程曉蔚,朱慶磊

(1解放軍醫(yī)學(xué)院,北京 100853;2中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心心血管病醫(yī)學(xué)部心血管病研究所,北京 100853)

心肌細(xì)胞肥大是指心臟在受到刺激時(shí)發(fā)生的適應(yīng)性改變,包括生理性和病理性兩種類型。細(xì)胞肥大是一種對(duì)外界刺激的適應(yīng)性反應(yīng),但病理性肥大一般會(huì)進(jìn)展為心力衰竭,是心臟疾病向心力衰竭進(jìn)展的必然過程[1]。心肌細(xì)胞肥大伴隨著質(zhì)的變化,即基因表達(dá)的改變,引起代謝、收縮力和心肌細(xì)胞存活的改變。不同類型的心肌細(xì)胞肥大受到不同的細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。研究表明,細(xì)胞代謝、增殖,非編碼RNA,免疫反應(yīng),翻譯調(diào)節(jié)和表觀遺傳修飾等,對(duì)心肌細(xì)胞肥大有積極或消極的調(diào)節(jié)作用[2]。然而,目前關(guān)于心肌細(xì)胞肥大的發(fā)病機(jī)制還未完全闡明,在臨床上缺乏有效的治療手段,因此,探索病理性心肌細(xì)胞肥大發(fā)生的潛在機(jī)制,尋找新的藥物作用靶點(diǎn),改善病理性心肌細(xì)胞肥大具有重要意義。本研究通過異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[3-5],研究其線粒體自噬水平和線粒體三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)敏感鉀通道Kir6.1的變化規(guī)律,為病理性心肌細(xì)胞肥大提供新的防治思路。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)購于Sigma;進(jìn)口胎牛血清購于Bovogen Biologicals;細(xì)胞高糖培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶購于Gibco;大鼠氨基末端腦鈉肽前體(N-terminal pro brain natriuretic peptide, NT-proBNP)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒,購于生工生物工程(上海)股份有限公司;RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄試劑盒iScript cDNA Synthesis Kit、iTaq Universal SYBR Green Supermix購于美國Bio-Rad;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、BCA蛋白定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)抗體購于Abcam;FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1, FUNDC1)抗體購于Cell Signaling Technology;內(nèi)向整流鉀通道6.1(inward rectifyimg potassium channel 6.1, Kir6.1)抗體購于武漢三鷹生物科技有限公司;超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國Thermo公司;酶標(biāo)儀Spark10M,瑞士Tecan公司;Nano Drop 2000,美國Thermo公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀,美國ABI;CFX96TM Real-time PCR儀及蛋白電泳系統(tǒng),美國Bio-Rad;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)5200,上海Tanon。

1.2 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)

選取出生后24h的新生大鼠12只,酒精浸泡消毒后,開胸取出心臟組織,置于預(yù)冷的D-hanks液中清洗3次,注意把心臟中殘留血液全部清除。用剪刀將心臟組織剪碎,加入5ml 0.08%的胰蛋白酶,置于恒溫水浴鍋中,37℃消化5 min后,棄掉上清液。在剩余組織中加入6～7ml 0.08%的Ⅱ型膠原酶,37℃水浴消化5min,小心吸取上清液,加入含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中中和消化酶,重復(fù)消化5～6次,直至組織塊消失。將組織消化液經(jīng)過細(xì)胞篩過濾,濾除未消化的組織塊,收集細(xì)胞懸液分裝于離心管中,800轉(zhuǎn)/min,離心5min,棄上清液,用含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。將未貼壁的細(xì)胞懸液取出,再次800轉(zhuǎn)/min離心10min,棄上清液,使用新配置的10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml,接種在6孔板中,每孔2ml,置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)基。按照實(shí)驗(yàn)需要在培養(yǎng)48h后施加處理因素。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后將細(xì)胞隨機(jī)分為2組。對(duì)照組細(xì)胞加含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),模型組細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中加入ISO 140μmol/L處理48h。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液NT-proBNP濃度

