羅志鑫 林濤 魏茂瓊 胡建林 黎其萬

當前最受關注的禁限用農藥包括有機磷類、氨基甲酸酯類殺蟲劑，毒死蜱和三唑磷是一種高效、廣譜的有機磷殺蟲劑，對人體神經系統(tǒng)有較大危害；克百威是廣譜高毒的氨基甲酸脂類殺蟲劑，其氧化應激作用可引起明顯的細胞毒性。同時，氨基比林類的氟蟲腈由于對環(huán)境不友好亦被禁用。肥料是食品上游產業(yè)鏈的重要一環(huán)，而禁限用殺蟲劑由于“效果好、見效快、價格低”等特點，且與肥料施用途徑相同，因此常作為隱性成分被經銷商或農戶混配至肥料中。農業(yè)農村部公布的農藥監(jiān)督抽查結果顯示，在肥料中非法添加禁限用隱性成分的問題仍不容忽視。然而，使用傳統(tǒng)的檢驗方法，難以在肥料產品投入周期的各應用場景中進行快速篩查和監(jiān)管。因此，有必要從肥料生產加工、流通貿易、田間施用等環(huán)節(jié)，建立肥料中禁限用農藥快速篩查方法，以保障食品安全。

國內外針對禁限用殺蟲劑的主要檢測方法包括高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質譜法、拉曼光譜法、毛細管電泳法，不但樣品前處理復雜、檢測時間長，而且需要昂貴的儀器設備。膠體金免疫層析法具備簡便快速、靈敏度高、特異性強、無需昂貴的儀器設備等優(yōu)點，且已研發(fā)出便于使用的商品化試劑盒產品，裸眼即可判定檢測結果，但目前此類試紙條僅被用于果蔬農殘檢測，在肥料中的應用鮮見報道。肥料的基質與果蔬不同，目前尚無與之適用的商品化的快速檢測試紙條供應，因此本實驗通過優(yōu)化前處理方法，探究針對肥料中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的快速高效的試紙條檢測方法。

對膠體金試紙條結果的量化依靠于金標讀數(shù)儀，此類儀器通常只與同一品牌規(guī)格的試紙條產品捆綁使用，不同品牌間的規(guī)格制式互不兼容。而智能手機集成了多種傳感器，理論上可進行多通道數(shù)據(jù)量化，利用手機拍圖比色分析在其他研究中已有先例。因此，本實驗嘗試對膠體金免疫層析試紙條的條帶圖像進行量化分析。

本實驗拓寬了商品化的膠體金免疫層試紙條的應用范圍，借由手機拍圖量化數(shù)據(jù)，建立并評價了肥料中禁限用殺蟲劑的快速篩查方法，以期為管控肥料非法混配禁限用殺蟲劑提供參考，從上游保障食品安全。

一、儀器與試劑

本實驗采用的通用型家庭園藝肥購自史丹利農業(yè)集團股份有限公司，粉碎后裝瓶封存待用。

1.實驗試劑。毒死蜱、克百威、三唑磷和氟蟲腈購自農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，以上標準物質濃度為1000μg/mL。EDTA-2NA、甲醇、乙腈、乙酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑北京有限公司?？税偻焖贆z測試劑盒購自北京六角體科技發(fā)展有限公司，毒死蜱、三唑磷、氟蟲腈快速檢測試劑盒購自深圳市安鑫寶科技發(fā)展有限公司。

2.主要儀器設備。渦旋儀震蕩器QL-866，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；回旋式振蕩儀，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；氮吹儀MODEL 8125，美國Organomation公司；高速離心機TGL-15B型，上海安亭科學儀器廠；高效液相串聯(lián)質譜儀API-4000，AB SCIEX。

二、實驗與方法

1.膠體金免疫層析試紙條檢測與結果判讀。（1）裸眼判讀。將150μL待測液滴入試紙條樣品孔中，水平放置層析10-15min，顯色穩(wěn)定后裸眼檢視判讀結果。陰性結果：T、C線都顯紅色，待測樣液中所測成分濃度低于試紙條檢測限。弱陽性結果：T線顯淺紅色，待測樣品液中所測成分略低于檢測限濃度，但能夠對包被抗原產生競爭。陽性結果：只顯示C線條帶，此時待測樣液中所測成分濃度大于裸眼消線濃度。試紙條失效：T、C線都不顯或C線不顯。

（2）手機拍圖量化T、C線判讀。如果待測液中被測物濃度在陰性濃度至裸眼消線濃度（檢測限濃度）之間，試紙條檢測結果顯示為弱陽性，此時被測物濃度與試紙條T、C條帶上的膠體金數(shù)目即顯色程度相關，當被測物濃度升高，T線顯色變淺直至裸眼消線濃度而完全消失。所以，當試紙條顯示弱陽性系列結果時，可在一定范圍內量化試紙條T、C線顯色，線性回歸半定量被測物濃度。

