陳麗雅 王鳳翔 鄒瓊瑜 廖鴻力

[摘要]?目的?探討衣康酸酐抗原修復(fù)液改善前處理不佳組織免疫組織化學(xué)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)免疫組化）染色結(jié)果的效果。方法?收集2022年3～5月溫州市中心醫(yī)院術(shù)后病理標(biāo)本68例，其中乳腺癌19例，腸癌32例，扁桃體17例。模擬前處理不佳的組織處理流程制作組織蠟塊，每個(gè)病例每種標(biāo)記抗體切片2張，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（使用乙二胺四乙酸抗原修復(fù)液）和實(shí)驗(yàn)組（使用衣康酸酐抗原修復(fù)液），對(duì)比兩組的免疫組化染色結(jié)果。結(jié)果?通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇4mmol/L的衣康酸酐作為抗原修復(fù)液。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的敏感度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色結(jié)果的特異性?xún)?yōu)良率顯著高于對(duì)照組（92.48%?vs.?76.69%，χ2=25.43，P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色的細(xì)胞形態(tài)顯著優(yōu)于對(duì)照組（χ2=13.60，P<0.01），對(duì)照組普遍出現(xiàn)皺褶、局部掉片、細(xì)胞腫大甚至嚴(yán)重變形、細(xì)胞膜/質(zhì)/核定位不清晰；而實(shí)驗(yàn)組皺褶較少，幾乎無(wú)掉片現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)完整，細(xì)胞膜/質(zhì)/核定位相對(duì)清晰。結(jié)論?當(dāng)組織固定不及時(shí)或脫水流程出現(xiàn)問(wèn)題，建議使用衣康酸酐抗原修復(fù)液以獲得特異性及細(xì)胞形態(tài)較好的免疫組化染色結(jié)果。

[關(guān)鍵詞]?衣康酸酐；免疫組織化學(xué)；固定；非特異性結(jié)合

[中圖分類(lèi)號(hào)]?R446.8??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.016

Application?of?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution?in?improving?immunohistochemical?staining?results?of?poorly?pretreated?tissues

CHEN?Liya，?WANG?Fengxiang，?ZOU?Qiongyu，?LIAO?Hongli

Department?of?Pathology，?Wenzhou?Central?Hospital，?Wenzhou?325000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution?in?improving?immunohistochemical?staining?results?of?poorly?pretreated?tissues.?Methods?From?March?to?May?2022，?68?postoperative?pathological?specimens?were?collected?in?Wenzhou?Central?Hospital，?including?19?cases?of?breast?cancer，?32?cases?of?bowel?cancer?and?17?cases?of?tonsil.?Tissue?wax?blocks?were?made?by?simulating?the?tissue?processing?process?with?poor?pretreatment，?and?of?each?antibody?were?made?for?each?case.?Two?slices?of?each?labeled?antibody?for?each?case?were?devided?into?control?group?（using?ethylenediaminetetraacetic?acid?antigen?repair?solution）?and?experimental?group?（using?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution），?and?compare?the?immunohistochemical?staining?results?of?the?two?groups.?Results?Four?mmol/L?itaconic?anhydride?was?selected?as?the?subsequent?antigen?repair?solution.?There?was?no?significant?difference?in?sensitivity?between?experimental?group?and?control?group?（P>0.05）.?The?specific?excellent?and?good?rate?of?immunohistochemical?staining?results?in?experimental?group?was?significantly?higher?than?that?in?control?group?（92.48%?vs.?76.69%，?χ2=25.43，?P<0.05）.?The?morphology?of?cells?stained?by?immunohistochemistry?in?experimental?group?was?significantly?better?than?that?in?control?group?（χ2=13.60，?P<0.01）.?In?control?group，?folds，?local?sheet?loss，?cell?enlargement?or?even?severe?deformation，?and?unclear?cell?membrane/plasmic/nuclear?localization?were?common，?while?in?experimental?group，?folds?were?less，?there?was?almost?no?sheet?loss，?cell?morphology?was?relatively?intact，?and?cell?membrane/plasmic/nuclear?localization?was?relatively?clear.?Conclusion?When?the?tissue?is?not?fixed?in?time?or?there?is?a?problem?in?the?dehydration?process，?it?is?recommended?to?use?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution?to?obtain?the?specific?and?better?immunohistochemical?staining?results?of?cell?morphology.

[Key?words]?Itaconic?anhydride;?Immunohistochemistry;?Fixation;?Non-specific?binding

