楊麗萍 馬臻棋 王學(xué)紅 辛?xí)远?祖紅梅 鄧金花

結(jié)腸息肉多見(jiàn)于50歲以上人群,隨著年齡的增長(zhǎng)其發(fā)生率也在不斷地增高,大量研究表明,結(jié)腸息肉是癌前病變,尤其是腺瘤性息肉,其癌變率極高,并且人們普遍認(rèn)為60歲以上的人群中有40%會(huì)發(fā)生腺瘤性息肉。因此認(rèn)識(shí)結(jié)腸息肉的危險(xiǎn)因素及發(fā)病機(jī)制對(duì)減少結(jié)腸息肉甚至結(jié)腸癌的發(fā)生具有一定的意義。目前結(jié)腸息肉的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,但與多種危險(xiǎn)因素有關(guān),如慢性炎癥刺激、遺傳因素、代謝綜合征、長(zhǎng)期便秘、結(jié)腸黑變病等[1]。研究表明,結(jié)腸息肉患者腸道菌群的豐度、多樣性與正常人比較有很大區(qū)別,這表明腸道菌群與結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明腸毒素脆弱擬桿菌(enterotoxigenic bacteroides fragilis,ETBF)和具核梭桿菌(fusobacterium nucleatum,Fn)與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[2,3]。然而,以上兩菌與結(jié)腸息肉的相關(guān)性尚不明晰。本研究分析了青海地區(qū)糞便ETBF、Fn與結(jié)腸息肉的病理類(lèi)型、直徑、數(shù)量、部位的相關(guān)性,初步探討糞便ETBF和Fn水平與結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

資料與方法

1.研究對(duì)象：選取2020年11月～2021年6月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)結(jié)腸鏡及病理檢查明確診斷的結(jié)腸息肉患者50例(結(jié)腸息肉組)、結(jié)腸癌患者30例(結(jié)腸癌組),并選取同期行結(jié)腸鏡檢查陰性的健康體檢者30例(健康組),并同時(shí)收集糞便樣本。本研究通過(guò)青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理學(xué)審批號(hào)：P-SL-201958)。

2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：①在青海地區(qū)居住10年以上;②年齡為40～70歲;③所有研究對(duì)象均行結(jié)腸鏡檢查及病理檢查分別明確診斷為結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌以及結(jié)腸鏡檢查陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①素食主義者;②有除了結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌的其他腸道疾病,有腸道相關(guān)手術(shù)史、家族性腺瘤性息肉病、P-J綜合征;③有嚴(yán)重的肝膽疾病、腫瘤病史;④收集標(biāo)本前3個(gè)月內(nèi)服用過(guò)抗生素、免疫抑制劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇激素或益生菌。

3.實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)糞便基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取樣本DNA。使用生工質(zhì)粒提取試劑盒B518191 SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后用微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒吸光度(A260)的值,通過(guò)公式換算成拷貝數(shù)。10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒,90μl 稀釋液+10μl 質(zhì)粒,一般做4～6個(gè)點(diǎn),通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取合適標(biāo)準(zhǔn)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。Q-PCR：將DNA樣品稀釋50倍作為模板上機(jī)檢測(cè)。引物序列：ETBF上游引物：TGGCAGTATAAATCATATCCAAAGC,下游引物：ATGCAGCGATAGAGGTTTTTAAGTA;Fn上游引物：ACCAACAGAAGAAGTGACGGCT;下游引物：TTGAGCCCTGCATTTTCACAT Tm=60136bp。配制反應(yīng)混合液10μl：SybrGreen qPCR Master Mix(2×)5μl,上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各0.2μl,ddH2O 3.6μl,模板(DNA) 1.0μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 3min;PCR反應(yīng) 95℃ 5s,60℃ 30s,共45個(gè)循環(huán)。完成上述步驟后,把加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480 Ⅱ (德國(guó)Roche公司)中進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的ETBF及Fn的擴(kuò)增曲線及熔解曲線詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 ETBF擴(kuò)增曲線和熔解曲線A.擴(kuò)增曲線;B.熔解曲線

圖2 Fn擴(kuò)增曲線和熔解曲線A.擴(kuò)增曲線;B.熔解曲線

結(jié) 果

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：ETBF的回歸方程：Y=-3.112X+36.72,R2=0.9983,擴(kuò)增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-3.112-1=109.6%;Fn的回歸方程：Y=-2.942X+33.98,R2=0.9989,擴(kuò)增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-2.942-1=118.7%。其中Y是指CT值,X是指Log濃度即取濃度的對(duì)數(shù)。ETNF、Fn的標(biāo)準(zhǔn)曲線詳見(jiàn)圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線A.ETBF標(biāo)準(zhǔn)曲線;B.Fn標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.糞便ETBF、Fn水平與不同分組之間的關(guān)系：結(jié)腸息肉組中糞便ETBF、Fn的水平均高于健康組的水平(P<0.05),而低于結(jié)腸癌組的水平(P<0.05);糞便ETBF、Fn的水平在健康組、結(jié)腸息肉組、結(jié)腸癌組中呈逐漸升高的趨勢(shì)(表1)。