應用試紙條檢測呈穩(wěn)定顯色后，置于背景板上，固定拍攝光源和拍攝距離，手機拍圖，圖像經ImageJ軟件轉8-bit圖，翻轉圖片模式，仔細框選同一面積下的C線和T線的膠體金顯色條帶。以光密度（IntDen）表證膠體金的數(shù)目，因膠體金數(shù)目越多顯色越深，從而量化得到T/C比值與濃度呈負相關，以此表證被測物濃度，實現(xiàn)對弱陽性結果的半定量分析，并借此評價前處理方法。

2.試紙條性能評價。以試劑盒PBS緩沖液稀釋被測物標品，配制系列標準溶液，取150μL滴入試紙條加樣孔中，10-15min內觀察顯色結果，手機拍照記錄，量化識別判讀T線、C線顯色，考察試紙條的檢測限與檢測范圍。

3.樣品前處理。（1）提取劑的選擇。肥料粉碎過篩，取2g于10mL離心管中，分組添加相當于毒死蜱試紙條5倍、3倍、1倍檢測限濃度（即裸眼消線濃度）的加標量，分別采用3mL的PBS緩沖液、甲醇、乙腈作為提取劑，用簡易提取法處理，試紙條檢測，裸眼檢視比較在各加標量下各提取劑的提取效果。

（2）優(yōu)化提取方法?；诤Y選出的提取劑，為保障回收率與精密度，繼續(xù)優(yōu)化提取方法。取2g空白肥料基質，添加試紙條相應檢測限濃度的被測物標準品，分別采用震蕩、超聲、渦旋提取優(yōu)化提取步驟，評價基質效應。

（3）提取液的凈化。將提取液置于10mL玻璃管中，在-18℃冰箱中凍存30min，待出現(xiàn)絮狀結晶后，經0.22μm注射過濾器過濾，取濾液0.5mL氮吹干，再用2mL的PBS緩沖液復溶得到待測液。

4.高效液相串聯(lián)質譜法檢測。（1）色譜條件。與試紙條方法的凈化步驟有所不同，凈化液氮吹干，應取流動相定容至2mL，上機檢測基質匹配外標定量。色譜條件為：色譜柱ACQUITYUPLC，C18，1.7μm；柱溫40℃，樣品室溫度20℃；進樣量1μL。

正離子模式下的流動相為：0.1%甲酸+乙酸銨（A2），甲醇（B2），流速300μL/min。梯度洗脫：0-3.5min，95%A2線性變化至5%A2；3.5-5.5min，維持5%A2；5.5-5.7min，線性變化至95%A2；5.7-8min，維持95%A2。

負離子模式下的流動相為：純水（A1），甲醇（B2），流速300μL/min。梯度洗脫：0-3min，55%A1線性變化至5%A1；3-4.7min，維持5%A1；4.7-6min，5%A1線性變化至55%A1；6-8min維持55%A1。

（2）質譜條件。電噴霧離子源；正負離子模式切換；多反應模式檢測。各被測物的定性定量離子對、去簇電壓、碰撞能量如表1所示。

5.添加回收實驗驗證一致性。按已優(yōu)化的前處理步驟進行回收實驗，試紙條檢測每組平行測量3次，利用ImageJ軟件進行光密度量化得到T/C比值，基質匹配標曲外標定量，驗證試紙條檢測方法。同時，應用液相串聯(lián)質譜儀檢測同批提取液，考察組內相關系數(shù)ICC，評價其與試紙條檢測結果的一致性。

三、結果與分析

1.試紙條性能分析。用試劑盒PBS緩沖液稀釋配制系列濃度溶劑標品，試紙條檢測量化T、C線結果，以T/C值為縱坐標，濃度為橫坐標，SPSS線性擬合，試紙條檢測毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的檢測范圍換算后分別為0.198-0.018μg/g、1.62-0.108μg/g、1.5-0.00936μg/g、0.084-0.0052μg/g。溶劑標曲分別為Y=1.063-8.422X，R2=0.879；Y=0.874-0.881X，R2=0.798；Y=0.952-0.678X，R2=0.778；Y=1.196-24.24X，R2=0.642。試紙條檢測限即裸眼消線濃度換算后分別為0.198μg/g、1.62μg/g、1.5μg/g、0.084μg/g。不同種類試紙條的線性關系擬合度有一定差距，可能來源于各批次試紙條工藝，或是各種類抗原抗體間免疫反應性的靈敏度不同所致。

