陳吉 姚歡歡 李能

[摘要]?目的?探究含活血通絡方血清調(diào)控IncRNA?MEG3對高糖誘導人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（human?retinal?microvascular?endothelial?cells，hRMECs）增殖及凋亡的影響作用。方法?選取20只SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法對10只大鼠灌胃活血通絡方，10只灌胃等量生理鹽水。灌胃結(jié)束1h后制備相應血清。分別采用5mmol/L葡萄糖或30mmol/L的D-甘露醇、葡萄糖溶液對hRMECs細胞進行誘導24h。按照誘導情況將細胞分為正常對照組（5mmol/L葡萄糖，n=6）、等滲組（30mmol/L?D-甘露醇，n=6）、高糖組（30mmol/L葡萄糖，n=6）、高糖+2.5%含藥血清組（n=6）、高糖+7.5%含藥血清組（n=6）、高糖+10%含藥血清組（n=6），相應血清干預24h。采用CCK-8法、酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞增殖情況及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）含量；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative?real-time?fluorescence?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）測定細胞IncRNA-MEG3?mRNA表達，采用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡情況；采用蛋白免疫印跡法檢測NOX4、VAV2、血管表皮生長因子受體（vascular?epidermal?growth?factor?receptor，VEGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide?3-kinase，PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）、p-AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）、p-mTOR蛋白表達情況。結(jié)果?與正常對照組比較，高糖組細胞增殖率下降，MDA含量增加，GSH-Px含量降低，凋亡增加，IncRNA-MEG3?mRNA表達降低，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、NOX4、VAV2、VEGFR蛋白表達均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+7.5%含藥血清組和高糖+10%含藥血清組細胞增殖率增加，MDA含量降低，GSH-Px含量升高，IncRNA-MEG3表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；高糖+2.5%含藥血清組、高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組的細胞凋亡下降，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、NOX4、VAV2、VEGFR蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論?含活血通絡方血清可介導IncRNA-MEG3調(diào)控相關(guān)蛋白表達來減少高糖誘導hRMECs細胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞]?糖尿病視網(wǎng)膜病變；活血通絡方；IncRNA-MEG3；凋亡

[中圖分類號]?R285.5??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.018

Study?on?the?proliferation?of?human?retinal?microvascular?endothelial?cells?induced?by?high?glucose?in?Huoxue?Tongluo?formula?containing?serum

