwaI,BamHI酶切位點(diǎn)(表1), 以枳的DNA為模板, 對(duì)Cre-miR171進(jìn)行克?。?用Solution I連接酶將Cre-miR171前體序列的全長(zhǎng)與經(jīng)SwaI,BamHI雙酶切后的PGBi載體進(jìn)行連接, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中, 挑選單克隆送往北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序． 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞, 用枳上胚軸進(jìn)行柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化[14], 采用花序侵染法進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化[15]．

表1 Cre-miR171的核苷酸序列與引物序列

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定與其靶基因的篩選

利用PCR方法對(duì)Cre-miR171的過表達(dá)柑橘植株和擬南芥植株進(jìn)行鑒定． 正向引物是35S啟動(dòng)子一段序列, 反向引物為Cre-miR171前體序列(表1), 以轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增． 采用莖環(huán)法qRT-PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)基因柑橘植株的Cre-miR171相對(duì)表達(dá)量, 選擇Cre-miR171表達(dá)量最高的3株進(jìn)行嫁接擴(kuò)繁． 同時(shí)對(duì)其靶基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析．

1.6 煙草瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

構(gòu)建兩類煙草瞬時(shí)表達(dá)載體進(jìn)行Cre-miR171與其靶基因的互作驗(yàn)證． 一類為Cre-miR171前體序列超表達(dá)的GUS載體, 將Cre-miR171的前體序列與線性化的GUS載體連接; 另一類為改造過的超表達(dá)載體pMS4載體, pMS4載體在GFP基因前后有兩個(gè)酶切位點(diǎn)XhoI和XbaI, 經(jīng)雙酶切之后用于插入miRNA靶基因位點(diǎn)． 靶基因位點(diǎn)是通過人工合成的兩條寡核苷酸鏈退火后形成的雙鏈, 分為SCclscl6,SCclscl22,SCclscl26以及經(jīng)過改造的MTSCclscl6, MTSCclscl22, MTSCclscl26兩類(表2)． 重組后的質(zhì)粒經(jīng)北京擎科生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證正確后, 轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101菌株的感受態(tài)細(xì)胞, 在煙草中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染共同表達(dá)miRNA及其靶基因．

表2 載體構(gòu)建所用引物

1.7 Cre-miR171及其靶基因的熒光定量分析

莖環(huán)qRT-PCR和qRT-PCR分別被用來分析miRNA及其靶基因的相對(duì)表達(dá)量． miRNA的內(nèi)參基因?yàn)閁6, 靶基因的內(nèi)參基因?yàn)楦涕貱sActin． 用Primer5軟件設(shè)計(jì)miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物和靶基因、 內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表3)． qRT-PCR反應(yīng)體系為: 2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix 5 μL, 正、 反向引物各0.2 μL, RNase Free Water 2.6 μL, cDNA 2 μL(500 ng)． 擴(kuò)增程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性10 min, 然后95 ℃ 15 s, 58 ℃ 60 s, 共設(shè)置40個(gè)循環(huán)． 所有的定量反應(yīng)都在實(shí)時(shí)PCR System (Applied Biosystems 7 500 Fast, Applied Biosystems, USA)上完成． 每個(gè)qRT-PCR反應(yīng)重復(fù)3次． miRNA及其靶基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算[16]．

表3 qRT-PCR引物及序列

1.8 轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性評(píng)價(jià)

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的過表達(dá)Cre-miR171的擬南芥植株進(jìn)行26 d的干旱處理, 并觀察其在干旱情況下的表型變化． 在處理14 d時(shí)取葉片樣, 測(cè)定POD與脯氨酸的含量．

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的枳野生型和轉(zhuǎn)基因植株, 剪取相同生長(zhǎng)部位的葉片, 放置在干燥的濾紙上, 測(cè)定脫水處理60 min內(nèi)的質(zhì)量變化, 計(jì)算相對(duì)失水率． 對(duì)脫水處理后的葉片進(jìn)行電導(dǎo)率的測(cè)定, 計(jì)算處理后葉片的相對(duì)電導(dǎo)率．

剪取對(duì)照組和Cre-miR171表達(dá)量最高的過表達(dá)枳的枝條, 扦插于蛭石基質(zhì)中, 待其長(zhǎng)出根系后, 評(píng)價(jià)分析根的生長(zhǎng)發(fā)育表現(xiàn)．

2 結(jié)果與分析

2.1 Cre-miR171前體上游調(diào)控區(qū)相關(guān)啟動(dòng)子元件分析

利用PlantCARE對(duì)Cre-miR171前體上游啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖1), 結(jié)果發(fā)現(xiàn): 該小RNA的啟動(dòng)子區(qū)域除了含有典型的具有轉(zhuǎn)錄起始功能的TATA-box,CAAT-box核心元件外, 還包括激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)元件, 如脫落酸、 水楊酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件． 此外, 還包含一些光響應(yīng)、 厭氧、 晝夜響應(yīng)等相關(guān)元件． 根據(jù)以上結(jié)果, 推測(cè)Cre-miR171的表達(dá)受多種因素的誘導(dǎo), 能參與逆境脅迫下的應(yīng)答及調(diào)控．