2.樣品前處理。（1）提取劑的選擇。應用簡易提取方法，考察不同提取劑的效果。取2g肥料于10mL離心管中，添加相應濃度的毒死蜱標品，混勻后靜置15min；取3mL提取劑，震蕩提取5min，5000r/min離心5min；取0.5mL上清提取液，氮吹干后，用2mL的PBS緩沖液復溶，進行試紙條檢測，結果如表2所示。甲醇的提取效果與乙腈相當，都在5倍、3倍檢測限濃度的加標量下顯示陽性與弱陽性結果，但甲醇作提取劑時，T、C條帶整體顯色較同濃度溶劑標品顯色略淺，可能是甲醇中裹挾的無機鹽過多，干擾免疫反應，或是膠體金狀態(tài)不穩(wěn)定干擾顯色。而PBS緩沖液作提取劑時，可以省去吹干復溶步驟，但試紙條會失效，故選用乙腈作為提取劑，繼續(xù)優(yōu)化提取方法。

（2）優(yōu)化提取方法。添加相應試紙條檢測限的加標量至2g空白基質中，用3mL乙腈做提取劑，震蕩提取、超聲提取5min，離心后取0.5mL上清液氮吹干，再用PBS緩沖液2mL復溶，試紙條檢測結果都為陰性。因為在震蕩提取和超聲提取過程中，復合肥料會在離心管內呈糊狀結塊而沉降導致提取不充分，所以在提取前加入水相，并采用渦旋提取以防止基質沉降。

優(yōu)化后的步驟如下：①取2g肥料于10mL離心管內，加入2mL濃度為1mol/L的EDTA-2NA水溶液，輕搖潤濕基質，水相分散基質改善了流動性，防止基質在提取過程中呈糊狀結塊，同時EDTA螯合金屬離子增加了無機鹽離子在水相中的分配，從而減少基質干擾。②加入1.5mL乙腈，渦旋提取5min，5000r/min離心5min，乙腈與水相在強電解質環(huán)境中自發(fā)鹽析分層。③取上清液1.5mL于10mL玻璃管中，用乙腈重提一次（提取毒死蜱、克百威時，提取劑為1%乙酸酸化乙腈）。④合并上清提取液進行凈化處理，降低無機鹽殘余量，得到待測液，用試紙條進行檢測。

照上述前處理步驟制取空白基質提取液，稀釋標準儲備液，配制成系列濃度基質匹配標準溶液，經優(yōu)化提取處理后用試紙條檢測拍圖量化，做基質匹配標準曲線，結果線性擬合如圖1所示。

由圖1可知，毒死蜱的基質匹配標曲為Y=0.9999-9.931X，R2=0.889；克百威的基質匹配標曲為Y=0.918-0.869X，R2=0.801；三唑磷的基質匹配標曲為Y=0.806-0.721X，R2=0.779；氟蟲腈的基質匹配標曲為Y=1.142-22.226X，R2=0.693。與各自溶劑標曲斜率的差異較小，表明此前處理中的基質效應可接受，能夠滿足禁限用殺蟲劑的快速篩查。

3.添加回收實驗。在空白基質中分別添加試紙條檢測呈弱陽性的兩組加標量，基于已優(yōu)化的前處理進行回收實驗。平行測量三次，基質匹配標曲外標定量，試紙條檢測毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的回收率為67.22%-125.28%，相對標準偏差為3.61%-18.84%，詳見表3。將相同提取液經液相色譜串聯(lián)質譜檢測，回收率為72.80%-123.86%。對兩種方法的回收率做數(shù)據(jù)一致性分析，其組內相關系數(shù)ICC=0.634（＞0.4），表明兩種方法所測結果有一致性，該試紙條檢測方法可滿足肥料中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的初篩應用。

四、討論與結論

膠體金免疫層析試紙條檢測迅速、查驗方便、抗原抗體制備技術成熟、成本低、易普及且應用歷史悠久，在半定量快速篩查中占據(jù)重要地位。結合手機拍圖ImageJ量化T、C線顯色，可以建立被測物濃度與試紙條顯色的線性關系，但受手機自帶拍攝軟件算法“優(yōu)化調整”的影響，易受外源影響而導致同一張試紙的多張圖片經過ImageJ量化所得參數(shù)有所偏差，建立線性關系時的數(shù)據(jù)缺乏可比性，故可采取一定措施降低偏差。

將試紙條置于固定的光源、背景板和拍攝距離下采集圖片，并于背景板上添加多張灰度值不一、形狀方正的色卡作為一致性參照物。試紙條檢測后，在有效觀測時間內對同一試紙條多次采集，從復數(shù)結果中篩出背景板上一致性參照物，經ImageJ量化將參數(shù)近似的不同試紙圖片作一個系列，則可認為此系列圖片的采集條件一致，具有可比性。

本實驗建立了利用膠體金免疫層析試紙條檢測復合肥料樣品中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的快速檢測方法，其檢測結果與高效液相串聯(lián)質譜方法的檢測結果具有一致性。該法檢測毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的檢測限即裸眼消線濃度經換算分別為0.198μg/g、1.62μg/g、1.5μg/g、0.084μg/g，遠高于肥料中隱性成分的有效添加量，能滿足分析需求且方法可靠，為監(jiān)管部門檢測肥料中混配此四種禁限用殺蟲劑的初步篩查提供了參考。