CHEN?Ji1，?YAO?Huanhuan1，?LI?Neng2

1.Department?of?Pharmacy，?Huzhou?Third?Peoples?Hospital，?Huzhou?313000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Ophthalmology，?Hangzhou?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Hangzhou?310007，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?Huoxue?Tongluo?formula?regulates?IncRNA?MEG3?on?the?proliferation?and?apoptosis?of?human?retinal?microvascular?endothelial?cells?（hRMECs）?induced?by?high?glucose.?Methods?Twenty?SD?rats?were?selected?and?10?rats?were?gavaged?with?Huoxue?Tongluo?formula?and?10?rats?were?gavaged?with?equal?amount?of?saline?according?to?random?number?table?method.?The?corresponding?serum?was?prepared?1h?after?the?end?of?gavage.?The?hRMECs?cells?were?induced?with?5mmol/L?glucose?or?30mmol/L?D-mannitol，?glucose?solution?for?24h.?Cells?were?divided?according?to?induction?into?normal?control?（5mmol/L?glucose，?n=6），?isotonic?（30mmol/L?D-mannitol，?n=6），?high?glucose?（30mmol/L?glucose，?n=6），?high?glucose+2.5%?drug-containing?serum?（n=6），?high?glucose+7.5%?drug-containing?serum?（n=6）?and?high?glucose+10%?drug-containing?serum?（n=6）?groups?with?the?corresponding?serum?intervention?for?24h.?Cell?proliferation?and?malondialdehyde?（MDA）?and?glutathione?peroxidase?（GSH-Px）?levels?were?measured?by?CCK-8?and?ELISA.?Cellular?IncRNA-MEG3?mRNA?expression?was?measured?by?quantitative?real-time?fluorescence?polymerase?chain?reaction?（qRT-PCR）?and?apoptosis?was?measured?by?flow?cytometry.?Protein?immunoblotting?was?used?to?detect?NOX4，?VAV2，?vascular?epidermal?growth?factor?receptor?（VEGFR），?phosphoinositide?3-kinase?（PI3K），?p-PI3K，?protein?kinase?B?（AKT），?p-AKT，?mammalian?target?of?rapamycin?（mTOR），?p-mTOR?protein?expression.?Results?Compared?with?the?normal?control?group，?the?high?glucose?group?showed?decreased?cell?proliferation?rate，?increased?MDA?content，?decreased?GSH-Px?content，?increased?apoptosis，?decreased?IncRNA-MEG3?mRNA?expression，?and?increased?p-PI3K/PI3K，?p-AKT/AKT，?p-mTOR/mTOR，?NOX4，?VAV2，?and?VEGFR?protein?expression，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Compared?with?the?high?glucose?group，?the?cell?proliferation?rate?increased，?MDA?content?decreased，?GSH-Px?content?increased?and?IncRNA-MEG3?expression?increased?in?the?high?glucose?+7.5%?drug-containing?serum?group?and?the?high?glucose+10%?drug-containing?serum?group，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Apoptosis?was?decreased?in?the?high?glucose+2.5%?drug-containing?serum?group，?the?high?glucose+7.5%?drug-containing?serum?group?and?the?high?glucose+10%?drug-containing?serum?group，?and?p-PI3K/PI3K，?p-AKT/AKT，?p-mTOR/mTOR，?NOX4，?VAV2，?VEGFR?protein?expression?were?decreased，?all?differences?were?statistically?significant?（P<0.05）.?Conclusion?Huoxue?Tongluo?formula?mediates?IncRNA-MEG3-regulated?protein?expression?to?reduce?apoptosis?in?hRMECs?induced?by?high?glucose.

[Key?words]?Diabetic?retinopathy;?Huoxue?Tongluo?formula;?IncRNA-MEG3;?Apoptosis

隨著社會的發(fā)展和人口老齡化進程的不斷加快，加上人群基因易感性，我國糖尿病患者的相對數(shù)量已超出許多國家[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic?retinopathy，DR）是糖尿病常見眼部并發(fā)癥，主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜微血管病變和視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞功能障礙、退化[2]。糖代謝紊亂是導致DR的根本原因，持續(xù)的高血糖可損傷視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮，繼而引起眼部多種病理改變[3-4]。IncRNA?MEG3表達下調(diào)能夠加重DR小鼠視網(wǎng)膜血管功能障礙[5]?；钛ńj方具有益氣活血、通目絡之功效，對糖尿病大鼠的視神經(jīng)組織具有保護作用[6]?；诖?，本研究通過體外實驗，探討活血通絡方對高糖誘導人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（human?retinal?microvascular?endothelial?cells，hRMECs）的保護作用及對IncRNA?MEG3的調(diào)控作用。

1??材料與方法

1.1??動物及材料

SPF級雄性SD（sprague–dawley）大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005]。在浙江鷹旸生物科技有限公司動物中心[動物使用許可證號：SYXK（浙）2020-0033]進行常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間自由飲食水，保證每天光照12h，溫度20～22℃，相對濕度50%～70%。本研究經(jīng)湖州市第三人民醫(yī)院倫理委員會審批（倫理批準號：ZJEY-20211116-03）。

hRMECs細胞購自美國Angio?Proteomie公司，活血通絡方由醫(yī)院藥房提供；胎牛血清購于美國Transgen?Biotech公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；CCK8試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）檢測的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；NOX4、VAV2、血管表皮生長因子受體（vascular?epidermal?growth?factor?receptor，VEGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide?3-kinase，PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）、p-AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）、p-mTOR蛋白抗體購于美國Affinity公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于西隴化工股份有限公司。Micro17R型低溫高速離心機、BB150型細胞培養(yǎng)箱購于德國Thermo公司；CMaxPlus型酶標儀購于美國Molecular?Devices公司；CFX?Connect型實時熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司；Mastercycler型PCR儀購于德國Eppendorf公司；Nanodrop?one型mRNA定量儀購于德國Thermo公司；AE2000型顯微鏡購于美國Motic公司。

