楊教童， 李鵬飛， 肖巧巧

貴州中醫(yī)藥大學 中藥民族藥資源研究院，貴陽 550025

金銀花是我國常用的藥用植物之一, 在世界各地均有種植, 主要分布在東亞的中國、 韓國和日本等國家, 在中國常使用金銀花的花蕾和花入藥, 而日本常使用金銀花的莖和葉入藥[1]． 金銀花具有清熱解毒、 疏散風熱等功效, 在國內(nèi)分布廣, 品種多, 使用量大． 現(xiàn)已鑒定出金銀花具有多種活性成分, 包括揮發(fā)油、 黃酮類、 有機酸類和三萜類化合物等[2], 可用于治療肺結(jié)核、 肺炎、 急性細菌性痢疾等疾病[3]． 金銀花除了在醫(yī)學方面有重要的應用外, 在化妝品、 食品和健康飲料方面也有廣泛的應用價值[4-5]． 此外, 金銀花還經(jīng)常作為觀賞植物呈現(xiàn)在大眾面前[1]． 金銀花的藥用、 養(yǎng)生和觀賞價值決定了其具有較大的市場開發(fā)利用前景．

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 因其具有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名[6]．WRKY基因最初在甘薯中被發(fā)現(xiàn)[7], 后期的研究中發(fā)現(xiàn)WRKY基因家族包含3個亞家族[8], 并且第2個亞家族又可進一步細分為5個次亞家族[9]． 有研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子能識別靶基因的W-box[(T)TGAC(C/T)] 序列并進行特異性結(jié)合, 進而調(diào)控靶基因的功能[10]． 高等植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中發(fā)揮著重要作用．WRKY基因可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育, 如擬南芥的WRKY46,WRKY54和WRKY70可以通過油菜素內(nèi)酯調(diào)控其生長發(fā)育過程[11]． 此外,WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與非生物脅迫反應, 如干旱、 損傷、 水分和鹽脅迫等[12-14]． 在擬南芥中過表達WRKY30可增強鹽脅迫的抗性, 在水稻中過表達WRKY47可以顯著增強水稻對干旱的耐受性． WRKY蛋白在應答生物脅迫(包括細菌、 真菌和病毒病原體)方面也發(fā)揮重要作用[15-16], 如擬南芥的WRKY22能夠通過水楊酸和茉莉酸信號調(diào)控其對蚜蟲的易感性[17]． 綜上所述,WRKY基因在植物的生長發(fā)育、 逆境應答方面發(fā)揮了重要的作用．

目前, 越來越多植物的WRKY家族基因被鑒定且相關(guān)功能被報道, 如刺梨[18]、 玉米[19]、 茄子[6]、 菠蘿[20]和番茄[21]等, 但金銀花的WRKY基因家族鑒定還未見報道． 本研究基于WRKY家族的種子序列對金銀花WRKY家族基因進行鑒定, 并基于公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其功能進行預測, 為將來開展金銀花WRKY基因的功能研究奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 金銀花WRKY基因家族成員鑒定

從中國國家生物信息中心(CNCB)收集金銀花的全蛋白序列, 從Pfam網(wǎng)站[22]上下載WRKY蛋白的結(jié)構(gòu)域序列, 利用HMMER軟件[23]對金銀花全蛋白序列進行評估以鑒定WRKY基因, 進一步使用保守域預測軟件CDD[24]確保候選基因含有WRKY保守域．

1.2 理化性質(zhì)分析

使用 ExPASy在線軟件(https: //web.expasy.org/protparam/)對候選WRKY基因的理化性質(zhì)進行分析, 指標包括分子量(Da)、 氨基酸數(shù)量、 等電點、 不穩(wěn)定指數(shù)、 脂肪系數(shù)和平均親疏水性．

1.3 進化分析

提取金銀花和擬南芥WRKY蛋白的WRKY結(jié)構(gòu)域序列, 使用進化樹分析軟件Mega7[25]內(nèi)置Clustalx進行多序列比對, 然后根據(jù)NJ方法進行進化樹的構(gòu)建與分析, 執(zhí)行參數(shù): Poission correction, pairwise deletion 和 bootstrap(1 000次重復)．