造模結(jié)束后,將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管,在4℃條件下離心(離心力1000g)20min,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片,取上清液。按照大鼠NT-proBNP酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書,檢測心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液NT-proBNP濃度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測心肌細(xì)胞目的基因mRNA表達(dá)

心肌細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后,加入1ml Trizol,置于冰上裂解20min,用細(xì)胞刮板收集細(xì)胞,提取總RNA。取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,最后實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測肥大基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦利鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)以及內(nèi)向整流鉀通道6.1(inward rectifyimg potassium channel 6.1, Kir6.1)和自噬相關(guān)基因8(autophagyrelatedgene8,Atg8)的mRNA水平。18S rRNA作為內(nèi)參基因(Forward: TTGATTAAGTCCCTGCCCTTTGT; Reverse:CGATCCGAGGGCCTAACTA),定量數(shù)據(jù)采用對(duì)比Ct法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)中涉及的引物序列,詳見表1。

表1 qRT-PCR所用引物

1.6 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

心肌細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后,加入RIPA裂解液置于冰上裂解30min,用細(xì)胞刮板收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測量蛋白濃度,取20μg總蛋白行12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,經(jīng)過轉(zhuǎn)膜封閉后放入一抗稀釋液中4℃ 孵育過夜,一抗稀釋比分別為Kir6.1(1∶1000),FUNDC1(1∶1000),LC3(1∶500),GAPDH(1∶2000)。洗膜后,室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶8000) 1h,采用超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光分析。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ISO處理對(duì)心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液NT-proBNP的影響

酶聯(lián)免疫吸附法檢測顯示,與對(duì)照組相比,模型組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液NT-proBNP濃度明顯升高[(1699.43±407.01)和(808.68±91.46)pg/ml,P<0.05]。

2.2 ISO處理對(duì)心肌細(xì)胞ANP mRNA、BNP mRNA和β-MHC mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測顯示,與對(duì)照組相比,模型組肥大相關(guān)基因ANP、BNP和β-MHC基因表達(dá)量明顯增加(P<0.05;圖1)。

圖1 ISO處理對(duì)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞ANP mRNA、BNP mRNA和β-MHC mRNA表達(dá)的影響Figure 1 Effects of ISO treatment on expression of ANP mRNA, BNP mRNA and β-MHC mRNA in neonatal rat cardiomyocytesANP: atrial natriuretic peptide; BNP: brain natriuretic peptide; β-MHC: β-myosin heavy chain; ISO: isoprenaline. Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.

2.3 ISO處理對(duì)心肌細(xì)胞鉀通道Kir6.1 mRNA和自噬相關(guān)基因Atg8 mRNA表達(dá)的影響

圖2 ISO處理對(duì)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞Kir6.1和Atg8基因mRNA表達(dá)的影響Figure 2 Effects of ISO treatment on expression of Kir6.1 mRNA and Atg8 mRNA in neonatal rat cardiomyocytesKir6.1: inward rectifyimg potassium channel 6.1; Atg8: autophagy related gene 8.ISO: isoprenaline. Compared withcontrol group, *P<0.05, **P<0.01.

圖3 ISO處理對(duì)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞Kir6.1、LC3和FUNDC1蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of ISO treatment on expression of Kir6.1, LC3 and FUNDC1 protein in neonatal rat cardiomyocytesKir6.1: inward rectifyimg potassium channel 6.1; LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3; FUNDC1: FUN14 domain-containing protein 1; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; ISO: isoprenaline. Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測顯示,與對(duì)照組相比,模型組鉀通道Kir6.1和自噬相關(guān)基因Atg8的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05;圖2)。