1.2??方法

適應性飼養(yǎng)SD大鼠1周。采用隨機數(shù)字表法對10只大鼠灌胃活血通絡方（42g/kg），10只灌胃等量生理鹽水，連續(xù)5d。灌胃結(jié)束1h后，對兩組大鼠進行頸動脈采血，離心得到含活血通絡方血清和正常血清，–20℃保存?zhèn)溆?。正常血清稀釋，含活血通絡方的血清分別制備2.5%、7.5%和10%濃度的藥物血清。

采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hRMECs細胞，于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中傳代細胞。隨后采用5mmol/L葡萄糖、30mmol/L的D-甘露醇或葡萄糖誘導細胞24h[7]。按照誘導情況將細胞分為正常對照組（5mmol/L葡萄糖，n=6）、等滲組（30mmol/L?D-甘露醇，n=6）、高糖組（30mmol/L葡萄糖，n=6）、高糖+2.5%含藥血清組（n=6）、7.5%含藥血清組（n=6）、10%含藥血清組（n=6），相應血清干預24h。

1.3??觀察指標

①細胞增殖檢測：細胞接種于96孔板，吸棄上清培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。每孔加入10μl的CCK-8試劑，孵育1h。孵育結(jié)束用酶標儀測定各細胞孔和設置孔在450nm處的吸光度值，計算相應細胞增殖率。②細胞MDA、GSH-Px指標檢測：收集細胞，離心，吸取上清液進行收集。按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書，設置空白、對照孔和實驗孔，測定吸光度值，計算MDA含量及GSH-Px活性。③細胞lncRNA-MEG3mRNA表達檢測：采用Trizol法提取RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應進行DNA擴增（引物序列：F：5-CATCTACACCTCACG?AGGG-3；R：5-ATCCTTTGCCATCCTGGTC-3），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative?real-time?fluorescence?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）檢測IncRNA?MEG3?mRNA表達。反應條件為變性95℃?10min，擴增反應為95℃?15s、60℃?60s、40次，溶解曲線為95℃?15s、60℃?60s、95℃?15s。采用2-△△CT法對結(jié)果進行相對定量分析。④細胞凋亡檢測：細胞接種于6孔板內(nèi)，吸棄多余細胞培養(yǎng)液。預冷PBS緩沖液洗滌，調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml。加入500μl結(jié)合緩沖液與細胞混合，離心棄上清液，100μl結(jié)合緩沖液重懸細胞。加入5μl?Annexin?V-FITC和10μl碘化丙啶抗體，輕微振蕩，室溫避光環(huán)境下孵育15min。400μl結(jié)合緩沖液重懸混勻細胞，采用流式細胞儀進行檢測。⑤細胞蛋白表達檢測：細胞裂解，離心提取上清液備用。采用BCA法測定總蛋白含量。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene?fluoride，PVDF）膜，封閉，以TBST緩沖液清洗。用稀釋后的抗體NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR孵育，4℃搖床過夜。隔天取出后恢復室溫，以TBST緩沖液清洗，對應二抗孵育2h，TBST緩沖液再次清洗。采用蛋白免疫印跡法檢測，讀取ECL-化學發(fā)光儀對應數(shù)值，以β-actin做內(nèi)參，計算各蛋白的相對表達量。

1.4??統(tǒng)計學方法

采用SPSS?16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用Tukey分析，多組比較采用ANOVA單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2??結(jié)果

2.1??細胞增殖率比較

等滲組的細胞增殖率與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），高糖組細胞增殖率顯著低于正常對照組（P<0.05）。高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組細胞的增殖率均顯著高于高糖組（P<0.05），見圖1。

2.2??MDA和GSH-Px含量釋放情況比較

等滲組細胞MDA、GSH-Px含量與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常對照組比較，高糖組細胞MDA含量顯著上升，GSH-Px含量顯著下降（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組的細胞MDA含量顯著下降，GSH-Px含量顯著上升（P<0.05），見表1。

2.3??lncRNA?MEG3?mRNA表達水平比較

等滲組細胞的lncRNA?MEG3?mRNA表達水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），高糖組細胞lncRNA?MEG3?mRNA表達水平顯著低于正常對照組（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組lncRNA?MEG3?mRNA表達水平均顯著增加（P<0.05），見表2。