1.4 共線性分析

使用MCscanX軟件[26], 在默認參數(shù)下分析家族成員的復制事件． 結(jié)合家族成員的染色體位置信息, 使用TBtools軟件繪制基因共線性圖．

1.5 啟動子順式作用元件分析

以全基因組數(shù)據(jù)庫為基礎, 利用TBtools[27]獲取基因上游2 000 bp的基因組序列, 然后遞交至PlantCARE網(wǎng)站進行啟動子順式作用元件分析[28], 最后通過TBtools[27]對啟動子功能元件進行可視化操作．

1.6 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)WRKY蛋白的長度信息及結(jié)構(gòu)域的定位信息, 使用TBtools軟件[27]可視化金銀花WRKY蛋白的結(jié)構(gòu)域．

1.7 熱圖分析

從金銀花功能基因組數(shù)據(jù)庫(LjaFGD)[29]中獲取兩組不同轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達量, 用 TBtools的heatmap工具繪制WRKY基因家族表達熱圖, 分析基因表達與金銀花表型的關(guān)系．

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花WRKY基因家族鑒定與理化性質(zhì)預測

本研究采用WRKY家族固有的結(jié)構(gòu)域來鑒定金銀花的WRKY家族基因, 在金銀花全基因組水平上共鑒定了46個WRKY基因． 結(jié)果表明WRKY基因的編碼蛋白分子量在15 963.55～80 967.23 Da之間, 氨基酸數(shù)量在149～748之間, 等電點在4.75～9.71之間, 不穩(wěn)定系數(shù)在40.97～67.76之間, 脂肪系數(shù)在41.00～71.05之間, 平均親疏水性在-1.147～-0.463之間(表1)．

表1 金銀花WRKY基因家族及理化性質(zhì)的預測

2.2 進化及共線性分析

本研究對金銀花和擬南芥WRKY保守結(jié)構(gòu)域序列進行了多序列比對, 然后使用Mega7軟件對WRKY基因家族進行進化樹構(gòu)建, 并使用在線工具iTOL[30]進行展示(圖1)． 結(jié)果表明金銀花的WRKY家族可分為3個亞家族, 其中亞家族的基因數(shù)量分別是16, 13, 17個． 另外, 本研究對基因的旁系同源關(guān)系進行預測, 并對WRKY基因在金銀花中的共線性進行分析, 發(fā)現(xiàn)WRKY家族有明顯的重復現(xiàn)象, 這表明在金銀花的進化過程中可能發(fā)生過加倍(圖2)．

圖1 金銀花WRKY基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 金銀花WRKY基因家族在染色體上的加倍情況

2.3 啟動子作用元件分析

對WRKY基因家族的啟動子區(qū)域的功能元件進行分析, 結(jié)果表明許多與光應答(如part of a light response element)、 激素應答(如auxin-response element)和逆境應答(如wound-response element)相關(guān)的功能元件出現(xiàn)在金銀花WRKY家族基因的啟動子區(qū)域(圖3), 說明金銀花的WRKY基因可能參與了光應答、 激素應答和逆境應答等過程．

圖3 金銀花WRKY基因家族的啟動子區(qū)域功能元件分布情況

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)分析

本研究通過Pfam網(wǎng)站提供的在線工具預測金銀花WRKY家族蛋白可能含有的功能結(jié)構(gòu)域(圖4), 發(fā)現(xiàn)所有的WRKY基因均含有WRKY結(jié)構(gòu)域, 部分WRKY基因含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域, 主要集中在第1組中． 一些WRKY基因家族還含有其他的結(jié)構(gòu)域, 如LjWRKY13除了含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域外, 還含有PK_Tyr_Ser-Thr結(jié)構(gòu)域, 第2組中的5個成員含有Plant_zn_clust結(jié)構(gòu)域, 這些結(jié)構(gòu)的差異可能是導致WRKY家族蛋白發(fā)生功能分化的原因之一．

