趙軼峰，李明霞，張超，胡小敏，王雄，趙鐵軍

075000 河北 張家口，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 胃腸腫瘤外科（趙軼峰、胡小敏、王雄），內(nèi)分泌科（李明霞），介入科（張超）；075000 河北 張家口，河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心（趙鐵軍）

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率較高，嚴(yán)重威脅著人類健康和生命［1］。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，人類在胃癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，然而有關(guān)胃癌發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為是癌癥發(fā)生發(fā)展的主要原因之一，分析與胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的有關(guān)機(jī)制，可能為胃癌的生長、發(fā)展機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）含有微小RNA（microRNA，miRNA）反應(yīng)原件，通過調(diào)控miRNA 的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等多種生物學(xué)過程［2-3］。研究表明lncRNA 唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子反義1（Down syndrome cell adhesion molecule antisense 1，DSCAM-AS1）可促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展［4］。生物信息學(xué)分析預(yù)測顯示，lncRNA DSCAM-AS1 與微小RNA-433-3p（microRNA-433-3p，miR-433-3p）具有靶向關(guān)系，miR-433-3p 可能是lncRNA DSCAM-AS1的靶miRNA。miRNA 是一類進(jìn)化上保守的非編碼小分子RNA，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和分化等多種生理病理過程［5］。針對miR-433-3p的研究發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p 與胃癌、結(jié)腸癌等消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［6-7］。然而，lncRNA DSCAM-AS1 是否能通過調(diào)控miR-433-3p 參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展尚不清楚。因此，本研究旨在探討lncRNA DSCAM-AS1 能否通過調(diào)控miR-433-3p 影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，為進(jìn)一步明確胃癌的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣本采集 收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科2019 年至2021 年手術(shù)切除后的56 例胃癌患者［22 名女性和34 名男性，年齡（53.4±7.2）歲］的胃癌組織和成對的鄰近正常組織?；颊咴谑中g(shù)前未接受任何放療、化療或其他治療。組織在液氮中速凍并儲存在-80℃下用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：20190112004）。所有患者均簽署書面知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞系BGC-823（批號：bio-105908）、MGC-803、AGS、SGC-7901 和人正常胃上皮細(xì)胞系GES-1 購自上海弘順生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 LncRNA DSCAM-AS1 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA陰性對照、miR-433-3p、miR-433-3p 陰性對照、miR-433-3p siRNA 均由北京密碼子生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號：31825）、胎牛血清（批號：39127）、胰蛋白酶（批號：60138）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）試劑盒（批號：216213）均購自美國Gibco 公司；RNA 提取試劑盒（批號：9108Q）購自廣州吉賽生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：SR205311）、CCK-8 試劑盒（批號：C13079）、結(jié)晶紫染液（批號：CP16174）、山羊抗兔二抗（批號：CN-10634）均購自德國QIAGEN 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（批號：DL1107K）、蛋白提取試劑盒（批號：DL1923K）均購自北京索萊寶科技有限公司；羊抗兔增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（批號：S13110）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2（批號：S40994）、MMP-9（批號：S13667）多克隆抗體均購自美國CST 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 常規(guī)復(fù)蘇胃癌細(xì)胞系BGC-823、MGC-803、AGS、SGC-7901 和人正常胃上皮細(xì)胞系GES-1，加至含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 構(gòu)建重組質(zhì)粒lncRNA DSCAMAS1 siRNA（沉默lncRNA DSCAM-AS1）、lncRNA DSCAMAS1 siRNA 陰性對照、miR-433-3p（miR-433-3p 過表達(dá)）、miR-433-3p 陰性對照、miR-433-3p siRNA（沉默miR-433-3p）。驗(yàn)證成功后，將lncRNA DSCAMAS1 siRNA、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 陰 性 對照、miR-433-3p、miR-433-3p 陰性對照和miR-433-3p siRNA 片段酶切，轉(zhuǎn)入慢病毒載體pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP，并用293T 細(xì)胞進(jìn)行包裝，然后收集、濃縮病毒，進(jìn)一步定量。慢病毒轉(zhuǎn)染前24 h，收集1.2.1 中BGC-823 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×105個(gè)/孔接種至6 孔板中，次日加入嘌呤霉素，2 h 后，分別加入制備好的病毒。實(shí)驗(yàn)一：探究沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響：將BGC-823 細(xì)胞分為對照組（僅添加新鮮培養(yǎng)基）、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 陰性對照組（轉(zhuǎn)染lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 陰性對照）、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 組（轉(zhuǎn)染lncRNA DSCAM-AS1 siRNA）。實(shí)驗(yàn)二：探究過表達(dá)miR-433-3p 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響：將BGC-823 細(xì)胞分為對照組（僅添加新鮮培養(yǎng)基）、miR-433-3p 陰性對照組（轉(zhuǎn)染miR-433-3p陰性對照）、miR-433-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-433-3p）。實(shí)驗(yàn)三：驗(yàn)證沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響機(jī)制：將BGC-823 細(xì)胞分為lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 組（轉(zhuǎn)染lncRNA DSCAMAS1 siRNA）、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA + miR-433-3p 陰性對照組（轉(zhuǎn)染lncRNA DSCAM-AS1 siRNA和miR-433-3p 陰性對照）、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA + miR-433-3p siRNA 組（轉(zhuǎn)染lncRNA DSCAMAS1 siRNA 和miR-433-3p siRNA）。每組均設(shè)8 個(gè)平行樣。培養(yǎng)48 h 后，更換培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光為轉(zhuǎn)染成功。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測組織/BGC-823 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1、miR-433-3p 表達(dá) RNA 提取試劑盒提取胃癌組織和鄰近正常組織以及BGC-823 細(xì)胞中RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性，1 min；然后45 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性，10 s；60 ℃退火，20 s；70℃延伸，10 s）。lncRNA DSCAM-AS1 以GAPDH 為內(nèi)參基因，miR-433-3p 以U6 為內(nèi)參基因，引物由北京密碼子生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，采用2-ΔΔCt法計(jì)算BGC-823 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1、miR-433-3p的相對表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列Table 1．Primer Sequences