免疫組織化學(xué)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)免疫組化）檢測(cè)技術(shù)發(fā)展至今已有一個(gè)多世紀(jì)，技術(shù)十分成熟，但免疫組化染色問(wèn)題卻一直長(zhǎng)期存在，主要原因是影響免疫組化染色結(jié)果的因素眾多。其中影響較大的包括組織前處理、抗原修復(fù)條件、一抗及檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度和特異性、孵育時(shí)間和溫度等[1]。在組織前處理良好的情況下，采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic?acid，EDTA）抗原修復(fù)，染色結(jié)果良好，強(qiáng)度正常，背景清晰，細(xì)胞形態(tài)正常。當(dāng)組織前處理不佳時(shí)，采用同樣的組織類(lèi)型、同樣的抗原修復(fù)條件和染色條件進(jìn)行操作，染色結(jié)果不佳，非特異性嚴(yán)重，組織切片出現(xiàn)皺褶、局部掉片、細(xì)胞變形、細(xì)胞膜/質(zhì)/核定位或邊界不清晰等現(xiàn)象。因此，本研究采用衣康酸酐配制的抗原修復(fù)液對(duì)前處理不佳的組織進(jìn)行測(cè)試，嘗試解決前處理不佳的組織出現(xiàn)非特異性及細(xì)胞形態(tài)破壞等問(wèn)題。

1??材料和方法

1.1??材料

1.1.1??一般資料??前瞻性收集2022年3～5月溫州市中心醫(yī)院術(shù)后病理標(biāo)本68例，其中乳腺癌19例，腸癌32例，扁桃體17例。每個(gè)病例在不影響病理診斷的前提下，額外多取材一塊組織（大小2.0cm×1.5cm×0.8cm）作為研究對(duì)象。乳腺癌每例分別標(biāo)記抗體HER2、CK、p53；腸癌每例分別標(biāo)記抗體Ki-67、MSH2、MSH6、PMS2、MLH1、P-gp；扁桃體每例分別標(biāo)記抗體Bcl-6。每個(gè)病例每種標(biāo)記抗體切片2張，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（使用EDTA抗原修復(fù)液）和實(shí)驗(yàn)組（使用衣康酸酐抗原修復(fù)液）。本研究經(jīng)溫州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：L2022-01-078）。

1.1.2??主要試劑??EDTA抗原修復(fù)液（pH?9.0）、過(guò)氧化物酶阻斷劑、一抗、羊抗鼠/兔HRP標(biāo)記IgG、DAB（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；衣康酸酐（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2??方法

1.2.1??模擬前處理不佳的組織固定和脫水流程??68例組織延遲24h固定，并降低第一道脫水酒精的濃度至40%，其余流程與正常組織前處理流程一致（梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟）。

1.2.2??免疫組化染色流程??組織切片經(jīng)脫蠟、水化后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均采用水煮鍋于100℃維持20min。抗原修復(fù)后，滴加50μl過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered?saline，PBS）沖洗3min×2；滴加50μl一抗室溫孵育60min，PBS沖洗3min×2；滴加50μl二抗室溫孵育30min，PBS沖洗3min×2；滴加50μl?DAB室溫孵育5min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。兩組除抗原修復(fù)液不同外，其他試劑及染色條件完全一致。

1.2.3??衣康酸酐最佳濃度測(cè)試??采用不同濃度（1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、16mmol/L）的衣康酸酐配置抗原修復(fù)液，氫氧化鈉調(diào)節(jié)抗原修復(fù)液pH至7.4±0.2。然后用正常前處理的病理組織蠟塊，并選擇對(duì)抗原修復(fù)要求較高的抗體作為測(cè)試一抗，EDTA作為對(duì)照，測(cè)試出最佳衣康酸酐抗原修復(fù)液的濃度。

1.2.4??免疫組化染色評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)??免疫組化染色結(jié)果由2名高年資病理醫(yī)生參考行業(yè)規(guī)范指南進(jìn)行雙盲獨(dú)立判讀。判定標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)的抗體敏感度根據(jù)細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度綜合判定，深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），棕色為中度陽(yáng)性（++），淺棕色為陽(yáng)性（+），呈現(xiàn)很淡的棕色為弱陽(yáng)性（±），沒(méi)有顏色為陰性（－）；免疫組化特異性評(píng)分總分10分，>8分為優(yōu)良（輕度背景扣1分，中度背景扣2～3分，重度背景扣4～5分，無(wú)法判讀不得分）；細(xì)胞形態(tài)完整、細(xì)胞膜/質(zhì)/核定位或邊界清晰為細(xì)胞形態(tài)佳，細(xì)胞腫大變形、細(xì)胞膜/質(zhì)/核定位或邊界不清晰為細(xì)胞形態(tài)差[2-3]。

1.3??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??衣康酸酐抗原修復(fù)液最佳濃度的選擇

結(jié)果顯示，1mmol/L和16mmol/L的衣康酸酐比其他濃度的衣康酸酐染色強(qiáng)度整體偏弱，2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L的衣康酸酐整體染色結(jié)果稍弱于對(duì)照組，但三組染色結(jié)果整體無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。部分抗體染色結(jié)果見(jiàn)圖1。其中，部分較敏感的抗體，如Ki-67、PMS2、Bcl-6等，4mmol/L的衣康酸酐染色結(jié)果更佳。綜合考慮，選擇4mmol/L的衣康酸酐作為后續(xù)抗原修復(fù)液。

2.2??衣康酸酐抗原修復(fù)液對(duì)免疫組化敏感度的影響

采用4mmol/L的衣康酸酐抗原修復(fù)液對(duì)組織前處理不佳的組織進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，兩組的敏感度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.3??衣康酸酐抗原修復(fù)液對(duì)免疫組化特異性的影響

