孫莉莉，彭麗娜，牟蘊(yùn)慧，葉萬軍

（1.哈爾濱體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150008；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086）

【研究意義】李（Prunus salicinaL.）為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，李在我國分布廣泛，幾乎所有省份都有栽培［1］，位于我國東北地區(qū)的黑龍江省依托寒地優(yōu)勢，抗寒種質(zhì)資源豐富，為抗寒新品種的選育提供了較好的種質(zhì)來源。由于李富含糖、酸、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的抗氧化活性，其中提取出的活性肽能有效抵抗自由基［2］，同時(shí)李可鮮食，也可進(jìn)行深加工［3］，深加工后的產(chǎn)品價(jià)值提升，能有效帶動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative Trait Locus，QTL）定位是研究數(shù)量性狀的一種有效方法，構(gòu)建高密度遺傳圖譜是QTL 定位的基礎(chǔ)，果樹受童期長、純合與雜合位點(diǎn)共存、遺傳背景復(fù)雜等因素的影響，獲得高密度遺傳圖譜較難，容易影響果樹QTL 定位的準(zhǔn)確性［4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，果樹果實(shí)性狀QTL 定位研究也有一定的進(jìn)展。果實(shí)品質(zhì)是新品種選育的重要依據(jù)，果實(shí)品質(zhì)包括內(nèi)在品質(zhì)和外觀品質(zhì)，內(nèi)在品質(zhì)體現(xiàn)在果實(shí)可溶性固形物、維生素C、可滴定酸及酚類化合物等含量。針對桃﹝Prunus persica（L.）Batsch﹞果實(shí)品質(zhì)性狀的研究比較深入，Shi等［5］基于SLAF-Seq 構(gòu)建了桃高密度遺傳圖譜，對果實(shí)質(zhì)量、果實(shí)橫徑等12 個(gè)果實(shí)性狀進(jìn)行QTL 定位，獲得90 個(gè)位點(diǎn)，同時(shí)篩選和鑒定了果實(shí)性狀的候選基因；張瑞萍等［6］對梨（PyrusL.）的單果質(zhì)量、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑和縱徑橫徑比等果實(shí)性狀進(jìn)行了研究，結(jié)果共獲得QTL 位點(diǎn)8 個(gè)，定位在不同的連鎖群上，LOD 值在2.50～4.14 之間，可解釋11.4%～36.4%的表型變異。研究發(fā)現(xiàn)，在連鎖群3 上有3 個(gè)柑橘（CitrusL.）果實(shí)橫徑QT L位點(diǎn)，在連鎖群8 上有4 個(gè)果實(shí)縱徑QTL 位點(diǎn)［7］。近年，唐海霞等［8］對棗（Ziziphus jujubaMill.）果實(shí)性狀的QTL 定位進(jìn)行了報(bào)道，共檢測到156 個(gè)棗果實(shí)相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，分布在10 個(gè)連鎖群中。郭棟梁等［9］報(bào)道了龍眼（Dimocarpus longanLour.）種質(zhì)資源果實(shí)性狀的多樣性及相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單果質(zhì)量與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。徐豆等［10］對歐李﹝Cerasus humilis（Bge.）Sok.﹞親本及正反交F1后代果實(shí)性狀的遺傳變異進(jìn)行分析，研究表明雜交后代單果質(zhì)量、可溶性固形物含量、果形指數(shù)等屬于數(shù)量性狀，由多基因控制。孫海龍等［11］對35 份李種質(zhì)的果實(shí)性狀進(jìn)行18個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性分析，為李種質(zhì)資源品質(zhì)性狀的評價(jià)提供理論基礎(chǔ)。然而，國內(nèi)關(guān)于寒地李果實(shí)性狀QTL 定位研究較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于李具有的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，本試驗(yàn)以東北地區(qū)李吉林6 號（P.salicinacv.jilin6）和龍園秋李（P.salicinacv.longyuanqiuli）的F1子代為研究群體，在已構(gòu)建遺傳圖譜基礎(chǔ)上［12］，對單果質(zhì)量、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑、果形指數(shù)、果肉厚度和總糖含量6 個(gè)果實(shí)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析和QTL 的初步定位?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過本研究，對李部分果實(shí)性狀進(jìn)行QTL 初步定位，為寒地李分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為吉林6 號和龍園秋李的72 株F1子代植株，親本在2009 年進(jìn)行雜交授粉，雜交種子于2010 年播種、2012 年定植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院核果試驗(yàn)園，長勢較好，按照常規(guī)田間管理模式進(jìn)行管理，子代沒有進(jìn)行剔選。2017 年秋季部分植株果實(shí)成熟后，采集果實(shí)進(jìn)行果實(shí)相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)和測量，果實(shí)采集時(shí)選擇樹齡、株型、生長勢、載果量一致的正常株，從每株的全部收獲物中選取大中小和向陽和背陰的果實(shí)組成平均樣品。測試地點(diǎn)在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測量方法 通過電子天平（精度為0.01 g，浙江托普儀器有限公司）對單果質(zhì)量（Weight of single fruit，WSF）進(jìn)行稱量；使用游標(biāo)卡尺（精度為0.01 mm）對果實(shí)橫徑（Transverse diameter of fruit，TDF）、果實(shí)縱徑（Vertical diameter of fruit，VDF）、果肉厚度（Thickness of pulp，TP）等指標(biāo)進(jìn)行測量，測量標(biāo)準(zhǔn)參考郁香荷等［13］方法；通過棱鏡折射儀（精度為0.2%，廣州銘睿電子LB32T 糖度計(jì)）對總糖含量（Content of total sugar，CTS）進(jìn)行測定；每個(gè)F1子代選擇3～5 個(gè)果實(shí)對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測量，同時(shí)計(jì)算果形指數(shù)（Fruit shape index，F(xiàn)I），果形指數(shù)=果實(shí)縱徑/果實(shí)橫徑。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)方法 利用SPSS 23.0 軟件對果實(shí)性狀測量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得各項(xiàng)指標(biāo)的平均值、方差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、偏度和峰度，計(jì)算變異系數(shù)（變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值），根據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)輸出結(jié)果分析各項(xiàng)指標(biāo)是否屬于正態(tài)分布。通過SPSS 23.0 繪制果實(shí)性狀各項(xiàng)指標(biāo)的頻率分布直方圖，同時(shí)對各指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.2.3 QTL 定位分析 本研究基于已經(jīng)構(gòu)建的李遺傳連鎖圖譜［12］，通過Map QTL 5.0 軟件將正態(tài)性分布的性狀進(jìn)行QTL 分析，在Map QTL 5.0軟件中，依據(jù)置換檢驗(yàn)（Permutation test）（次數(shù)>1 000）計(jì)算LOD 閾值，根據(jù)區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL 定位，最后利用Map Chart 2.3 軟件對獲得的QTL所在連鎖群進(jìn)行繪圖。采用“果實(shí)性狀+數(shù)字”的方式命名QTL，如“TDF-1”表示“果實(shí)橫徑在連鎖群上的第1 個(gè)QTL”，若該果實(shí)性狀有多個(gè)位點(diǎn)，則數(shù)字順延。

