袁連玉， 韓雨欣， 代洪葦， 鄭姝婷， 童華榮

西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

赤霉素(GA)是一類重要的植物激素, 對(duì)植物芽葉的生長(zhǎng)和莖的伸長(zhǎng)有重要的促進(jìn)作用, 植物可通過(guò)赤霉素合成和赤霉素細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[1-2]． 茶樹(shù)是重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物, 研究茶樹(shù)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控途徑, 對(duì)解釋茶樹(shù)的形態(tài)建成過(guò)程, 尤其是葉片的發(fā)育非常重要． GID1s(Gibberellin insensitive dwarf1)為GA受體蛋白, 是一種可溶性蛋白, 其基因家族成員已在多種植物中被克隆研究, 如水稻[3]、 葡萄[4]、 李[5]、 柑橘[6]和百子蓮[7]等, 且均定位于細(xì)胞核． GID1s受體蛋白能夠識(shí)別活性GA并與之結(jié)合, 使其構(gòu)象發(fā)生改變, 從而提高其與轉(zhuǎn)錄抑制因子DELLA蛋白的相互作用, 加速DELLA的泛素化通路[1, 7], 最終形成GA-GID1-DELLA 三聚體, 使得DELLA蛋白的抑制作用減弱, 導(dǎo)致DELLA蛋白被降解, 激活了植物對(duì)GA的反應(yīng)[3, 8-9]．GID1s基因的表達(dá)會(huì)影響植物的株高及開(kāi)花過(guò)程, 水稻過(guò)表達(dá)OsGID1基因表現(xiàn)出GA敏感表型, 株高增加[3]． 在楊樹(shù)和擬南芥中過(guò)表達(dá)PtGID1基因也可以促使其花期提前, 株高增加[10]． 擬南芥中已被鑒定出3個(gè)具有GA受體功能的GID1s基因, 分別命名為AtGID1A,AtGID1B與AtGID1C, 他們?cè)谒馔緩街卸季哂刑厥獾墓δ躘11]． 在蛋白水解GA信號(hào)途徑中,AtGID1A在莖的伸長(zhǎng)和繁殖力中起到主要的作用,AtGID1C在莖的伸長(zhǎng)中起到次要作用,AtGID1B在繁殖力中起到次要作用[12]． 在非蛋白水解途徑中,AtGID1A在發(fā)芽和莖的伸長(zhǎng)中起到主要作用, 在繁殖力中起到次要作用;AtGID1B在莖的伸長(zhǎng)中起到次要作用, 在繁殖力中起到最主要的作用[13]． 此外, 龍眼GID1蛋白在種子萌發(fā)和花苞發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[14]; 在水稻中超表達(dá)GID1a基因能使葉子保持較長(zhǎng)時(shí)間的綠色, 從而增加植株生物量[2]; 在紫花苜蓿中GID1b基因主要作用于根和花的發(fā)育過(guò)程[15]．

茶樹(shù)作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物, 其生物學(xué)形態(tài)建成對(duì)茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量等有著十分重要的影響, 了解 GA在茶樹(shù)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有利于提升茶樹(shù)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值． 前人研究較少涉及茶樹(shù)GID1受體對(duì)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用, 而茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)的公布使得CsGID1s基因家族的全基因組鑒定及功能分析成為可能． 本研究在茶樹(shù)全基因組范圍內(nèi)鑒定和克隆了3個(gè)CsGID1s基因家族成員, 分別命名為CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C, 利用全面的生物信息學(xué)方法分析了該家族成員的特征特性, 分析驗(yàn)證CsGID1s基因在茶樹(shù)不同品種、 不同組織及不同非生物逆境脅迫和不同濃度的外源GA3處理下的表達(dá)特征, 為茶樹(shù)CsGID1s基因的功能及茶樹(shù)中GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究提供參考．

1 材料與方法

1.1 材料

以10年生茶樹(shù)‘福鼎大白’為材料進(jìn)行茶樹(shù)GA受體蛋白的克隆及花和葉不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析等試驗(yàn), 材料茶樹(shù)種植于西南大學(xué)茶樹(shù)種質(zhì)資源圃內(nèi), 分別取‘福鼎大白’茶樹(shù)的老葉、 芽等不同組織材料1 g, 液氮速凍后, 存儲(chǔ)于-80 ℃超低溫冰箱中備用．

