曾慶航，劉楊，孫敏華，胡鑫宇，謝梓民，張敏霞，袁朝霞，廖明

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】H9N2 亞型禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）是目前家禽養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的病毒之一，極易發(fā)生基因突變和基因重組，導(dǎo)致免疫逃逸而造成免疫失敗。該病毒感染性強(qiáng)，傳播速度快，易感染雛雞和青年雞群，主要侵害機(jī)體上呼吸道，可引起機(jī)體的免疫抑制，引發(fā)混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致雞群生長(zhǎng)緩慢、蛋品質(zhì)和產(chǎn)蛋量下降。由于其致病性低，導(dǎo)致H9N2 亞型AIV 在許多國(guó)家未被良好監(jiān)測(cè)和有效控制，現(xiàn)已在全球家禽中流行；其流行廣泛，危害持久，難以清除，給養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅并造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究H9N2 亞型AIV 的遺傳進(jìn)化和生物學(xué)特征，為我國(guó)H9N2 亞型AIV 防控提供參考數(shù)據(jù)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】H9N2 亞型AIV 最早于1966 年在美國(guó)威斯康星州北部的火雞上發(fā)現(xiàn)，我國(guó)則于1992 年在廣東省的雞群中首次發(fā)現(xiàn)該病毒，隨后該病毒在我國(guó)多地出現(xiàn)并蔓延，經(jīng)歷了BJ94-like →F98-like →Y280-like 的演化，當(dāng)前國(guó)內(nèi)流行毒株均屬于h9.4.2.5 分支（Y280-like）［1-3］。自1999 年首次發(fā)現(xiàn)人感染H9N2 亞型AIV 以來(lái)，截至2022 年3月30 日全球共發(fā)現(xiàn)110 例，我國(guó)發(fā)生97 例（占比88.18%），主要集中在我國(guó)南方，而廣東省報(bào)道最多［4-7］。據(jù)多項(xiàng)研究報(bào)道，H9N2 已取代H5N6 和H7N9 成為在禽類(lèi)中流行的優(yōu)勢(shì)亞型，且其作為病毒基因庫(kù)為H3N8、H5N1、H5N6、H7N9、H10N8 等亞型AIV 提供內(nèi)部基因進(jìn)行基因重組，被認(rèn)為可能引起下一次流感大流行［8-15］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】AIV 屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬，基因組由8 個(gè)長(zhǎng)度在890～2 341 個(gè)核苷酸的單鏈負(fù)義RNA 片段組成，可編碼病毒的17 種結(jié)構(gòu)蛋白，其中以HA 和NA 變異最大，是AIV 最主要的保護(hù)性抗原，因此HA和NA基因常作為基因變異依據(jù)用于AIV 遺傳進(jìn)化和生物學(xué)特征分析［16］。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)2022 年廣東地區(qū)3 株H9N2 亞型AIV的HA和NA基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化和生物學(xué)特征分析，為我國(guó)H9N2 亞型AIV 的進(jìn)化分析和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試毒株 H9N2 亞型AIV 毒株 A/Chicken/Guangdong/JY01/2022、A/Chicken/Guangdong/FS03/2022、A/Chicken/Guangdong/KP03/2022（表1），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所分離鑒定和純化保存。

表1 毒株信息Table1 Virus strains information

1.1.2 引物 設(shè)計(jì)合成AIV-12bp 隨機(jī)引物、HA和NA基因PCR 通用引物（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物信息Table2 Primer information

1.1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA 提取試劑盒（磁珠法）購(gòu)自西安天隆科技有限公司，2×Taq Master Mix 和DL2000 DNA Marker 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，PrimeScript? RT Master Mix、pMD19-T 載體和DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和質(zhì)粒提取純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1HA和NA基因擴(kuò)增、克隆及測(cè)序 對(duì)病毒液進(jìn)行總RNA 提取，根據(jù)PrimeScript ? RT Master Mix 說(shuō)明書(shū)，使用AIV-12bp 隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；使用HA和NA基因通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將目的基因純化回收，與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序。