圖1 Cre-miR171前體上游調(diào)控區(qū)相關(guān)啟動(dòng)子元件

2.2 Cre-miR171在柑橘中的表達(dá)特征

在枳、 扁平橘、 紅檸檬的幼苗中對(duì)Cre-miR171的組織表達(dá)模式進(jìn)行分析, 這3種砧木的耐旱性明顯不同, 其中枳的耐旱性最強(qiáng)[15]． Cre-miR171在3種不同砧木中表現(xiàn)出相同的組織表達(dá)特征, 在根中的表達(dá)量相對(duì)較低, 在莖中的表達(dá)量最高． 同時(shí), Cre-miR171在耐旱性較強(qiáng)的枳的根和葉中的表達(dá)量顯著低于其他2種耐旱性比較弱的砧木, 與砧木的耐旱性相反, 說明Cre-miR171可能參與柑橘對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)． Cre-miR171在枳根生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期的表達(dá)也存在明顯差異, Cre-miR171在種子發(fā)芽后第30 d時(shí)表達(dá)極低, 在30～60 d時(shí)急劇上升, 在60～90 d時(shí)表達(dá)量無明顯變化, 表明Cre-miR171可能與根系的早期發(fā)育相關(guān)． Cre-miR171在根系的表達(dá)有一定的組織特異性, 在側(cè)根發(fā)生區(qū)的表達(dá)量明顯高于根尖(圖2), 說明Cre-miR171對(duì)側(cè)根發(fā)生和根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的作用存在差異．

不同小寫字母代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．

2.3 Cre-miR171靶基因的預(yù)測(cè)、 鑒定和表達(dá)分析

利用psRNATarget對(duì)Cre-miR171的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè), 通過生物信息學(xué)分析去除大量重復(fù)基因后, 發(fā)現(xiàn)Cre-miR171主要靶向9個(gè)靶基因, 分別為SCL家族基因Ciclev10019094m(SCL6),Ciclev10019083m(SCL22),Ciclev10000940m(SCL26); GRAS基因Ciclev10018916m、 ?；罨赶嚓P(guān)基因Ciclev10003943m、 蛋白磷酸酶相關(guān)基因Ciclev10001232m、 乙烯不敏感基因Ciclev10000617m以及2個(gè)功能未知基因Ciclev10010118m, Ciclev10027698m． 在嫁接成活的9株超表達(dá)Cre-miR171的枳植株中選取Cre-miR171表達(dá)量上調(diào)最高的OE-6,OE-8,OE-9等3個(gè)株系對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析(圖3a), 發(fā)現(xiàn)Ciclev10019094m,Ciclev10019083m和Ciclev10000940m等3個(gè)靶基因的表達(dá)在超表達(dá)植株中受到了明顯的抑制, 說明這3個(gè)靶基因明顯受Cre-miR171的負(fù)調(diào)控, 靶向關(guān)系較強(qiáng)(圖3b)． 基因注釋和同源基因比較分析指出, 這3個(gè)基因是同屬于SCL家族的同源基因, 在本研究中將這3個(gè)基因分別命名為CclSCL6,CclSCL22,CclSCL26． 這3個(gè)靶基因在枳中的表達(dá)表現(xiàn)出相同的組織特異性(圖3c), 和Cre-miR171的表達(dá)均呈明顯負(fù)相關(guān), 進(jìn)一步驗(yàn)證了這3個(gè)基因是Cre-miR171的靶基因, 在功能上有明顯的相似性．

“**”代表相對(duì)于WT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01); 不同小寫字母代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．

利用煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)對(duì)Cre-miR171與CclSCL6,CclSCL22,CclSCL26的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證(圖4)． 用農(nóng)桿菌侵染煙草葉片, 分別共同表達(dá)Cre-miR171、 Cre-miRcontrol、 攜帶靶位點(diǎn)的GFP基因和攜帶修飾后的靶位點(diǎn)的GFP基因(圖4b)． 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 含有OE-miR171和OE-SCL26-GFP,OE-SCL6-GFP,OE-SCL22-GFP的農(nóng)桿菌共同侵染煙草葉片后, 葉片中GFP熒光信號(hào)均發(fā)生了明顯的減弱, 而其他組合葉片中的GFP熒光信號(hào)沒有發(fā)生明顯的改變(圖4d)． 因此表明在植物體內(nèi), Cre-miR171能夠抑制靶基因CclSCL26,CclSCL6,CclSCL22的表達(dá)．