試驗(yàn)試劑: 多糖多酚植物RNA提取試劑盒, 北京艾德萊生物科技有限公司; 一步法反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液, 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司; Taq DNA聚合酶, pMD18-T, DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和DNA切膠回收試劑盒, 天根生化科技(北京)有限公司; 熒光定量PCR試劑超混液, 美國(guó)伯樂(lè)生物技術(shù)有限公司; 引物合成和基因測(cè)序, 英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司．

1.2 茶樹(shù)GA受體蛋白家族成員的克隆

以‘福鼎大白’茶樹(shù)的老葉及芽頭為材料, 參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟, 提取總RNA; 經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠及分光光度計(jì)法檢驗(yàn)合格后, 按照一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄, 合成用于基因克隆及表達(dá)分析的cDNA模板． 克隆茶樹(shù)GA受體蛋白基因, 所用引物序列見(jiàn)表1． PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃, 3min; 94 ℃, 30 s; 55 ℃, 30 s; 72 ℃, 2 min; 34個(gè)循環(huán)后, 72 ℃, 5min, 瓊脂糖電泳, 切膠回收, 連接pMD18-T載體測(cè)序, 并與TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的序列進(jìn)行比對(duì), 確定克隆序列的準(zhǔn)確性．

1.3 茶樹(shù)GA受體蛋白家族的生物信息學(xué)分析

分 別 從 擬 南 芥 數(shù) 據(jù) 庫(kù)TAIR和JGI-Phytozome 12 中下載擬南芥、 水稻、 葡萄、 楊樹(shù)和紫蘇柳等植物GID1s基因的核苷酸和蛋白質(zhì)序列, 并利用本地Blast方法在茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TPIA中鑒定并下載茶樹(shù)CsGID1s基因的預(yù)測(cè)序列及其相關(guān)數(shù)據(jù)． 利用軟件對(duì)CsGID1s蛋白的分子量、 等電點(diǎn)進(jìn)行分析, 利用軟件SOPM和SWISS-MODEL分析CsGID1s蛋白的結(jié)構(gòu)模型, 運(yùn)用軟件ClustalX1.8, MEGA4.0和DNAMAN進(jìn)行茶樹(shù)CsGID1s蛋白的氨基酸序列比對(duì)． 采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), Bootstrap參數(shù)1 000, 其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值; 通過(guò)在線軟件MEME分析茶樹(shù)CsGID1s蛋白的保守基序, 并將最大數(shù)值設(shè)為20． 利用Plant-mPLoc進(jìn)行CsGID1s蛋白的亞細(xì)胞定位分析; 利用軟件Plantcare分析預(yù)測(cè)從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TPIA中下載的CsGID1s基因上游1.5 kb啟動(dòng)子序列中含有的順式作用元件． 本研究還利用模式植物擬南芥AtGID1s蛋白家族在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING中的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò), 分析與茶樹(shù)CsGID1s相關(guān)聯(lián)的蛋白．