2 結(jié)果與分析

2.1 李F1 群體果實(shí)性狀的表型分析

李F1群體果實(shí)性狀表型分析結(jié)果如表1所示。果實(shí)單果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.537、方差為90.951，數(shù)值均較大，偏度和峰度均大于1，表明單果質(zhì)量的數(shù)據(jù)分布不對稱，果實(shí)個(gè)體之間存在較大差異。果實(shí)性狀的變異系數(shù)在6.09%～35.98%，各果實(shí)性狀變異較大，表明分離比較明顯。本研究測量果實(shí)總數(shù)量大于50 個(gè)，根據(jù)K-S 檢驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，若P>0.05，表明該指標(biāo)呈正態(tài)分布。如表1 中，果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑和果肉厚度的K-S 檢驗(yàn)結(jié)果均為P>0.05，表明其均呈正態(tài)分布，單果質(zhì)量、果形指數(shù)和總糖含量的K-S 檢驗(yàn)值均小于0.05，表明數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布。各果實(shí)性狀分布情況見圖1，該圖同時(shí)顯示了各指標(biāo)的頻率分布直方圖，直方圖中正態(tài)分布曲線也顯示了各指標(biāo)的正態(tài)分布情況。

圖1 李F1 群體果實(shí)性狀的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of fruit traits in F1 population of plum

表1 李F1 群體果實(shí)性狀的表型分析Table 1 Phenotypic analysis of fruit traits in F1 population of plum