圖4 瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證Cre-miR171靶基因

2.4 非生物脅迫下Cre-miR171與靶基因在根中的表達(dá)分析

ABA處理下, Cre-miR171的表達(dá)在根中呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì), 但是變化幅度較小; PEG6000處理對(duì)Cre-miR171的表達(dá)影響非常顯著, 處理過程中, Cre-miR171在根中的表達(dá)呈現(xiàn)出先下降后快速上升再快速下降的趨勢(shì), 表現(xiàn)出對(duì)脅迫處理的強(qiáng)烈響應(yīng), 說明Cre-miR171對(duì)滲透脅迫比較敏感(圖5a)． 為了了解干旱脅迫下Cre-miR171在根的不同部位的表達(dá), 對(duì)枳幼苗進(jìn)行了為期15 d的自然干旱處理． 在干旱處理的第10 d時(shí), 觀察到側(cè)根開始發(fā)生(圖5c), 根尖數(shù)目增加, 而地上部分形態(tài)變化不明顯． Cre-miR171的表達(dá)明顯響應(yīng)了干旱脅迫, 其在根尖中的表達(dá)量高于側(cè)根發(fā)生區(qū), 特別在干旱處理10 d后更為顯著(圖5b), 3個(gè)靶基因的表達(dá)也顯示出了對(duì)干旱脅迫的明顯響應(yīng), 并在處理10 d后出現(xiàn)劇烈的變化(圖5d), 與Cre-miR171在這期間的表達(dá)明顯負(fù)相關(guān)． 從整個(gè)處理時(shí)期看, Cre-miR171與靶基因在干旱脅迫下根的兩個(gè)部位的表達(dá)均沒有達(dá)到顯著的相關(guān)性(表4), 特別在根尖的表達(dá)相關(guān)性更弱． 但在處理的第5 d后, Cre-miR171與其靶基因在根的兩個(gè)部位的表達(dá)趨勢(shì)均轉(zhuǎn)變?yōu)槊黠@的負(fù)相關(guān)(表5), 特別在10 d后均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的變化, 說明Cre-miR171的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo), 并在響應(yīng)脅迫后對(duì)靶基因產(chǎn)生了較強(qiáng)的調(diào)控作用． 另外, Cre-miR171在根部?jī)蓚€(gè)部位的表達(dá)在處理的第10 d后出現(xiàn)相反的趨勢(shì), 3個(gè)靶基因的表達(dá)也隨之發(fā)生相應(yīng)的變化, 說明Cre-miR171在干旱脅迫下能抑制根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng), 促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生．

圖5 非生物脅迫下Cre-miR171與其靶基因在根中的表達(dá)

表4 干旱脅迫下Cre-miR171與其靶基因在根中表達(dá)水平的相關(guān)性分析

表5 干旱脅迫5～15 d內(nèi)Cre-miR171與其靶基因在根中表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.5 表達(dá)外源Cre-miR171擬南芥的耐旱性評(píng)價(jià)

miR171在植物中較為保守[17], 序列比對(duì)顯示, Cre-miR171與擬南芥miR171家族成員之間只有2個(gè)核苷酸的差異(圖6a)． 對(duì)過表達(dá)Cre-miR171 3周齡的擬南芥進(jìn)行26 d的干旱處理, 結(jié)果顯示, 在干旱14 d內(nèi), 野生型擬南芥的生長(zhǎng)狀況良好, 葉片色澤鮮綠, 而轉(zhuǎn)基因植株的葉片顏色則明顯加深; 在干旱21 d時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的邊緣枯黃, 野生型的擬南芥葉片的顏色也開始加深, 但轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片顏色更深, 而且轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生長(zhǎng)已受到了極大的抑制, 植株明顯矮小; 干旱26 d時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片因脫水而導(dǎo)致葉片大面積萎蔫(圖6c), 干旱脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因株系傷害程度明顯高于野生型株系． 以上結(jié)果說明, 過表達(dá)Cre-miR171使擬南芥對(duì)干旱逆境的敏感性顯著增加． 干旱處理14 d時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的過氧化物酶含量高于野生型植株, 其脯氨酸含量也顯著高于野生型(圖6d), 也說明了轉(zhuǎn)基因擬南芥更早地響應(yīng)干旱脅迫．

#1, #3, #5為不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系; ** 代表相對(duì)于WT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)．

2.6 超表達(dá)Cre-miR171枳的耐旱性評(píng)價(jià)

對(duì)擴(kuò)繁成活的轉(zhuǎn)基因植株OE-6,OE-8,OE-9的葉片進(jìn)行脫水處理, 在處理30 min到60 min時(shí)轉(zhuǎn)基因株系葉片的相對(duì)失水率均顯著高于野生型． 轉(zhuǎn)基因枳的葉片在脫水處理后的電導(dǎo)率高于野生型(圖7), 說明轉(zhuǎn)基因枳膜系統(tǒng)被干旱損傷的程度高于野生型, 超表達(dá)Cre-miR171明顯降低了枳的耐旱能力．