1.4 茶樹(shù)GA受體蛋白基因的表達(dá)分析

從TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了CsGID1s在‘舒茶早’茶樹(shù)8個(gè)組織部位(根、 莖、 芽頭、 花、 果、 嫩葉、 成熟葉和老葉)及其葉片中CsGID1s基因在鹽、 冷、 干旱和MeJA等不同非生物逆境脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的數(shù)據(jù), 并利用Tbtools繪制熱圖． 為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)量, 本研究還采用熒光定量PCR檢測(cè)CsGID1s基因在茶樹(shù)8個(gè)組織部位中的表達(dá)量; 為了解CsGID1s基因在茶樹(shù)中的功能, 本研究對(duì)‘福鼎大白’茶樹(shù)2年生扦插苗進(jìn)行外源GA3脅迫處理, 分析CsGID1s基因的表達(dá)特異性． 外源GA3處理流程: 在3個(gè)藍(lán)色方形塑料盆中, 分別加入MS液體培養(yǎng)基(對(duì)照), MS液體培養(yǎng)基+75 μmol/L GA, MS液體培養(yǎng)基+100 μmol/L GA, 對(duì)‘福鼎大白’茶樹(shù)的扦插苗進(jìn)行水培及GA處理, 分別在人工氣候箱(16 h白/8 h黑, 光照強(qiáng)度15 000 Lx, 溫度23 ℃, 濕度75%)中培養(yǎng) 24 h和48 h后, 對(duì)茶苗成熟度一致的第2葉進(jìn)行取樣, 液氮速凍后, 放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?采用多糖多酚RNA提取試劑盒方法提取樣本的總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板, 用于CsGID1s基因的表達(dá)特異性分析． 用Primer3軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1), 內(nèi)標(biāo)基因?yàn)椴铇?shù)肌動(dòng)蛋白基因(Actin)． 10 μL Real-Time PCR反應(yīng)體系: SYBR Premix 5μL, 濃度為10 μmol/L的上下游引物各 0.2 μL, cDNA 0.5 μL, 滅菌超純水ddH2O 4.1 μL, 充分混勻, 于Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增分析, 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃, 10 s; 95 ℃, 5 s; 55 ℃, 5 s, 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)． 每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次試驗(yàn)重復(fù), 采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果, 用Sigma plot軟件分析差異顯著性并制圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)GA受體蛋白基因家族的鑒定

為研究茶樹(shù)中GA受體蛋白的功能, 本研究利用模式植物中GA受體蛋白的序列信息, 在茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行本地Blast搜索鑒定, 共獲得 3個(gè)同源的茶樹(shù)GA受體蛋白基因, 分別命名為CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C． 本研究以‘福鼎大白’茶樹(shù)的老葉提取RNA, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板, 克隆獲得了2個(gè)茶樹(shù)中的GA受體蛋白基因:CsGID1A和CsGID1B, 長(zhǎng)度分別為1 041 bp和1 293 bp; 以‘福鼎大白’茶樹(shù)的芽頭為材料, 通過(guò)RT-PCR的方法, 克隆獲得1個(gè)茶樹(shù)中的GA受體蛋白基因:CsGID1C, 長(zhǎng)度為1 023 bp(圖1)． 生物信息學(xué)方法分析3個(gè)基因的核苷酸和氨基酸序列, 結(jié)果表明其分別編碼346 aa, 430 aa, 340 aa長(zhǎng)度的氨基酸殘基, 分子量分別為39.42, 48.42和38.53 kDa; 蛋白的等電點(diǎn)分別為8.31, 5.97和5.63; 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析顯示, 3個(gè)GA受體蛋白均定位于細(xì)胞核, 這與模式植物中的GA受體蛋白的亞細(xì)胞定位信息一致(表2)． 染色體定位分析結(jié)果顯示, 3個(gè)CsGID1s基因分別定位于茶樹(shù)(‘舒茶早’)的2號(hào), 6號(hào)和7號(hào)染色體(圖2)．

M為分子標(biāo)記, A為CsGID1A, B為CsGID1B, C為CsGID1C．

圖2 茶樹(shù)CsGID1s基因的染色體定位

表2 茶樹(shù)基因組中的GA受體蛋白家族成員及其理化性質(zhì)

2.2 茶樹(shù)GA受體蛋白系統(tǒng)發(fā)育及蛋白保守結(jié)構(gòu)域組成

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示, 茶樹(shù)中的3個(gè)GA受體蛋白與其他植物中的該蛋白氨基酸序列具有高度的保守性, 其中茶樹(shù)中的CsGID1s蛋白與葡萄的VvGID1s蛋白的親緣關(guān)系最近(圖3)． 保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果還顯示, GID1s蛋白家族成員在不同植物中具有高度的保守性, 不同植物GIDs蛋白序列中含有保守基序的種類和數(shù)量基本一致, 只存在極少數(shù)保守序列差異． 茶樹(shù)中的3個(gè)GA受體蛋白也是一樣, 除了CsDID1s蛋白的N端有一段不含保守基序的序列外, 其余均與其他植物中已知的GID1s蛋白一致, 具有極其相似的保守基序． 為了進(jìn)一步分析這些保守基序的特征, 本研究將多種植物中GID1s蛋白進(jìn)行了多序列比對(duì)(圖4), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)中的3個(gè)GIDs蛋白具有GA受體蛋白所具有的幾乎所有保守結(jié)構(gòu)域, 如GID1類蛋白含有TWVLIS, LDR, FFHGGSF, HS, IYD, YRR, DGW, GDSSGGNI, GNI, MF, LDGKYF, WYW和GFY這13個(gè)功能結(jié)構(gòu)域[8]; 也包括GID1和HSL家族的保守域HGG和GXSXG, 以及HSL家族中催化3聯(lián)體氨基 Ser(S), Asp(D)和His(H), 但CsGID1B氨基酸序列中H發(fā)生突變, 被V取代, 導(dǎo)致HSL蛋白失去生物催化活性[8-9]． 與其他GID1一樣, CsGID1A和CsGID1C氨基酸序列中H被I取代． 以上結(jié)果均證明, 本研究中克隆獲得的3個(gè)CsGID1s蛋白均為典型的GA受體蛋白, 可能具有類似的功能．

