周 方 蔣永紅 陳松長 陳紅巖 盧大儒

世界衛(wèi)生組織 (world health organization,WHO) 將女性從末次月經(jīng)期第一天算起,妊娠少于259天或者妊娠少于37周的分娩定義為早產(chǎn)[1]。根據(jù)2019年的研究報道,全球平均早產(chǎn)率為10.6%,中國早產(chǎn)率為6.9%[2]。早產(chǎn)對新生兒的生活質量具有顯著影響,使一些疾病的風險增加,給早產(chǎn)兒家庭造成巨大的心理和經(jīng)濟負擔。孕婦妊娠開始后,需要通過自身代謝提供母嬰的共同能量需求,代謝增強,使得肝臟負荷增加。肝功能受損會引起妊娠期影響孕婦妊娠結局[3]。

肝功能檢測 (liver function test,LFTs) 是在臨床上常見的檢測肝病的手段,同時也可以作為其他器官疾病的輔助檢測指標,例如糖尿病、代謝綜合征等[4]。常見的 LFTs 指標包括丙氨酸氨基轉移酶 (alanine aminotransferase,ALT)、膽紅素 (total bilirubin,TB)、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)、天冬氨酸氨基轉移酶 (aspartate transaminase,AST)、γ-谷氨酰轉肽酶 (γ-glutamyl transpeptidase,GGT) 等[5,6]。肝功能檢測指標的遺傳在歐洲、美洲、東亞等不同人群中存在群體差異性[7～11]。

參照中國三甲醫(yī)院制定的產(chǎn)檢時間表,孕婦需要在妊娠第12周和分娩前進行肝功能檢測。通過近20年妊娠期肝功能異常相關文章的Meta分析表明,妊娠期肝功能異常與早產(chǎn)顯著相關(OR=4.48,95% CI：3.89～6.60)[12]。妊娠期肝功能指標ALP、AST、GGT是早產(chǎn)的獨立危險因素,但是早產(chǎn)孕婦的肝功能檢測指標在全基因組層面的關聯(lián)研究尚未開展[13,14]。

本研究旨在通過對上海國際和平婦幼保健院自然妊娠并成功分娩的自發(fā)性早產(chǎn)孕婦的DNA進行基因分型,結合其產(chǎn)前肝功能檢測指標數(shù)據(jù),在早產(chǎn)孕婦人群中確認與肝功能檢測指標相關的基因,此外,為進一步探索早產(chǎn)的相關機制提供研究基礎。

材料與方法

1.一般資料：本研究獲得上海國際和平婦幼保健院醫(yī)學倫理學委員會審批通過[倫理學審批號：國科倫委(GKLW)2019-50]。所有入組患者或家屬均知情同意,研究者管理遵循國際和國內的相關法律法規(guī)。本研究一共納入了2018年8月～2020年9月在上海國際和平婦幼保健院進行分娩的自發(fā)性早產(chǎn)孕婦樣本344例,并獲取產(chǎn)前BMI、產(chǎn)前肝功能檢測數(shù)據(jù)、分娩年齡、孕婦疾病等臨床信息。所有入組病例產(chǎn)檢時保留的血樣,經(jīng)過離心后保留血細胞沉淀,于-80℃保存?zhèn)溆?。使用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Mini試劑盒提取血細胞沉淀DNA,利用中國生捷科技(杭州)有限公司生產(chǎn)的YZ01基因芯片對進行SNP分型實驗,共獲取1017032 個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點分型信息。

2.自發(fā)性早產(chǎn)孕婦的納入標準：①單胎自然妊娠;②活胎分娩;③胎齡<37周;④臨產(chǎn)啟動分娩;⑤排除醫(yī)源性早產(chǎn)(任何威脅母嬰健康的因素導致的早產(chǎn),包括妊娠糖尿病、胎窘、妊娠高血壓、子癇、肝臟疾病等)。

3.數(shù)據(jù)分析：針對344個樣本的分型數(shù)據(jù)后,使用PLINK軟件(version 1.90 b6.21)對獲取的分型數(shù)據(jù)進行初步質控。樣本的分型結果需要滿足以下標準：個體分型率>95%,近郊系數(shù)在均數(shù)±3標準差范圍內,刪除親緣關系較近樣本,通過主成分分析(principal component analysis,PCA)去除偏離整體目標群體的樣本。SNP 分型結果過濾標準需滿足：SNP位點分型率>95%,保留下348602 SNPs使用shapeit4、Minimac4分別進行單倍型分析、基因型填充 (參考單倍型為千人基因組 Phase 3 東亞人群)。再次使用PLINK軟件對基因型填充后數(shù)據(jù)進行SNP位點的質控,質控標準為：SNP分型率>95%、最小等位基因頻率 (minor allele frequency,MAF)>0.01,哈溫平衡檢驗P>1.00×10-5。利用PLINK軟件進行分別以TB、AST、ALP、GGT 為連續(xù)變量,以分娩年齡、生化檢測孕周、PCA前5個主成分為協(xié)變量進行校正,做全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association analysis,GWAS)。在全基因分析中P=5.00×10-8設定為全基因組顯著水平,P=1.00×10-5設定為具有潛在相關水平。使用 Rstudio軟件中R包qqman 包繪制曼哈頓圖和膨脹因子計算,利用在線網(wǎng)頁 Locus Zoom繪制顯著SNP 附近的局部關聯(lián)圖。在 ClinVar數(shù)據(jù)庫中查詢易感 SNP對應的臨床信息。為估算 SNP 的調控能力,參考 RegulomeDB數(shù)據(jù)庫對 SNP 進行功能基因組學打分。利用MAGMA軟件 (version 1.09b) 將單個SNP位點與表型關聯(lián)P值富集到基因水平,進行全基因組關聯(lián)分析,對PLINK分析結果進行驗證確認,以P<0.05為基因與表型存在顯著關聯(lián)。該軟件可以克服單個SNP位點與表型關聯(lián)微弱,不易通過PLINK 軟件的分析識別出與表型的關聯(lián)的不足,對PLINK的結果進行再次驗證。