1.2.4 CCK-8 法檢測BGC-823 細(xì)胞活性 收集1.2.2中各組BGC-823 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×104個(gè)/孔接種至96 孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37℃避光培養(yǎng)2 h，棄上清，酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測每孔吸光度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力（%） = （實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%。

1.2.5 Transwell 法檢測BGC-823 細(xì)胞侵襲和遷移 侵襲實(shí)驗(yàn)：收集1.2.2 中各組BGC-823 細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，吸取100 μL加至鋪有Matrigel 基質(zhì)膠的Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，倒掉上室培養(yǎng)液，棉簽擦去未遷移細(xì)胞和多余的Matrigel 基質(zhì)膠，無水甲醇固定，結(jié)晶紫染色，光鏡下計(jì)數(shù)濾膜底面每視野的平均細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell 小室上室不鋪Matrigel 基質(zhì)膠，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA DSCAMAS1與miR-433-3p的靶向關(guān)系 Starbase數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）顯示lncRNA DSCAMAS1 的3′UTR 含有與miR-433-3p 的結(jié)合位點(diǎn)（chr21:41756690-41756711），對含結(jié)合位點(diǎn)lncRNA DSCAMAS1 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并連至pGL4 質(zhì)粒，構(gòu)建lncRNA DSCAM-AS1 野生型（lncRNA DSCAM-AS1-Wt）質(zhì)粒；以此質(zhì)粒對模板進(jìn)行定點(diǎn)缺失突變，測序確定突變成功，構(gòu)建lncRNA DSCAM-AS1 突變型（lncRNA DSCAM-AS1-Mut）質(zhì)粒。

測序驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒lncRNA DSCAM-AS1-Wt和lncRNA DSCAM-AS1-Mut 重組質(zhì)粒，分別與miR-433-3p 陰性對照、miR-433-3p 共轉(zhuǎn)染至胃癌BGC-823細(xì)胞中，分為：lncRNA DSCAM-AS1-Wt + miR-433-3p陰性對照組、lncRNA DSCAM-AS1-Wt + miR-433-3p組、lncRNA DSCAM-AS1-Mut + miR-433-3p 陰性對照組、lncRNA DSCAM-AS1-Mut + miR-433-3p 組。各組設(shè)置8 個(gè)重復(fù)。利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.7 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation， RIP）測定 使用含有RNase抑制劑的RIPA 緩沖液裂解BGC-823 細(xì)胞，將裂解物以12 000 g 離心30 min 收集上清液。將上清液與Ago2或IgG抗體包被的磁珠一起孵育過夜。然后，加入蛋白酶K 以消化蛋白質(zhì)，并使用TRIzol 試劑分離免疫沉淀的RNA，通過qRT-PCR 檢測免疫沉淀中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 水平。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測BGC-823 細(xì)胞中增殖、侵襲和遷移蛋白（PCNA、MMP-2、MMP-9）的表達(dá)收集1.2.2 中各組BGC-823 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，每孔100 μL 加至24 孔板中，棄上清，PBS 洗滌，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白并檢測蛋白濃度，之后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移封閉；分別加入一抗稀釋液PCNA、MMP2、MMP9、β-actin，均為1 : 1 000 稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入山羊抗兔二抗稀釋液（1 : 2 000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗膜。蛋白凝膠成像儀成像，Image J軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，通過Pearson 相關(guān)性分析胃癌組織中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 之間的相關(guān)性，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 在 胃癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性