不同顏色的方塊和數(shù)字代表不同的保守基序: AtGID1s為擬南芥GID1s蛋白, OsGID1s為水稻GID1s蛋白, VvGID1s為葡萄GID1s蛋白, PtrGID1s為楊樹(shù)GID1s蛋白, CsGID1s為茶樹(shù)GID1s蛋白, SpGID1s 為紫蘇柳GID1s蛋白．

▁為 GID1s和HSL家族的13個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的序列及位置; ▼為 GA受體蛋白GID1s蛋白的活性催化堿基, ▽為 HSL家族中催化三聯(lián)體氨基酸的位置．

2.3 茶樹(shù)CsGID1s蛋白的二、 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

本研究還對(duì)茶樹(shù)CsGID1s蛋白的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能進(jìn)行了分析(圖5), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)CsGID1s蛋白中, 自由卷曲所占的比例均最大, 分別為34.89%(CsGID1A), 35.26%(CsGID1B), 37.24%(CsGID1C); 其次是α-螺旋, 分別為30.83%(CsGID1A), 34.97%(CsGID1B)和29.33%(CsGID1C); 延長(zhǎng)鏈和β折疊所占的比例也較大． 以已知GA受體蛋白2zsh.1為模板, 用SWISS-MODEL 在線軟件分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6), 結(jié)果顯示CsGID1A, CsGID1B和CsGID1C 3個(gè)蛋白的空間結(jié)構(gòu)非常相似, 均具有由8個(gè) β 折疊片層和7個(gè)α 螺旋組成的GID1蛋白核心結(jié)構(gòu), 都屬于α/β折疊水解酶超家族中的羧酸酯酶家族的典型三級(jí)結(jié)構(gòu), 由此可推測(cè)CsGID1s蛋白家族具有相同的生物學(xué)功能．

圖5 茶樹(shù)CsGID1s蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

圖6 茶樹(shù)CsGID1s蛋白的3D空間結(jié)構(gòu)

2.4 茶樹(shù)CsGID1s基因的時(shí)空表達(dá)特異性分析

為明確CsGID1s蛋白在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控功能, 本研究分析了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中CsGID1s基因在17種山茶屬植物葉片和茶樹(shù)不同組織部位的表達(dá)特異性． 圖7a中,CsGID1A基因在云抗10號(hào)(CSA)、 禿房茶(TF)、 厚葉紅山茶(HZ)和大理茶(CTA)等的葉片中表達(dá)量較低;CsGID1B和CsGID1C基因無(wú)明顯種屬間的表達(dá)差異, 且其中表達(dá)量由大到小依次為CsGID1C,CsGID1B,CsGID1A． 圖7b中, 在茶樹(shù)的不同組織部位,CsGID1C基因的表達(dá)量均較高;CsGID1A和CsGID1B基因在芽、 嫩葉和花中的表達(dá)量較低, 在根、 莖、 成熟葉和老葉中的表達(dá)量較高, 在茶果中的表達(dá)量最高． 以上結(jié)果表明, 3個(gè)CsGID1s基因可能在茶樹(shù)的不同組織中發(fā)揮的功能存在差異．