圖4 金銀花WRKY家族蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

2.5 表達譜分析

本研究從LjaFGD金銀花功能基因組數(shù)據(jù)庫[29]中收集了兩組金銀花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達值, 構(gòu)建了金銀花WRKY基因的表達矩陣, 根據(jù)矩陣進一步構(gòu)建了基因表達熱圖(圖5)． 第1組數(shù)據(jù)包括了幼芽期、 第3綠期、 全白期、 銀花期和金花期(圖5a), 第1組數(shù)據(jù)的第1簇、 第2簇的WRKY基因在幼芽期的表達高于開花期的表達, 因此可能在花的發(fā)育過程中發(fā)揮了作用． 第1組數(shù)據(jù)的第3簇在金花期表達顯著高于其他期, 因此可能在銀花期轉(zhuǎn)變?yōu)榻鸹ㄆ诘倪^程中發(fā)揮了作用． 第2組數(shù)據(jù)包括對照, 50%光照和20%光照(圖5b), 第2組數(shù)據(jù)的第2簇、 第4簇中的WRKY基因在低光強度下表達分別高于和低于對照, 因此可能參與了光的應答過程． 以上分析結(jié)果表明許多WRKY基因可能參與了金銀花的開花和光應答過程．

圖5 金銀花WRKY基因在兩組不同轉(zhuǎn)錄組中的表達熱圖

3 討論與結(jié)論

本研究在全基因組范圍內(nèi)對金銀花的WRKY家族基因進行了鑒定并分析, 發(fā)現(xiàn)其WRKY基因家族可能在生長發(fā)育、 逆境應答過程中發(fā)揮著重要作用, 如調(diào)控金銀花花色變化、 干旱和水分脅迫應答等．WRKY基因參與金銀花花色調(diào)控雖然沒有報道, 但是在杜鵑花的研究中表明WRKY在開花后期可能參與了花色的形成[31]; 在番茄的研究中表明WRKY8參與了干旱和鹽脅迫的耐受性[32]; 在大豆的研究中表明GmWRKY基因在脫水和鹽脅迫下可能發(fā)揮作用[33]． 這些分析將為更深入研究金銀花的WRKY基因功能奠定重要的基礎．

大量的研究已經(jīng)表明高等植物的WRKY基因家族在其生長發(fā)育、 逆境應答等過程中起著重要作用． 本研究根據(jù)金銀花WRKY基因的序列特點將WRKY基因分成了3個不同的亞家族． 不同分支上的亞家族之間可能由于序列的差異導致功能存在一定的分化, 進而產(chǎn)生WRKY基因功能的多樣性． 有研究表明金銀花在全基因組水平上發(fā)生了染色體加倍事件[34], 本研究對WRKY基因在不同染色體上的重復性分布進行了分析, 發(fā)現(xiàn)WRKY基因存在顯著的基因組加倍情況, 這種加倍情況可能是染色體加倍所致． 以上分析結(jié)果為將來開展WRKY基因功能分析提供了思路．

為了進一步分析金銀花WRKY基因的潛在功能, 本研究選用順式作用元件分析與基因表達分析共同探索金銀花WRKY基因存在的功能． 通過順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)許多與光應答、 激素應答和生長發(fā)育相關(guān)的功能元件出現(xiàn)在WRKY基因家族的啟動子區(qū)域, 而通過分析不同光照強度的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了一些存在顯著差異表達的WRKY基因, 這些差異表達基因很可能參與了光應答過程． 此外,WRKY基因參與激素應答、 生長發(fā)育等過程在植物中也有報道[35-38], 表明該分析結(jié)果具有一定的可信度． 通過表達分析發(fā)現(xiàn)許多WRKY基因的表達與金銀花生長發(fā)育階段的趨勢相一致, 表明WRKY基因很有可能參與了金銀花的生長發(fā)育過程．

本研究對全基因組范圍內(nèi)的金銀花WRKY家族基因進行鑒定, 并利用不同類型的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行表達分析, 發(fā)現(xiàn)WRKY基因家族可能在光應答、 花發(fā)育和花色調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用, 結(jié)果為深入開展金銀花WRKY基因的功能研究奠定了基礎．