1.2.2HA和NA基因遺傳進(jìn)化及氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)分析 采用SeqMan、Editseq、PhyloSuite 軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行拼接，并進(jìn)行氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)比對(duì)分析；運(yùn)用Megalign 軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行同源性分析；利用MEGA11 軟件采用ML 法繪制HA、NA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)；使用NetNGlyc 1.0 Server軟件對(duì)氨基酸序列N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA和NA 基因PCR 擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果

3 株H9N2 亞 型AIV的HA和NA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別在1 683 bp和1 401 bp的位置（圖1）。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期大小一致，3株病毒的HA基因完整開(kāi)放閱讀框（ORF）各含有 1 683 個(gè)核苷酸，NA基因完整ORF 各含有 1 401 個(gè)核苷酸（圖2）。

圖1 HA（A）、NA（B）基因的PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR p roducts of HA (A) and NA (B) genes

圖2 3 株H9N2 亞型AIV 的 HA、NA 基因ORF 測(cè)序結(jié)果Fig.2 ORF sequencing results of HA and NA genes of three H9N2 AIV strains

2.2 HA和NA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果

基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果顯示，HA基因?qū)儆诋?dāng)前國(guó)內(nèi)流行的h9.4.2.5 分支，與經(jīng)典株A/Chicken/Guangxi/55/200 的遺傳距離較遠(yuǎn)，已進(jìn)化成新的亞群，命名為h9.4.2.5c 分支（圖3A）；NA基因仍屬于1 分支，與早期流行的經(jīng)典株A/Duck/Hong Kong/Y280/97 遺傳距離較遠(yuǎn)，在近幾年形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的新的亞分支，命名為1.2分支（圖3B）。

圖3 3 株H9N2 亞型AIV的HA（A）、NA（B）基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of HA (A) and NA (B) genes of three H9N2 AIV strains

2.3 HA和NA 基因核苷酸 序列同源性分析結(jié)果

核苷酸序列比對(duì)分析結(jié)果（表3）顯示，3株H9N2 亞型AIV 之間HA基因核苷酸序列同源性為 97.6%～98.3%，與h9.4.2.5 分支經(jīng)典代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005 的同源性最高，介于91.3%～91.7%之間；與h9.4.2.4 分支經(jīng)典代表株A/Duck/Hong Kong/Y280/97 的同源性最低，介于81.6%～81.9%之間。3 株H9N2 亞型AIV 之間NA基因核苷酸序列同源性為97.2%～98%，與h9.4.2.3分支疫苗株A/Chicken/Guangdong/SS/94 的同源性最高，介于89.4%～89.8%之間；與h9.4.2.5 經(jīng)典分支代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005 同源性最低，介于86.0%～86.8%之間。

表3 HA和NA 基因核苷酸序列同源性Table 3 Homology of nucleotide sequence of HA and NA gene（%）

2.4 HA 氨基酸序列關(guān)鍵位點(diǎn)分析結(jié)果

3 株H9N2 亞型AIV的HA基因序列完整的ORF 均由1 683 個(gè)核苷酸組成，編碼560 個(gè)氨基酸；HA 裂解位點(diǎn)均為PSRSSR ↓GLF，符合低致病性特征；受體結(jié)合位點(diǎn)均發(fā)生了I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突變；潛在糖基化位點(diǎn)均只有7 個(gè)，218 位由NRT 突變?yōu)镹RI，變成非糖基化位點(diǎn)，313 位由NCP 突變?yōu)镹CS，新增糖基化位點(diǎn)（表4）。

表4 HA 糖基化位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)分析Table 4 Analysis of HA glycosylation sites and receptor binding sites