2.4 ISO處理對(duì)心肌細(xì)胞Kir6.1基因的蛋白表達(dá)和線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3和FUNDC1表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡法檢測顯示,與對(duì)照組相比,模型組線粒體ATP敏感鉀通道蛋白Kir6.1和線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3,FUNDC1表達(dá)明顯降低(P<0.05;圖3)。

3 討 論

心肌細(xì)胞肥大是心肌細(xì)胞長期、過度負(fù)荷引起的一種適應(yīng)性病理變化,如果病因長久不能被消除,就會(huì)發(fā)展為心力衰竭[1]。ISO作為β受體激動(dòng)劑,能夠使心臟收縮力增強(qiáng),過量或長期使用可導(dǎo)致心肌耗氧量增加、負(fù)荷加重,從而引起心肌細(xì)胞肥大[3-5]。心肌肥大主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、表面積增加、總蛋白合成增加、肥大相關(guān)胚胎基因(在胚胎期表達(dá)而在出生后低表達(dá)或不表達(dá))重新被激活表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組的心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液NT-proBNP濃度明顯升高,心肌肥大相關(guān)胚胎基因ANP mRNA ,BNP mRNA 和β-MHC mRNA表達(dá)上調(diào),表明ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型構(gòu)建成功。

眾所周知,線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的部位,是維持機(jī)體生命活動(dòng)的關(guān)鍵細(xì)胞器。因此,線粒體功能出現(xiàn)異常,將會(huì)影響到基礎(chǔ)生命活動(dòng),出現(xiàn)多種病理生理學(xué)表現(xiàn)。在心肌細(xì)胞肥大的過程中,線粒體受到多種因素的影響導(dǎo)致代謝功能障礙[6,7]。線粒體ATP敏感鉀通道是位于線粒體內(nèi)膜上的內(nèi)向整流鉀通道,主要是由Kir6.1通道亞基和磺酰脲受體調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成,在維持線粒體膜電位、減輕鈣離子超載、改善缺血再灌注損傷、抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[8,9]。在本研究中,心肌細(xì)胞肥大時(shí)線粒體ATP敏感鉀通道Kir6.1表達(dá)降低,影響線粒體功能代謝。開放線粒體ATP敏感鉀通道可能通過提高線粒體膜電位、改善細(xì)胞能量代謝、減少心衰標(biāo)志物表達(dá),從而起到抑制心肌肥厚的作用[10,11]。

線粒體功能障礙與心血管疾病有關(guān),消除功能失調(diào)的線粒體對(duì)維持細(xì)胞功能至關(guān)重要[12]。線粒體自噬對(duì)于清除有缺陷的線粒體是必不可少的,但如果不嚴(yán)格控制,可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。調(diào)控細(xì)胞線粒體自噬程度將成為控制疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素。心臟應(yīng)激適度誘導(dǎo)線粒體自噬有助于清除受損和功能失調(diào)的線粒體,可以防止細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)而最終導(dǎo)致的心力衰竭氧化損傷。線粒體自噬的調(diào)節(jié)在各種心血管疾病中具有有害和(或)有益的結(jié)果[13,14]。FUNDC1是一種新型的線粒體自噬受體蛋白,位于線粒體外膜上,包含3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,其中暴露于細(xì)胞質(zhì)的N端含有一段典型的LC3相互作用區(qū)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中FUNDC1通過與LC3相互作用介導(dǎo)損傷線粒體的選擇性清除,從而保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大時(shí)LC3和FUNDC1表達(dá)降低,線粒體自噬水平下降。適度誘導(dǎo)線粒體自噬清除受損和功能失調(diào)的線粒體,可以阻止心肌細(xì)胞肥大,改善心臟功能。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大時(shí)線粒體ATP敏感鉀通道Kir6.1和線粒體自噬水平均明顯降低,線粒體ATP敏感鉀通道Kir6.1和線粒體自噬在心肌細(xì)胞肥大時(shí)發(fā)揮重要作用。同時(shí)提示二者之間可能存在聯(lián)系,然而其中的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討研究。