表1 不同分組與糞便ETBF、Fn水平的關(guān)系

3.糞便ETBF水平與結(jié)腸息肉不同性質(zhì)之間的關(guān)系：結(jié)腸息肉的病理分型影響糞便ETBF水平,腺瘤性息肉組中糞便ETBF的水平顯著高于非腺瘤性息肉組(P<0.05);而糞便ETBF水平與結(jié)腸息肉的數(shù)量、發(fā)生部位、直徑、巴黎分型之間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05,表2)。

表2 結(jié)腸息肉的不同性質(zhì)與糞便ETBF、Fn水平的關(guān)系

4.糞便Fn水平與結(jié)腸息肉不同性質(zhì)的關(guān)系：結(jié)腸息肉的病理分型影響糞便Fn水平,其中腺瘤性息肉組中糞便Fn的水平顯著高于非腺瘤性息肉組(P<0.05);而糞便Fn水平與結(jié)腸息肉的數(shù)量、發(fā)生部位、直徑、巴黎分型之間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05,表2)。

5.糞便ETBF、Fn對(duì)結(jié)腸息肉診斷價(jià)值和準(zhǔn)確性分析：結(jié)合ROC曲線分析糞便ETBF、Fn、ETBF與Fn聯(lián)合診斷結(jié)腸息肉的價(jià)值,其中ETBF的AUC為0.781(95%CI：0.680～0.881),敏感度為76%,特異性為70%,最佳臨界值為31734.41copies/mg;Fn的AUC為0.817(95%CI：0.722～0.912),敏感度為78%,特異性為73%,最佳臨界值為23330.50copies/mg;Fn與ETBF聯(lián)合的AUC為0.860(95%CI：0.783～0.949),敏感度為82%,特異性為80%,糞便ETBF、Fn、ETBF與Fn聯(lián)合診斷結(jié)腸息肉的AUC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表3、圖4)。

表3 糞便ETBF、Fn、ETBF與Fn聯(lián)合診斷結(jié)腸息肉的ROC曲線的AUC評(píng)價(jià)

圖4 糞便ETBF、Fn、ETBF與Fn聯(lián)合對(duì)結(jié)腸息肉診斷的價(jià)值(ROC曲線)

討 論

近年來(lái),由于人們生活方式的改變及生活水平的提高,我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)生率也迅速上升。目前研究表明,結(jié)腸息肉是結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中最主要的癌前疾病,而腺瘤性息肉是最常見(jiàn)的癌前病變。而結(jié)腸息肉病因尚不完全明晰,與多種因素有關(guān),現(xiàn)有大量研究表明,腸道菌群與結(jié)腸息肉的發(fā)生密切相關(guān)。

脆弱擬桿菌是一種革蘭陰性專(zhuān)性厭氧菌通常在人類(lèi)腸道菌群中發(fā)現(xiàn),但也在口腔、上呼吸道中檢測(cè)到,是人類(lèi)宿主中常見(jiàn)的結(jié)腸共生菌,其數(shù)量約占腸道菌群總數(shù)的30%[4,5]。脆弱擬桿菌按是否分泌脆弱擬桿菌毒素分為非產(chǎn)毒素脆弱類(lèi)桿菌和ETBF,而ETBF與人體的健康有著密切的關(guān)系。目前ETBF已被證明通過(guò)激活促炎性細(xì)胞因子和上調(diào) Wnt信號(hào)而促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生[6]。張靜等[2]研究發(fā)現(xiàn),ETBF水平在健康組、腺瘤性息肉組、結(jié)腸癌組中呈逐漸升高的趨勢(shì),這與本研究的研究結(jié)果一致。

本研究通過(guò)比較青海地區(qū)健康體檢者、結(jié)腸息肉患者、結(jié)腸癌患者中糞便ETBF的水平,發(fā)現(xiàn)糞便ETBF的水平隨著疾病的進(jìn)展逐漸升高,在結(jié)腸癌中其水平最高,結(jié)腸息肉次之,健康人群中水平最低,這表明糞便ETBF與結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其可能的原因如下：①Hwang等[7]研究表明,BFT可誘導(dǎo)持續(xù)性的結(jié)腸炎,破壞E-鈣黏蛋白連接,激活B-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),并誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌IL-8,而IL-8 是一種有效的炎癥趨化因子;②BFT還激活NF-κB以誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,這會(huì)導(dǎo)致黏膜炎癥[8];③BFT可誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子-1和腸上皮細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá),從而改變內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,增強(qiáng)與炎性細(xì)胞的黏附作用,加重炎性反應(yīng)[9]。以上均表明ETBF與腸道炎性反應(yīng)有關(guān),而腸道的長(zhǎng)期慢性炎癥刺激會(huì)損傷并破環(huán)黏膜屏障,引起結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展。故糞便ETBF可能引起慢性的結(jié)腸炎性反應(yīng)從而導(dǎo)致結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展,并且在本研究中將結(jié)腸息肉組按其病理類(lèi)型、直徑、數(shù)量、部位、巴黎分型分組,分別探討與糞便ETBF的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)只有結(jié)腸息肉的病理類(lèi)型與糞便ETBF有著顯著的相關(guān)性,在腺瘤性息肉中的水平高于非腺瘤性息肉患者的水平,其余均無(wú)顯著相關(guān)性,這與賴雪瑩等[10]的研究有所不同,可能與本研究樣本量較小有關(guān),但不排除受地域因素以及獨(dú)特的飲食習(xí)慣的影響。