2.5 NA 氨基酸序列關(guān)鍵位點(diǎn)分析結(jié)果

3 株H9N2 亞 型AIV的NA基因序列完整的ORF 均由1 401 個(gè)核苷酸組成，共編碼466個(gè)氨基酸；與參考株 A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Duck/Hong Kong/Y280/97 相比，在莖部均缺失187～195 位9 個(gè)核苷酸（ACAGAGATA），導(dǎo)致NA 蛋白缺失63～65位3 個(gè)氨基酸（TEI），這與A/Duck/Hong Kong/Y280/97 株為代表的國(guó)內(nèi)流行毒株一致。1.2 分支NA 蛋白的紅細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)（Hemadsorbing site，HB）366～373 位產(chǎn)生K/E/S368N、D369N 突變 ；與NA 蛋白活性、抗流感藥物奧司他韋和扎那米韋耐藥性相關(guān)的E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 位點(diǎn)均未發(fā)生突變（表5）。

表5 NA 蛋白HB 結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)和耐藥性位點(diǎn)分析Table 5 Analysis of NA protein HB binding sites,active sites and drug resistance sites

3 討論

禽流感病毒屬于RNA 病毒，在免疫壓力和外界因素影響下易發(fā)生基因突變和基因重組，進(jìn)化出新的基因型。我國(guó)自1992 年首次報(bào)道H9N2亞型AIV 已有30 年的流行歷史，期間經(jīng)歷了BJ94-like →F98-like → Y280-like 的演化，1997年報(bào)道A/Duck/Hong Kong/Y280/97 毒株后，以Y280-like 為代表的毒株成為我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)毒株，均屬于h9.4.2.5 分支［17-18］。我國(guó)于1998 年開(kāi)始在雞群中使用滅活疫苗來(lái)控制該病毒引起的疾病，在家禽疫苗接種計(jì)劃后，H9N2 亞型AIV的演變速度加快［19-21］。AIVNA基因的0 分支以A/Chicken/Hong Kong/G9/97 株為代表，主要在1997—2011 年流行；1 分支則在1994—2006 年流 行，以A/Chicken/Beijing/1/94 和A/Duck/Hong Kong/Y280/97 株為代表；2007—2013 年開(kāi)始演變出穩(wěn)定的1.1 和1.2 亞分支并流行至今［22］。本研究3 株H9N2 亞型AIV 的基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，HA、NA基因與早期的經(jīng)典株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangxi/55/2005 和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Chicken/Guangdong/SS/94 等的遺傳距離較遠(yuǎn)，核苷酸同源性分別僅為81.6%～91.7%和88.2%～91.2%，已經(jīng)進(jìn)化成新的亞群［6-9］。因此，持續(xù)跟蹤、系統(tǒng)分析，及時(shí)掌握流行變異情況，對(duì)H9N2 亞型AIV 的防控具有重要意義。

流感病毒侵染細(xì)胞的先決條件是HA 裂解為HA1 和HA2，HA2 暴露出疏水端，HA 蛋白發(fā)生融膜［23］。LPAIV HA 裂解位點(diǎn)一般為R-S-S-R結(jié)構(gòu)，只含1 個(gè)或2 個(gè)連續(xù)堿性氨基酸，只有精氨酸特異蛋白酶能識(shí)別并裂解這種結(jié)構(gòu)，因此一般只引起局部感染。本研究3 株H9N2 亞型AIV HA 蛋白酶解位點(diǎn)序列為PSRSSR ↓GLF，符合低致病性特征。與A/Chicken/Guangxi/55/2005 經(jīng)典株等相比，3 個(gè)分離株HA 蛋白裂解位點(diǎn)的第334位均由A 變?yōu)镾，而研究表明該突變會(huì)增強(qiáng)病毒對(duì)家禽的致病性［24］。