2.2 李F1 群體果實(shí)性狀的相關(guān)性分析

利用SPSS 23.0 軟件對李F1群體果實(shí)性狀的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如表2 所示，果實(shí)單果質(zhì)量與果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑和果肉厚度均具有極顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)最大的是單果質(zhì)量與果實(shí)橫徑，r為0.959，表明單果質(zhì)量與果實(shí)橫徑關(guān)系最密切，篩選較大單果質(zhì)量果實(shí)的同時(shí)，果實(shí)橫徑也會(huì)隨之升高；單果質(zhì)量與果形指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與總糖含量具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明單果質(zhì)量越大，果形指數(shù)和總糖含量越小，選擇單果質(zhì)量大、同時(shí)果形指數(shù)大和總糖含量高的品種比較難。果實(shí)橫徑與果實(shí)縱徑、果肉厚度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明果實(shí)橫徑與果實(shí)縱徑、果肉厚度關(guān)系最密切，在連鎖群上的QTL 分布可能也較近；果實(shí)橫徑與果形指數(shù)、總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，r分別為-0.548 和-0.233，這一變化趨勢和單果質(zhì)量與果形指數(shù)、總糖含量的關(guān)系相似，更進(jìn)一步說明單果質(zhì)量與果實(shí)橫徑的關(guān)系最密切。果實(shí)總糖含量與其他指標(biāo)間存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，表明果實(shí)總糖含量在馴化過程中過分注重果實(shí)的大小，從而可能導(dǎo)致與果實(shí)總糖含量相關(guān)基因的丟失。

表2 李F1 群體果實(shí)性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of fruit traits in F1 population of plum

2.3 李F1 群體果實(shí)性狀的QTL 定位

利用吉林6 號和龍園秋李的F1子代構(gòu)建李的遺傳連鎖圖譜［12］，選用Map QTL 5.0 軟件對呈正態(tài)性分布的李果實(shí)性狀進(jìn)行QTL 分析，依據(jù)置換檢驗(yàn)確定各個(gè)性狀的LOD閾值（0.95和0.99水平），最終獲得果實(shí)性狀相關(guān)11個(gè)QTL位點(diǎn)（圖2、表3）。

圖2 李F1 群體果實(shí)性狀QTL 在連鎖圖譜上的分布Fig.2 Distribution of QTL for fruit traits in F1 population of plum on linkage map

表3 李F1 群體果實(shí)性狀的QTL 分析Table 3 QTL analysis of fruit traits in F1 population of plum

果實(shí)橫徑共獲得4 個(gè)QTL 位點(diǎn)，位點(diǎn)TDF-1位于第2 連鎖群7 cM 區(qū)域，LOD 值為2.91，表型變異解釋率為12.6%；位點(diǎn)TDF-2 位于第3連鎖群1 cM 區(qū)域，LOD 值為2.46，表型變異解釋率為9.8%；位點(diǎn)TDF-3 位于第8 連鎖群33 cM 區(qū)域，LOD 值為3.58，表型變異解釋率為14.4%；位點(diǎn)TDF-4 位于第15 連鎖群11 cM 區(qū)域，LOD 值為2.99，表型變異解釋率為13.6%。

果實(shí)縱徑共獲得4 個(gè)QT L位點(diǎn)，分別為VDF-1、VDF-2、VDF-3 和VDF-4，位點(diǎn)位置與果實(shí)橫徑連鎖群一致，分別位于第2、第3、第8 和第15 連鎖群，在連鎖群上的區(qū)域分別為8 cM、0 cM、35.535 cM 和18.272 cM，LOD 值分別為3.19、2.79、2.66 和2.91，能分別解釋12.7%、11.3%、10.4%和12.6%的表型變異。

果肉厚度共獲得3 個(gè)QTL 位點(diǎn)，分別為TP-1、TP-2 和TP-3，分別位于第2、第3 和第15 連鎖群，在連鎖群上的區(qū)域分別為4 cM、3 cM 和18.272 cM，LOD 值分別為2.71、3.46 和3.28，能分別解釋10.8%、14.3%和12.9%的表型變異。

3 討論

果樹具有基因高度雜合、自交不親和及育種周期長等特點(diǎn)，致使果樹遺傳圖譜構(gòu)建比較困難，這也制約了果樹QTL 定位研究的進(jìn)程。關(guān)于果樹果實(shí)性狀的QTL 研究主要集中在桃、櫻桃（Prunus aviumL.）等物種上，關(guān)于李的研究較少。本研究中，李果實(shí)性狀變異系數(shù)在6.09%～35.98%，個(gè)體間變異較大，表明各果實(shí)性狀分離得比較明顯，其中單果質(zhì)量與果肉厚度之間的變異系數(shù)均大于19%。唐海霞等［8］以冬棗×金絲4 號的103 株F1群體為試驗(yàn)材料，采用GBS 簡化基因組測序技術(shù)開發(fā)SNP 分子標(biāo)記，參考冬棗全基因組篩選標(biāo)記，構(gòu)建棗高密度遺傳圖譜，對F1群體進(jìn)行果實(shí)性狀的相關(guān)性分析和QTL 定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單果質(zhì)量的變異系數(shù)為19.49%；徐豆等［10］在歐李果實(shí)性狀遺傳變異研究中發(fā)現(xiàn)，單果質(zhì)量的變異系數(shù)大于20%。以上研究結(jié)果與本研究相似，表明單果質(zhì)量的個(gè)體差異在果實(shí)子代中普遍較大，出現(xiàn)廣泛分離。單果質(zhì)量屬于數(shù)量性狀，通常由多個(gè)基因控制，且易受外界環(huán)境影響，可能是群體中出現(xiàn)廣泛分離的原因［14］。