實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色結(jié)果的特異性?xún)?yōu)良率顯著高于對(duì)照組（92.48%?vs.?76.69%，χ2=25.43，P<0.05），見(jiàn)表3、圖2。其中，特異性差異最顯著的是HER2和p53，由于該病例組織前處理較差，EDTA修復(fù)已嚴(yán)重影響診斷結(jié)果，無(wú)法判讀。

2.4??衣康酸酐抗原修復(fù)液對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色的細(xì)胞形態(tài)顯著優(yōu)于對(duì)照組（χ2=13.60，P<0.01），見(jiàn)表4。對(duì)照組普遍出現(xiàn)皺褶、局部掉片、細(xì)胞腫大甚至嚴(yán)重變形、細(xì)胞膜/質(zhì)/核定位不清晰；而實(shí)驗(yàn)組皺褶較少，幾乎無(wú)掉片現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)完整，細(xì)胞膜/質(zhì)/核定位相對(duì)清晰，見(jiàn)圖3。

3??討論

自1941年Coons采用熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)肺組織中肺炎雙球菌取得成功以來(lái)，免疫組化技術(shù)得到快速發(fā)展，其主要用于病理診斷、鑒別診斷、判斷疾病的預(yù)后和評(píng)估臨床療效[4]。隨著個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療的興起，尤其在腫瘤治療領(lǐng)域，通過(guò)免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)腫瘤病理標(biāo)本中的特定分子，對(duì)分子靶標(biāo)進(jìn)行定位指導(dǎo)治療更需要其結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[5]。影響免疫組化染色結(jié)果的因素較多，其中影響較大的因素是抗原修復(fù)[6-7]。常用的抗原修復(fù)方式為熱修復(fù)和酶修復(fù)。常用的抗原修復(fù)液有EDTA、檸檬酸、Tris、胰酶、胃酶等[8-9]。本研究選取EDTA熱抗原修復(fù)液作為對(duì)照，EDTA是免疫組化中最常用、效果最佳的抗原修復(fù)液，具有抗原決定簇暴露充分、性?xún)r(jià)比高、染色結(jié)果強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。

此外，試劑滴度、孵育時(shí)間、溫度、特異性和敏感度等也可影響免疫組化染色結(jié)果，其中較易忽視的影響因素是組織前處理。臨床醫(yī)生對(duì)標(biāo)本前處理的重視程度不夠，術(shù)后未及時(shí)固定；醫(yī)生取材的組織過(guò)大過(guò)厚及大標(biāo)本未按要求剖開(kāi)固定；病理技術(shù)人員對(duì)標(biāo)本處理流程、更換脫水試劑的不規(guī)范等多種因素均會(huì)影響組織前處理效果[13-15]。從免疫組化角度看，固定不僅要凝固細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)以保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而且要盡量減少酶反應(yīng)以防細(xì)胞自溶導(dǎo)致抗原彌散至組織間質(zhì)。組織固定不及時(shí)或脫水不徹底，組織細(xì)胞易出現(xiàn)自溶、破裂、褶皺等現(xiàn)象，免疫組化染色結(jié)果出現(xiàn)部分抗體非特異性及背景著色，嚴(yán)重時(shí)影響診斷結(jié)果[16-17]。

本研究模擬組織前處理不佳的流程，可見(jiàn)組織切片出現(xiàn)明顯的褶皺和細(xì)胞自溶現(xiàn)象，部分抗體指標(biāo)即使采用常規(guī)最優(yōu)化的免疫組化染色流程仍出現(xiàn)明顯非特異性和背景著色；而日常工作中固定及時(shí)的組織采用同樣的染色流程背景干凈，特異性好。另外，對(duì)固定不及時(shí)的病理標(biāo)本采用衣康酸酐抗原修復(fù)液和EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，衣康酸酐可顯著改善組織前處理不佳引起的皺褶、脫片、細(xì)胞形態(tài)破壞及非特異性和背景著色，且染色的敏感度未見(jiàn)明顯下降。衣康酸酐分子中的碳–碳不飽和雙鍵及酐基等活性官能團(tuán)可作為良好的表面活性劑，主要作用是解除蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)且有較好的通用性。前處理不佳的組織經(jīng)衣康酸酐抗原修復(fù)液修復(fù)后，細(xì)胞自溶裂解物被消除或屏蔽，不易與一抗及二抗發(fā)生非特異性吸附，從而起到降低背景和非特異性染色的作用。衣康酸酐抗原修復(fù)液為弱堿性，與PBS的pH值一致，對(duì)細(xì)胞形態(tài)破壞比較少，但具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步深入探討研究。實(shí)驗(yàn)組的敏感度與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其特異性和細(xì)胞形態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照組。

綜上，病理技術(shù)人員在臨床工作中遇到部分組織固定不及時(shí)或脫水流程出現(xiàn)問(wèn)題，建議使用衣康酸酐抗原修復(fù)液以獲得特異性及細(xì)胞形態(tài)較好的免疫組化染色結(jié)果。

[參考文獻(xiàn)][1] 王德田，?丁偉.?實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)[M].?2版.?北京：?中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，?2022.