流感病毒的適應(yīng)性突變主要發(fā)生于病毒表面膜蛋白，包括HA 蛋白受體位點(diǎn)的改變、糖基化修飾位點(diǎn)的分布和NA 蛋白莖部的缺失［25］。有研究報(bào)道，HA 蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)155、183、190、212、226、227 位與人源唾液酸受體結(jié)合的親和力有關(guān)，I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突變會(huì)增強(qiáng)與人源唾液酸受體結(jié)合的親和力，其中190V 具有高度親和力，其次是190T［26-28］。本研究中，3個(gè)分離株HA 蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)分析顯示，均發(fā)生I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突變，提示表現(xiàn)出人源唾液酸受體結(jié)合特性。另有研究表明，HA 蛋白218N 突變?yōu)榉翘腔稽c(diǎn)，同時(shí)313N新增為糖基化位點(diǎn)，會(huì)增強(qiáng)病毒與受體的結(jié)合能力，阻止同源抗血清對(duì)病毒的中和作用，以及增強(qiáng)病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力和在細(xì)胞中的復(fù)制能力［29-30］。本研究3 個(gè)分離株HA 蛋白糖基化位點(diǎn)分析顯示，218 由NRT 突變?yōu)镹RI 成為非糖基化位點(diǎn)，同時(shí)313 位由NCP 突變?yōu)镹CS，新增為糖基化位點(diǎn)，與前期研究相符，提示該突變同時(shí)提高了該3 株病毒的致病性及改變了其抗原性。

NA 蛋白頭部有酶活性中心和抗原位點(diǎn)，莖部與蛋白錨定有關(guān)［23］，莖部缺失是流感病毒毒力增強(qiáng)的標(biāo)志［31］。本研究3 株H9N2 亞型AIV的NA基因序列分析顯示，與參考株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Duck/Hong Kong/Y280/97 相比，分離株的莖部均缺失187～195 位9 個(gè)核苷酸（ACAGAGATA），導(dǎo)致NA 蛋白缺失63～65 位3 個(gè)氨基酸（TEI），這與A/Duck/Hong Kong/Y280/97 株為代表的國(guó)內(nèi)流行毒株一致。莖部缺失使病毒更易脫離細(xì)胞，增強(qiáng)毒力、擴(kuò)大宿主范圍［32］。流感病毒NA 蛋白上E119A/D/G/V、D151E、R152K、R224K、E276D、R292K、R371K 位點(diǎn)突變會(huì)改變蛋白活性和增強(qiáng)對(duì)抗流感病毒藥物奧司他韋、扎那米韋的耐藥性［33-34］。本研究3 株H9N2 亞型AIV 的以上位點(diǎn)均未發(fā)生此突變。研究報(bào)道，NA 蛋白的紅細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)366～373、399～404 和431～433 分別形成3 個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，唾液酸和氨基酸直接結(jié)合在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中［35］。本研究觀察到HB 結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生K/E/S368N、D369N 的變化，該突變是否會(huì)影響唾液酸和氨基酸結(jié)合有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

2022 年從廣東部分地區(qū)分離的3 株H9N2 亞型AIV的HA和NA基因分別屬于h9.4.2.5c 和1.2 分支，與以A/Chicken/Beijing/1/94 為代表的經(jīng)典株和A/Chicken/Guangdong/SS/94 等疫苗株的遺傳距離較遠(yuǎn)，核苷酸序列同源性分別僅為81.6%～91.7%和88.2%～91.2%，已經(jīng)進(jìn)化成新的亞群；HA 氨基酸序列均發(fā)生I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突變，218N 去糖基化的同時(shí)313N 糖基化，以及NA 氨基酸序列63～65 位（TEI）缺失，表明目前廣東地區(qū)流行的H9N2 亞型AIV 可能增強(qiáng)了對(duì)哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性，且其抗原性發(fā)生改變；同時(shí)，NA 氨基酸序列E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 均未發(fā)生突變，表明其尚未獲得對(duì)奧司他韋和扎那米韋等抗流感病毒藥物的耐藥性。本研究結(jié)果表 明3 株H9N2 亞型AIV 的HA 和NA 部 分關(guān)鍵氨基酸序列已發(fā)生不同 程度變異，建議持續(xù)對(duì)H9N2 亞型AIV 的流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本研究結(jié)果明確了廣東省H9N2 亞型AIV 的感染現(xiàn)狀及流行毒株的分子流行病學(xué)特點(diǎn)、遺傳演化情況，可為廣東地區(qū)今后更有效地預(yù)防控制H9N2 亞型AIV 感染及疫苗選擇提供參考。