2.5 茶樹(shù)CsGID1s基因響應(yīng)非生物逆境脅迫的表達(dá)特異性分析

為了進(jìn)一步明確CsGID1s基因的功能, 本研究從TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了CsGID1s基因響應(yīng)NaCl、 干旱、 MeJA和冷等不同非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 并分析了其表達(dá)特異性(圖8)． 在NaCl和干旱脅迫條件下,CsGID1A基因的表達(dá)是升高的,CsGID1B和CsGID1C基因的表達(dá)是被抑制的． 在冷脅迫條件下,CsGID1A基因的表達(dá)受到抑制,CsGID1B基因的表達(dá)受到誘導(dǎo),CsGID1C基因的表達(dá)無(wú)明顯變化． 在外源JA 激素的脅迫下,CsGID1B基因的表達(dá)在24 h時(shí)略有升高, 48 h后又恢復(fù)正常;CsGID1A和CsGID1C基因的表達(dá)基本不受影響, 變化不明顯． 由以上結(jié)果可以推測(cè), 茶樹(shù)CsGID1s基因可能參與了茶樹(shù)應(yīng)對(duì)鹽、 干旱和冷等非生物逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程, 但對(duì)外源JA激素的響應(yīng)較?。?/p>

藍(lán)色代表低表達(dá), 紅色代表高表達(dá)． a圖中N0, N24, N48和N72為200 mol/L NaCl處理0 h, 24 h, 48 h, 72 h; b圖中CK為未冷馴化處理對(duì)照, CA1和CA3分別為完全馴化和去馴化; c圖中J0, J24, J48和J72分別為MeJA處理0 h, 24 h, 48 h和72 h; d圖中P0, P24, P48和P72分別為25% PEG處理0 h, 24 h, 48 h和72 h．

2.6 CsGID1s啟動(dòng)子片段順式作用元件分析

為進(jìn)一步分析CsGID1s基因的功能, 本研究分別下載該基因家族成員的啟動(dòng)子序列, 并運(yùn)用在線軟件Plantcare進(jìn)行分析．CsGID1s基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)順?lè)醋釉?表3), 其中CAAT-box和TATA-box常規(guī)關(guān)鍵順?lè)醋釉臄?shù)量較多． 在CsGID1B和CsGID1C基因啟動(dòng)子中分別含有1個(gè)能夠參與赤霉素GA響應(yīng)的TATC-box和P-box順?lè)醋釉?在該家族基因的啟動(dòng)子序列中含有較多的光響應(yīng)元件, 如chs-CMA2a, Box 4, AT1-motif, GATA-motif, GA-motif和GT1-motif． 另外, 在CsGID1s基因啟動(dòng)子序列中還含有響應(yīng)干旱、 冷和厭氧等外界非生物逆境及外界外源激素誘導(dǎo)的元件． 由以上結(jié)果可以推測(cè),CsGID1s基因家族成員可能參與了赤霉素的代謝過(guò)程, 并且可能廣泛參與茶樹(shù)對(duì)外界非生物逆境的響應(yīng)過(guò)程．

表3 CsGID1s啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

2.7 茶樹(shù)CsGID1s蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究還利用擬南芥同源的AtGID1s蛋白進(jìn)行了CsGID1s蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)分析． 圖9顯示, 茶樹(shù)CsGID1s蛋白間均存在相互作用關(guān)系, 而與其存在相互作用關(guān)系的蛋白均與赤霉素GA的合成、 結(jié)合及其運(yùn)輸?shù)却x過(guò)程有關(guān), 其中包含DELLA蛋白(RGA1, RGL1, RGL2, RGL3及GAI 等), GA3, SLY1及 GA3OX1 等． 由此可推測(cè), CsGID1s蛋白可與GA吸收、 轉(zhuǎn)運(yùn)、 代謝相關(guān)的蛋白相互作用, 共同調(diào)控茶樹(shù)對(duì)赤霉素GA的代謝過(guò)程．

圖9 依據(jù)擬南芥同源蛋白推測(cè)茶樹(shù)CsGID1s相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.8 茶樹(shù)CsGID1s基因表達(dá)特異性分析