2.4??細胞凋亡情況比較

等滲組細胞凋亡情況與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），高糖組細胞凋亡率顯著高于正常對照組（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+2.5%含藥血清組、高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組細胞的凋亡率均顯著下降（P<0.05），見圖2。

2.5??對高糖誘導細胞蛋白表達的影響

等滲組細胞各蛋白表達與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），高糖組細胞NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達均顯著高于正常對照組（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+2.5%含藥血清組、高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組細胞的NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達均顯著降低（P<0.05），見圖3、表3。

3??討論

糖尿病的主要危害在于其各種并發(fā)癥，持續(xù)的糖尿病病程與DR的病變程度增加有關(guān)[8]。DR的進展及病變分類包括血–視網(wǎng)膜通透性、血管內(nèi)皮細胞減少、血管基底膜增厚、毛細血管閉塞、視網(wǎng)膜神經(jīng)元和膠質(zhì)異常等[9]。除了高血糖對內(nèi)皮細胞的影響之外，過度的炎癥和氧化應激反應可影響視網(wǎng)膜組織細胞正常增殖[10]。臨床研究表明，活血通絡方的輔助治療對與DR患者的血糖控制及眼底滲血、出血、微血管瘤等癥狀改善均有顯著作用[11]。

本研究結(jié)果顯示，活血通絡方除了能夠減弱高糖對hRECs細胞增殖的抑制作用和促凋亡作用外，還能夠減少MDA水平，增加GSH-Px活性，減輕高糖誘導hRECs細胞的氧化應激損傷，這可能與活血通絡方的抗炎作用有關(guān)[11]。高糖環(huán)境會阻礙AKT表達并促進其磷酸化產(chǎn)物生成，激活下游信號通路進而造成視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞凋亡[12]。Fang等[13]研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號激活可加重視網(wǎng)膜上皮細胞壞死；而IncRNA?MEG3能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路表達，減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變[14-15]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導可抑制hRMECs細胞IncRNA?MEG3表達，而活血通絡方則可逆轉(zhuǎn)這一抑制作用，同時PI3K/AKT/mTOR信號通路的磷酸化產(chǎn)物相應減少，提示活血通絡方可能通過促進IncRNA?MEG3表達抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路表達，以減少高糖誘導hRMECs細胞凋亡。

血管表皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）參與調(diào)控視網(wǎng)膜血管新生，因此VEGF抑制劑被用于DR治療[16]。李聰翀等[17]發(fā)現(xiàn)VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT信號軸可介導血管新生調(diào)控。VEGF和VAV2高表達于肝血管生成和轉(zhuǎn)移活躍中的肝癌細胞中，抑制VAV2表達后，肝癌細胞血管形成和轉(zhuǎn)移能力下降[18]。而敲除視網(wǎng)膜細胞中NOX4表達可以減輕病理性視網(wǎng)膜血管生成[19]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導促進hRECs細胞VEGFR、NOX4、VAV2蛋白的表達，而活血通絡方能夠抑制這些促進血管形成相關(guān)蛋白表達，提示其可能具有抑制視網(wǎng)膜新生血管增殖作用，但其是否通過IncRNA?MEG3介導則還需要相關(guān)實驗進一步明確。

綜上所述，活血通絡方可通過促進lncRNA?MEG3表達抑制高糖誘導hRMECs細胞凋亡損傷及血管生成相關(guān)蛋白的表達，并促進細胞增殖。未來將基于IncRNA?MEG3表達，進一步深入探究活血通絡方對DR的改善作用及機制。

[參考文獻][1] ZHENG?Y，?LEY?S?H，?HU?F?B.?Global?aetiology?and?epidemiology?of?type?2?diabetes?mellitus?and?its?complications[J].?Nat?rev?Endocrinol，?2018，?14（2）：?88–98.

[12] 梅子寒，?楊杰，?王煒，?等.?基于PI3K/Akt通路探討脈絡寧注射液對早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用[J].?中醫(yī)眼耳鼻喉雜志，?2020，?10（1）：?6–10.