* 表示相對(duì)于WT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．

對(duì)扦插生根的對(duì)照組和超表達(dá)Cre-miR171的枳植株的根系進(jìn)行形態(tài)觀測(cè)(圖8a), 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根比對(duì)照組的少, 根系也明顯短, 說明Cre-miR171影響了枳根系的生長(zhǎng)發(fā)育, 超表達(dá)Cre-miR171抑制了枳的主根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和側(cè)根發(fā)生． 對(duì)扦插90 d的轉(zhuǎn)基因枳進(jìn)行表達(dá)定量分析, 結(jié)果顯示, Cre-miR171在轉(zhuǎn)基因枳的葉片與根中的表達(dá)量都顯著上調(diào)(圖8b), 其靶基因CclSCL26,CclSCL6,CclSCL22的表達(dá)量受到抑制(圖8c), 說明Cre-miR171可能通過負(fù)調(diào)控其靶基因CclSCL26,CclSCL6,CclSCL22的表達(dá)來抑制主根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和側(cè)根的發(fā)生．

** 表示相對(duì)于WT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)．

3 結(jié)論與討論

在植物中, miR171參與調(diào)節(jié)植物基本的發(fā)育和代謝過程[18-19]． 在模式植物擬南芥中, miR171通過調(diào)控其靶基因AtSCL6-II,AtSCL6-III和AtSCL6-IV的表達(dá)影響莖尖分生組織[20-21]． 過表達(dá)miR171前體可以抑制腋芽形成和花芽數(shù)量, 從而改變擬南芥莖的結(jié)構(gòu)[22]． 擬南芥幼苗在高鹽、 低溫和干旱脅迫下miR171的表達(dá)量都會(huì)上調(diào)[9], 推測(cè)miR171參與了擬南芥非生物脅迫的調(diào)控． 番茄中miR171和SCL6通過調(diào)節(jié)激素信號(hào)去調(diào)控番茄的生長(zhǎng)發(fā)育[23]． 甘蔗中miR171響應(yīng)鹽脅迫[24]．

Cre-miR171啟動(dòng)子區(qū)有光信號(hào)、 脫落酸、 水楊酸、 茉莉酸甲酯等激素和脅迫響應(yīng)元件, 同時(shí)miR171被證實(shí)響應(yīng)光信號(hào)[25]、 茉莉酸甲酯[26]、 水楊酸、 脫落酸[27]誘導(dǎo), 表明Cre-miR171可能受光信號(hào)、 茉莉酸甲酯、 水楊酸、 脫落酸等多條信號(hào)通路的影響, 推測(cè)Cre-miR171可能參與逆境脅迫下的應(yīng)答及調(diào)控． 表達(dá)Cre-miR171的擬南芥對(duì)干旱脅迫更敏感, 脫水處理對(duì)過表達(dá)Cre-miR171枳葉片的膜系統(tǒng)的傷害顯著高于對(duì)照, 說明過表達(dá)Cre-miR171的枳轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力降低． 這與在蘋果中的研究結(jié)果相似[13], 表明Cre-miR171對(duì)柑橘的耐旱性有負(fù)調(diào)控的作用．

有研究表明miR171在根的發(fā)育和生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用, miR171參與蘋果[28]和葡萄[29]的不定根形成, miR171還影響了水稻的根系發(fā)育[30], 同時(shí)miR171被證實(shí)可以影響蒺藜苜蓿的側(cè)根密度[31]． 本研究中, Cre-miR171在柑橘根發(fā)育的早期高表達(dá), 而且在側(cè)根發(fā)生區(qū)的表達(dá)量高于根尖, 表明Cre-miR171對(duì)柑橘根系的發(fā)育及側(cè)根的形成有重要影響．

本研究中預(yù)測(cè)并驗(yàn)證的3個(gè)Cre-miR171的靶基因(CclSCL6,CclSCL22,CclSCL26)是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子, 其功能具有多樣性, 參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[32]、 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)的應(yīng)答過程[33]． Cre-miR171在響應(yīng)干旱脅迫后在側(cè)根發(fā)生區(qū)下調(diào)表達(dá), 在根尖上調(diào)表達(dá), 趨勢(shì)相反, 3個(gè)靶基因的表達(dá)也隨之發(fā)生相應(yīng)的顯著變化, 說明在干旱脅迫下, Cre-miR171能通過對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控抑制根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng), 促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生． 可以推測(cè), Cre-miR171可能調(diào)控柑橘根系在干旱脅迫下的可塑性．