與鄰近正常組織相比，胃癌組織中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)水平顯著升高，而miR-433-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.01；表2）。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA DSCAMAS1 的表達(dá)水平與miR-433-3p 的水平呈負(fù)相關(guān)（r= -0.766，P＜ 0.01；圖1）。此外，與人正常胃上皮細(xì)胞系GES-1 相比，胃癌細(xì)胞系（BGC-823、MGC-803、AGS、SGC-7901）中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)水平顯著升高，miR-433-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），其中BGC-823 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1表達(dá)水平顯著高于其他胃癌細(xì)胞，miR-433-3p 水平顯著低于其他胃癌細(xì)胞，故選擇BGC-823 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（表3）。

圖1 胃癌組織中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 表達(dá)水平的相關(guān)性Figure 1．Correlation between the Expression Levels of LncRNA DSCAM-AS1 and miR-433-3p in Gastric Cancer Tissue

表2 LncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 在胃癌組織中的表達(dá)（N = 56，±s）Table 2．Expressions of LncRNA DSCAM-AS1 and miR-433-3p in Gastric Cancer Tissue（N = 56，±s）

表2 LncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 在胃癌組織中的表達(dá)（N = 56，±s）Table 2．Expressions of LncRNA DSCAM-AS1 and miR-433-3p in Gastric Cancer Tissue（N = 56，±s）

aP ＜ 0.05，compared to adjacent normal tissue.

?

表3 LncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)（N = 8，±s）Table 3．Expressions of LncRNA DSCAM-AS1 and miR-433-3p in Gastric Cancer Cells（N = 8，±s）

表3 LncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)（N = 8，±s）Table 3．Expressions of LncRNA DSCAM-AS1 and miR-433-3p in Gastric Cancer Cells（N = 8，±s）

aP ＜ 0.05，compared to GES-1 cells； bP ＜ 0.05，compared to BGC-823 cells.

?

2.2 沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

對照組和lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 陰性對照組相比，lncRNA DSCAM-AS1、miR-433-3p、細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；與對照組和lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 陰性對照組比較，lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 組lncRNA DSCAM-AS1、細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05），miR-433-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05；表4、圖2、3）。

圖2 對照組、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 陰性對照組、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 組BGC-823 細(xì)胞侵襲和遷移圖（結(jié)晶紫染色，×200）Figure 2．Invasion and Migration of BGC-823 Cells in the Control Group, lncRNA DSCAM-AS1 siRNA Negative Control Group, and LncRNA DSCAM-AS1 siRNA Group (Crystal Violet Staining, ×200）

圖3 對照組、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 陰性對照組、lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 組BGC-823 細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白印跡圖Figure 3. Protein Blotting of PCNA, MMP-2 and MMP-9 in BGC-823 Cells in the Control Group, LncRNA DSCAM-AS1 siRNA Negative Control Group, and LncRNA DSCAM-AS1 siRNA Group

表4 沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響（N = 8，±s）Table 4．Effects of Silencing LncRNA DSCAM-AS1 on the Proliferation， Invasion， and Migration of BGC-823 Cells， and on the Expressions of PCNA， MMP-2 and MMP-9（N = 8，±s）

表4 沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響（N = 8，±s）Table 4．Effects of Silencing LncRNA DSCAM-AS1 on the Proliferation， Invasion， and Migration of BGC-823 Cells， and on the Expressions of PCNA， MMP-2 and MMP-9（N = 8，±s）

aP ＜ 0.05，compared to the control group； bP ＜ 0.05，compared to the lncRNA DSCAM-AS1 siRNA negative control group.PCNA: Proliferating cell nuclear antigen ； MMp-2：Matrix metalloproteinase-2；MMP-9 : Matrix metalloproteinase-9.

?