為了進(jìn)一步分析茶樹(shù)CsGID1s基因的功能, 本研究還利用熒光定量PCR分析了該基因家族在茶樹(shù)葉片和花中不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性． 圖10顯示,CsGID1C基因在葉片不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量均高于CsGID1A和CsGID1B基因． 在葉片由芽頭→嫩葉→成熟葉→老葉的發(fā)育過(guò)程中,CsGID1s基因的表達(dá)先升高再降低, 在芽頭、 成熟葉和老葉中的表達(dá)量要低于嫩葉(CsGID1A除外)． 該部分基因的表達(dá)規(guī)律與圖7數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致, 可能是因?yàn)椴牧蠈儆诓煌贩N和采樣時(shí)對(duì)葉片成熟度的定義有關(guān)． 圖11中,CsGID1B基因在花不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量均遠(yuǎn)低于CsGID1A和CsGID1C基因; 在花由花苞→露白→初開(kāi)→全開(kāi)→盛開(kāi)的發(fā)育過(guò)程中,CsGID1s基因的表達(dá)也是先升高再降低, 在花的初開(kāi)和全開(kāi)時(shí)期的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于其他時(shí)期． 由以上結(jié)果可知,CsGID1s基因的表達(dá)存在時(shí)空特異性．

小寫(xiě)字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

小寫(xiě)字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2.9 茶樹(shù)CsGID1s基因響應(yīng)外源赤霉素GA3的表達(dá)特異性分析

為了解CsGID1s基因的功能, 本研究對(duì)2年生‘福鼎大白’茶苗進(jìn)行了外源GA3的脅迫處理, 并分析了脅迫處理后的CsGIDs基因的表達(dá)情況(圖12)． 與對(duì)照MS培養(yǎng)的茶苗為對(duì)照, 在75 μmol/L GA3處理24 h后,CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C基因的表達(dá)均受到抑制, 表達(dá)量下降; 在75 μmol/L GA3 處理48 h后,CsGID1A和CsGID1B基因的表達(dá)繼續(xù)受到抑制, 表達(dá)量較低, 而CsGID1C基因的表達(dá)受到誘導(dǎo), 表達(dá)量被上調(diào)． 在100 μmol/L GA3處理24 h后,CsGID1A,CsGID1B基因的表達(dá)量下降, 但在處理48 h后, 該2個(gè)基因的表達(dá)會(huì)被明顯上調(diào); 在100 μmol/L GA3處理24 h, 48 h后,CsGID1C基因的表達(dá)均受到誘導(dǎo), 表達(dá)量被明顯上調(diào)． 以上結(jié)果推測(cè), 茶樹(shù)中CsGID1s基因的表達(dá)在不同濃度GA3的不同處理時(shí)間時(shí)其表達(dá)量是不一致的, 較為明顯的規(guī)律為低濃度外源GA3, 處理時(shí)間較短時(shí),CsGID1s基因的表達(dá)受到抑制; 高濃度外源GA3, 處理時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),CsGID1s基因的表達(dá)會(huì)被誘導(dǎo), 表達(dá)量明顯被上調(diào)．

小寫(xiě)字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

3 討論

自20世紀(jì)50年代GA被列入植物激素以來(lái), 人們對(duì)其在植物中調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及代謝途徑的機(jī)理方面進(jìn)行了很多研究, GID1s蛋白作為GA受體, 也被廣泛探討． 2005年,GID1s基因最早在水稻中被分離出來(lái)[3], 擬南芥中被發(fā)現(xiàn)了3個(gè)GID1s同源基因[16]． 目前, GID1s蛋白已經(jīng)在多種植物中被克隆獲得, 本研究利用已公布的茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 在全基因組水平上分析鑒定, 并從‘福鼎大白’茶樹(shù)中克隆獲得3個(gè)CsGID1s基因:CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C, 其分子量、 等電點(diǎn)與其編碼區(qū)長(zhǎng)度均與擬南芥中 GID1s 蛋白具有高度的同源性, 且均定位于細(xì)胞核(表2)． 茶樹(shù)中的GIDs蛋白的數(shù)量與擬南芥相同． 茶樹(shù)的3個(gè)CsGID1s蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、 三級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥[16]、 水稻[3]、 葡萄[4]等植物的GID1s蛋白高度相似, 含有植物GID1s家族成員的TWVLIS, LDR, FFHGGSF, HS, IYD, YRR, DGW, GDSSGGNI, GNI, MF, LDGKYF, WYW和GFY等多個(gè)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用的特征性結(jié)構(gòu)域(圖4), 說(shuō)明茶樹(shù)的CsGID1s蛋白也高度保守, 是參與茶樹(shù)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程調(diào)控的重要蛋白．