Fn是專(zhuān)性厭氧革蘭陰性桿菌,末端呈錐形,主要存在于口腔、胃腸道、上呼吸道等部位,它不同于其他擬桿菌科,因?yàn)槠洚a(chǎn)生N -丁酸而不產(chǎn)生異丁酸或異戊酸[11]。有研究表明,Fn通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、毒力因子、microRNA和細(xì)菌代謝促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[12]?，F(xiàn)也有許多研究發(fā)現(xiàn)在腺瘤性息肉的患者糞便中Fn的水平較高,而且活檢組織中Fn的水平顯著高于健康人群,并且檢測(cè)到Fn水平結(jié)腸組織中隨疾病的進(jìn)展而逐漸升高,并且在腺瘤性息肉患者的息肉組織中Fn水平與組織的異型增生的程度相關(guān),即便是在體積很小的息肉組織中Fn的水平也高于正常黏膜組織[13]。這與本研究的研究結(jié)果一致。

本研究通過(guò)比較青海地區(qū)健康體檢者、結(jié)腸息肉患者、結(jié)腸癌患者的糞便Fn水平,發(fā)現(xiàn)糞便Fn水平隨著病情的進(jìn)展逐漸升高,這表明糞便Fn與結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),可能的原因有：①Fn促進(jìn)腸上皮損傷和炎性細(xì)胞因子 IL-1β、Il-6、IL-17F和TNF-α的表達(dá),而大量研究表明,血清中的TNF-α、IL-6的濃度與息肉發(fā)生密切相關(guān)[14];②Fn結(jié)合E-鈣黏蛋白激活B-連環(huán)蛋白信號(hào)通路以調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[15];③Fn激活一種必不可少的炎癥信號(hào)通路(如NF-κB通路)[14]。以上均表明Fn與腸道炎性反應(yīng)有關(guān),而腸道的長(zhǎng)期慢性炎癥刺激會(huì)損傷并破環(huán)黏膜屏障,引起結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展,故糞便Fn可能引起慢性結(jié)腸炎性反應(yīng)從而導(dǎo)致結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展。并且在本研究中將結(jié)腸息肉組按其病理類(lèi)型、直徑、數(shù)量、部位、巴黎分型分組,分別探討與糞便Fn的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)只有結(jié)腸息肉的病理類(lèi)型與糞便Fn有著顯著的相關(guān)性,在腺瘤性息肉中的水平高于非腺瘤性息肉患者,其余均無(wú)顯著相關(guān)性,這與既往研究結(jié)果如Rezasoltani等[16]的研究結(jié)果有所不同,其可能與本研究樣本量較小有關(guān),但不排除受地域因素以及獨(dú)特的飲食習(xí)慣的影響。

故糞便ETBF、Fn與結(jié)腸息肉有著密切的關(guān)系,但是如今篩查結(jié)腸息肉的手段有限,而且因?yàn)楹芏嗳硕寂懦庑薪Y(jié)腸鏡檢查,故有必要探索篩查結(jié)腸息肉的其他人們?nèi)菀捉邮艿姆椒?故本研究發(fā)現(xiàn)糞便ETBF診斷結(jié)腸息肉的AUC為0.781,敏感度為76%,特異性為70%,最佳臨界值為31734.41copies/mg;糞便Fn診斷結(jié)腸息肉的AUC為0.733,敏感度為78%,特異性為60%,最佳臨界值為23330.50copies/mg;當(dāng)糞便Fn與ETBF聯(lián)合診斷結(jié)腸息肉時(shí),AUC增加至0.816,敏感度為82%,特異性為70%,故糞便Fn與ETBF聯(lián)合可作為早期篩查結(jié)腸息肉的一種方法。Rezasoltani 等[17]研究發(fā)現(xiàn),將糞便ETBF、Fn、糞腸球菌、牛鏈球菌和卟單胞菌聯(lián)合可以提高腺瘤與大腸癌的診斷價(jià)值。但相關(guān)研究較少,有待于進(jìn)一步研究探索出人們?nèi)菀捉邮艿暮Y查結(jié)腸息肉的其他方法,進(jìn)而降低結(jié)腸癌的發(fā)生,將部分結(jié)腸癌扼殺在搖籃中。

綜上所述,本研究主要討論了青海地區(qū)人群糞便ETBF、Fn與結(jié)腸息肉的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,青海地區(qū)為高原地區(qū),氧氣稀薄,有獨(dú)特的飲食及文化習(xí)慣,而ETBF、Fn恰恰是厭氧菌,故更應(yīng)重視青海地區(qū)ETBF、Fn與結(jié)腸息肉的關(guān)系,以減少結(jié)腸息肉及結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。