本研究中，李果實(shí)的單果質(zhì)量和總糖含量指標(biāo)呈非正態(tài)分布，所以沒有對其進(jìn)行QTL 定位分析，僅對果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑和果肉厚度進(jìn)行了分析。根據(jù)已有研究結(jié)果，并未發(fā)現(xiàn)果實(shí)橫徑和果實(shí)縱徑的QTL 定位與連鎖群之間有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。如Quilot等［15］在LG1、LG4、LG5、LG6 和LG7 上定位了不同的桃果核橫徑QTL，而Cantín等［16］在LG4 上定位了不同的桃果實(shí)橫徑QTL。在櫻桃中，Zhang等［17］在LG2 和LG6 中發(fā)現(xiàn)了果實(shí)橫徑QTL 位點(diǎn)；Rosyara等［18］在LG1、LG3 和LG6 中確定了6 個(gè)影響果實(shí)橫徑和縱徑的QTL。Campoy等［19］定位了LG5 中與甜櫻桃果實(shí)橫徑和縱徑控制相關(guān)的主要QTL，并沿著QTL 區(qū)間鑒定了不同的候選基因。本研究共獲得11 個(gè)QTLs 位點(diǎn)，其中果實(shí)橫徑和果實(shí)縱徑主要集中在LG2、LG3、LG8 和LG15 上，這與上述研究結(jié)果既有相似之處、也有不同結(jié)果，具體原因有待進(jìn)一步深入研究。

本研究中，果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑和果肉厚度定位在4 個(gè)連鎖群上，平均每個(gè)連鎖群定位2～3個(gè)位點(diǎn)，且各位點(diǎn)間距離較近，這與趙慧［20］關(guān)于甜櫻桃相關(guān)QTL 位點(diǎn)的結(jié)果相似，其甜櫻桃的單果質(zhì)量、細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞體積定位在同一條染色體上，且距離較近。QTL 在連鎖群上普遍存在成簇聚集的現(xiàn)象，這可能與果實(shí)性狀之間的相關(guān)性呈顯著水平有關(guān)，也可能與同一基因同時(shí)控制不同果實(shí)性狀有關(guān)。

本研究仍存在不足之處，首先，由于果樹具有自交不親和的特點(diǎn)，遺傳圖譜構(gòu)建只能以F1群體為作圖群體，這制約了高質(zhì)量遺傳圖譜的構(gòu)建，直接影響QTL 定位的準(zhǔn)確度。其次，黑龍江省位于我國東北部，春季倒春寒和冬季嚴(yán)寒氣候，導(dǎo)致F1群體數(shù)量過少，可能使QTL 定位出現(xiàn)偏差。第三，由于數(shù)量性狀受多基因的調(diào)控，且基因之間還存在著互作效應(yīng)，遺傳機(jī)制比較復(fù)雜，同時(shí)還受環(huán)境因素、群體大小及遺傳圖譜飽和度的影響，容易造成QTL 定位存在誤差。在將來應(yīng)考慮構(gòu)建多種標(biāo)記整合的圖譜，提高圖譜的飽和性和通用性，進(jìn)而提高QTL 定位的準(zhǔn)確度，為挖掘李優(yōu)質(zhì)果實(shí)品質(zhì)基因奠定基礎(chǔ)，為培育李優(yōu)質(zhì)抗寒新品種提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以東北地區(qū)李吉林6 號和龍園秋李F1群體為試驗(yàn)材料，對果實(shí)的單果質(zhì)量、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑、果形指數(shù)、果肉厚度和總糖含量等6個(gè)果實(shí)性狀進(jìn)行研究。表型分析結(jié)果顯示，單果質(zhì)量的變異系數(shù)為35.98%，表明F1群體間單果質(zhì)量分離得比較明顯；K-S 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑和果肉厚度的表型數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)正態(tài)分布；通過各指標(biāo)的相關(guān)性分析，單果質(zhì)量與果實(shí)橫徑呈極顯著正相關(guān)、相關(guān)系數(shù)為0.959，果實(shí)橫徑與果實(shí)縱徑、果肉厚度之間亦具有極顯著正相關(guān)關(guān)系；QTL 定位共檢測到11 個(gè)QTL 相關(guān)位點(diǎn)，分別位于LG2、LG3、LG8 和LG15 連鎖群上，各位點(diǎn)在連鎖群上成簇分布，這可能與果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑和果肉厚度間存在極顯著正相關(guān)有關(guān)，LOD 值介于2.46～3.58，可解釋9.8%～14.4%的表型變異。