GID1s受體廣泛參與種子萌發(fā)、 莖的伸長(zhǎng)、 花器官分化及果實(shí)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控． GID1s可打破唐菖蒲、 山藥的種子休眠過(guò)程, 促進(jìn)萌發(fā)[17-18]; 龍眼GID1蛋白能促進(jìn)植株增高, 促進(jìn)花苞發(fā)育[14]; 辣椒GID1可以促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)[19]． 此外, 還發(fā)現(xiàn)葡萄中該基因?qū)涡越Y(jié)實(shí)及果實(shí)形成過(guò)程有重要作用[20], 在茶樹(shù)中越冬芽解除休眠與GA及其受體基因也有關(guān)系[21]． 茶樹(shù)CsGID1s基因在不同組織部位中的表達(dá)量不同, 且在葉片和花的不同發(fā)育階段其表達(dá)量也有明顯不同, 說(shuō)明CsGID1s基因在茶樹(shù)不同組織及不同發(fā)育時(shí)期通過(guò)調(diào)控不同的代謝途徑而發(fā)揮不同的生理功能． 在16種不同的山茶科植物中, CsGIDs的表達(dá)量也存在明顯差異, 這可能與不同的屬種間發(fā)芽早晚、 開(kāi)花多少等生理特性有關(guān)．

啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn), 茶樹(shù)CsGID1s基因的啟動(dòng)子序列中均含有GA相應(yīng)元件, 另外還含有逆境脅迫響應(yīng)元件． 使用外源GA3對(duì)茶苗進(jìn)行脅迫處理, 在低濃度、 處理時(shí)間較短時(shí),CsGID1s基因的表達(dá)受到抑制; 在高濃度、 處理時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),CsGID1s基因的表達(dá)會(huì)被誘導(dǎo), 推測(cè)CsGID1基因的轉(zhuǎn)錄水平受到GAs的反饋抑制調(diào)節(jié), 該結(jié)論與板栗[22]、 棉花[23]、 葡萄[4]的研究結(jié)果一致． 且茶樹(shù)CsGID1s蛋白還能與赤霉素GA的合成、 結(jié)合及其運(yùn)輸?shù)却x過(guò)程有關(guān)的DELLA, GA3, SLY及GA3OX1等蛋白相互作用, 共同參與茶樹(shù)的GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程． 由此可知, CsGID1s家族成員參與茶樹(shù)對(duì)外源GA及其他非生物逆境的響應(yīng)過(guò)程．

系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系表明茶樹(shù)與葡萄親緣關(guān)系最近, 兩者同屬雙子葉植物, VvGID1s蛋白通過(guò)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育, 從而為無(wú)籽葡萄的生產(chǎn)提供理論依據(jù)[24]． 本研究推測(cè)茶樹(shù)CsGID1s蛋白可通過(guò)赤霉素GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控茶樹(shù)生殖生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化過(guò)程, 對(duì)茶樹(shù)增產(chǎn)等經(jīng)濟(jì)價(jià)值有著十分重要的意義． 此外, 茶樹(shù)中GID1s蛋白對(duì)茶樹(shù)形態(tài)學(xué)建成及抗逆過(guò)程起著重要的調(diào)節(jié)作用, 進(jìn)一步研究GA受體在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)解機(jī)制對(duì)茶樹(shù)果實(shí)的發(fā)育以及茶芽越冬管理有著十分必要的參考價(jià)值．

4 結(jié)論

本研究從茶樹(shù)基因組中克隆獲得3個(gè)茶樹(shù)GA受體蛋白基因:CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C． 茶樹(shù)CsGID1s蛋白具有高度的保守性;CsGID1s基因存在組織表達(dá)時(shí)空特異性, 且受到外源GA3和其他非生物逆境的影響． 根據(jù)本研究結(jié)果推斷CsGID1s基因家族成員廣泛參與了茶樹(shù)中赤霉素GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其他非生物逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程, 為深入分析茶樹(shù)GA受體蛋白的功能提供了一定參考．