2.3 過表達(dá)miR-433-3p 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

對照組和miR-433-3p 陰性對照組相比，lncRNA DSCAM-AS1、miR-433-3p、細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；與對照組和miR-433-3p陰性對照組比較，miR-433-3p 組lncRNA DSCAMAS1 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），miR-433-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05），細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05；表5、圖4、5）。

圖4 對照組、miR-433-3p 陰性對照組、miR-433-3p 組BGC-823 細(xì)胞侵襲和遷移圖（結(jié)晶紫染色，×200）Figure 4．Invasion and Migration of BGC-823 Cells in the Control group, miR-433-3p Negative Control Group, and miR-433-3p Group (Crystal Violet Staining, ×200）

圖5 對照組、miR-433-3p 陰性對照組、miR-433-3p 組BGC-823 細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白印跡圖Figure 5．Protein Blotting of PCNA, MMP-2 and MMP-9 in BGC-823 Cells in the Control Group, miR-433-3p Negative Control Group, and miR-433-3p Group

表5 過表達(dá)miR-433-3p 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響（N = 8，±s）Table 5．Effects of Overexpression of miR-433-3p on the Proliferation， Invasion and Migration of BGC-823 Cells， and on the Expressions of PCNA， MMP-2 and MMP-9（N = 8，±s）

表5 過表達(dá)miR-433-3p 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響（N = 8，±s）Table 5．Effects of Overexpression of miR-433-3p on the Proliferation， Invasion and Migration of BGC-823 Cells， and on the Expressions of PCNA， MMP-2 and MMP-9（N = 8，±s）

aP ＜ 0.05，compared to the control group； bP ＜ 0.05， compared to the miR-433-3p negative control group.Abbreviations as indicated in Table 4.

?

2.4 LncRNA DSCAM-AS1 靶向調(diào)控miR-433-3p基因的關(guān)系驗(yàn)證

Starbase 數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測結(jié)果表明，lncRNA DSCAM-AS1 基因3'UTR 區(qū)有miR-433-3p 的結(jié)合位點(diǎn)，位于lncRNA DSCAM-AS1（chr21:41756690-41756711）區(qū)域（圖6）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與lncRNA DSCAMAS1-Wt + miR-433-3p 陰性對照組比較，lncRNA DSCAM-AS1-Wt + miR-433-3p 組熒光素酶相對活性顯著降低（P＜ 0.05）；lncRNA DSCAM-AS1-Wt + miR-433-3p 陰性對照組、lncRNA DSCAM-AS1-Mut + miR-433-3p 陰性對照組、lncRNA DSCAM-AS1-Mut + miR-433-3p 組熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05；表6）。RIP 檢測結(jié)果顯示，相對于lgG，lncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 在Ago2 免疫沉淀中顯著富集（P＜ 0.05；圖7）。

圖6 LncRNA DSCAM-AS1 靶向調(diào)控miR-433-3pFigure 6．Targeted Regulation of miR-433-3p by LncRNA DSCAM-AS1

圖7 circPTK2 和miR-761 可被Ago2 抗體沉淀（RIP 實(shí)驗(yàn)）Figure 7. circPTK2 and miR-761 Can be Precipitated by Ago2 Antibody (RIP）

表6 各組熒光素酶相對活性比較（N = 8，±s）Table 6．Relative Activity of Luciferase in Each Group（N = 8，±s）

表6 各組熒光素酶相對活性比較（N = 8，±s）Table 6．Relative Activity of Luciferase in Each Group（N = 8，±s）

aP ＜ 0.05，compared to the lncRNA DSCAM-AS1-Wt + miR-433-3p negative control group.

?

2.5 抑制miR-433-3p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的抑制作用

LncRNA DSCAM-AS1 siRNA 組和lncRNA DSCAMAS1 siRNA + miR-433-3p 陰性對照組lncRNA DSCAMAS1、miR-433-3p、細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；與lncRNA DSCAM-AS1 siRNA 組和lncRNA DSCAM-AS1 siRNA+miR-433-3p 陰性對照組比 較，lncRNA DSCAM-AS1 siRNA+miR-433-3p siRNA 組lncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），miR-433-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05），細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05；表7、圖8、9）。

圖8 各組組BGC-823 細(xì)胞侵襲和遷移圖Figure 8．Invasion and Migration of BGC-823 Cells in Each Group

圖9 各組PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白印跡圖Figure 9．Protein Blotting of of PCNA, MMP-2 and MMP-9 in Each Group

表7 抑制miR-433-3p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的抑制作用（N = 8，±s）Table 7．Inhibition of miR-433-3p Expression Can Reverse the Inhibitory Effect of Silencing LncRNA DSCAM-AS1 on the Proliferation， Invasion and Migration of BGC-823 Cells， and on the Expressions of PCNA， MMP-2 and MMP-9（N = 8，±s）

表7 抑制miR-433-3p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的抑制作用（N = 8，±s）Table 7．Inhibition of miR-433-3p Expression Can Reverse the Inhibitory Effect of Silencing LncRNA DSCAM-AS1 on the Proliferation， Invasion and Migration of BGC-823 Cells， and on the Expressions of PCNA， MMP-2 and MMP-9（N = 8，±s）

aP ＜ 0.05，compared to the lncRNA DSCAM-AS1 siRNA group； bP ＜ 0.05，compared to the lncRNA DSCAM-AS1 siRNA + miR-433-3p negative control group.Abbreviations as indicated in Table 4.

?

3 討 論

LncRNA DSCAM-AS1 位于21q22.2，屬于細(xì)胞黏附分子的免疫球蛋白超家族，以往研究表明lncRNA DSCAM-AS1 在多種人類癌癥中起重要作用［8-9］。Lu等［10］研究表明，結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系HCT8、HT-29、SW480 及Lovo 中l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1 的表達(dá)分別顯著高于癌旁組織和正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460，且lncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，lncRNA DSCAM-AS1 高表達(dá)患者總體生存率相對較差。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DSCAMAS1 在胃癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默lncRNA DSCAM-AS1 的表達(dá)能夠抑制胃癌BGC-823 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，提示lncRNA DSCAM-AS1 可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

miRNA 是一類非編碼小分子RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的功能，是參與細(xì)胞生長、分化、發(fā)育和凋亡各種細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)因子［11-12］。以往研究表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)miRNA 的異常表達(dá)，使下游靶蛋白調(diào)控障礙，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并與腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤的惡性程度和臨床分期、分級，組織浸潤等病理特征有關(guān)［13-15］。miR-433-3p 是一種具有顯著抗腫瘤作用的miRNA，Jin 等［16］研究表明miR-433-3p 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-433-3p 會抑制非小細(xì)胞肺癌的腫瘤生長。馬文飚等［17］研究顯示，甲狀腺癌組織中miR-433-3p 呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-433-3p 可使甲狀腺癌SW579 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為受到抑制。Sun 等［18］研究表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞U251、U87 中miR-433-3p 表達(dá)顯著降低，且miR-433-3p 能夠抑制U251、U87 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p 在胃癌組織中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-433-3p 顯著抑制胃癌BGC-823 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，提示miR-433-3p可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲是導(dǎo)致癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要原因，PCNA 與細(xì)胞DNA 合成密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖的啟動上有重要作用，可作為評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)［19］。MMP 屬于鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，參與細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白質(zhì)的降解和血管生成，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p 過表達(dá)后，BGC-823細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步提示miR-433-3p 可能通過抑制BGC-823 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，進(jìn)而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

lncRNA 能夠通過調(diào)節(jié)miRNA 的表達(dá)從而參與人類癌癥的進(jìn)展，Yu 等［9］研究表明lncRNA DSCAM-AS1 通過靶向調(diào)控miR-101 的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞SAOS2、U2OS的增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p 的表達(dá)與胃癌組織中l(wèi)ncRNA DSCAMAS1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制lncRNA DSCAM-AS1 的表達(dá)能夠促進(jìn)miR-433-3p 的表達(dá)，進(jìn)一步雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和RIP 結(jié)果表明lncRNA DSCAM-AS1 與miR-433-3p 具有靶向關(guān)系，提示lncRNA DSCAMAS1 能夠靶向負(fù)調(diào)控miR-433-3p 的表達(dá)。對BGC-823 細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA DSCAM-AS1 siRNA 和miR-433-3p siRNA 共轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞活力、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目以及PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平均高于lncRNA DSCAM-AS1 siRNA組，提示抑制miR-433-3p 的表達(dá)可能逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA DSCAM-AS1 對BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，進(jìn)一步說明lncRNA DSCAM-AS1可能通過靶向調(diào)控miR-433-3p 的表達(dá)，影響B(tài)GC-823 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，從而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，沉默lncRNA DSCAM-AS1 可通過靶向促進(jìn)miR-433-3p 的表達(dá)抑制胃癌BGC-823 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，可能是胃癌生長、發(fā)展機(jī)制研究的新方向。然而，本研究僅從體外細(xì)胞水平上分析了lncRNA DSCAM-AS1 和miR-433-3p 對胃癌BGC-823 細(xì)胞的生物學(xué)過程的影響，下一步需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，未對miR-433-3p 的下游靶基因進(jìn)行分析也是本研究存在的不足，在未來的研究中將對lncRNA DSCAM-AS1/miR-433-3p 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入探索。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)（CNKI）科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測。

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書等協(xié)議。