結 果

1.研究人群和芯片數(shù)據(jù)：通過對上海國際和平婦幼保健院產(chǎn)婦臨床信息的篩查,以及SNP分型數(shù)據(jù)質控,最終共獲取336例自發(fā)性早產(chǎn)孕婦在產(chǎn)前的肝功能檢測指標數(shù)據(jù)和基因分型數(shù)據(jù)。質控后,共獲得 4805010 個SNP 位點分型數(shù)據(jù)。

2.PLINK全基因關聯(lián)分析篩選差異位點：以肝功能檢測指標作為連續(xù)變量,使用 PLINK軟件,以分娩年齡、取樣孕周、PCA前5個主要成分為協(xié)變量,利用一般線性模型進行GWAS分析。觀察到分別有88個、2個、102個、15個SNP與 TB、ALP、GGT、AST達到全基因組顯著相關 (P<5.00×10-8)。曼哈頓圖顯示,經(jīng)協(xié)變量矯正后的GWAS分析,發(fā)現(xiàn)在不同染色體上存在與TB、ALP、GGT、AST顯著相關的SNP位點(圖1)。在本研究中,關于肝功能檢測指標GWAS分析的膨脹系數(shù) (λTB=0.991,λALP=0.973,λGGT= 0.977,λAST=0.998) 均接近于1,證明研究人群不存在明顯的群體分層。具有全基因組顯著性的SNP附近位點的連鎖不平衡情況(圖2)。

圖1 自發(fā)性早產(chǎn)人群肝功能檢測指標的曼哈頓圖A.TB-GWAS;B.ALP-GWAS;C.GGT-GWAS;D.AST-GWAS

圖2 自發(fā)性早產(chǎn)孕婦肝功能檢測指標關聯(lián)區(qū)段局部圖A.TB-rs13002774;B.TB-rs2648892;C.ALP-rs1928935;D.GGT-rs184339019;E.AST-rs76293449;F.AST-rs1949002;紫色菱形為最顯著 SNP 位點,深藍色圓點為顯著SNP附近 SNP,下方為注釋基因,箭頭表示轉錄方向

3.顯著相關SNP位點功能分析：利用VarNote 數(shù)據(jù)庫對所有達到全基因組顯著相關 (P<5.00×10-8) 的 SNP進行注釋,并在ClinVar 中查詢對應SNP的臨床信息(表1)。共有3個與TB水平相關SNP 存在臨床意義,分別與吉爾伯特綜合征、血清膽紅素、藥物反應相關。使用 RegulomeDB對所有顯著SNP的調控能力進行打分(表2),UGT1A基因簇與 TB,PTPRK、LAMA2與GGT、AST之間的關系。

表1 自發(fā)性早產(chǎn)孕婦肝功能指標相關位點臨床意義

表2 PLINK 與MAGMA肝功能檢測指標GWAS分析結果比較

4.MAGMA全基因組關聯(lián)分析：使用MAGMA 軟件,基于PLINK分析獲得單個SNP 與肝功能檢測指標的關聯(lián)P,將P富集到基因水平,在基因水平上分析與肝功能檢測指標相關的基因。與PLINK分析獲得結果進行比較發(fā)現(xiàn),UGT1A1基因簇與TB、MROH2A與TB、PKHD1與GGT、SMAD6與AST、LAMA2與AST、ZNF與AST的相關性得到了驗證。其他不一致的位點主要是PLINK 分析中識別出的位于基因間的SNP位點(表2)。

5.與自發(fā)性早產(chǎn)和肝功能檢測指標同時相關的基因：針對MAGMA分析獲得的與肝功能檢測指標相關的基因,與目前已發(fā)表的與早產(chǎn)相關的基因進行篩選比較。發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性早產(chǎn)樣本中,肝功能指標相關的基因(P<0.05),同時與早產(chǎn)具有顯著相關性。在與早產(chǎn)相關的基因中,TNR、IL10、HTR3A、B3GNTL1、RAB31與TB依然相關,RALB、PMP22、STAT5B、B3GNTL1、TEKT3與ALP依然相關,LOC283710與GGT依然相關,MKNK1、MAML3、VAV2、HTR3A與AST依然相關。

討 論

本研究使用PLINK 和MAGMA兩款軟件對基因型填充后的SNP分型數(shù)據(jù)做全基因組關聯(lián)分析。結果發(fā)現(xiàn),UGT1A1基因簇與血清膽紅素TB依然顯著相關,這與已有的韓國、西班牙、中國、美國研究結果一致[7,8,10,15,16]。UGT1A基因簇在膽紅素代謝中起到重要作用,血液中膽紅素水平升高,會導致吉爾伯特綜合征[17]。但是,并未在本研究人群中發(fā)現(xiàn),SLCO1B1基因座與血清中的高水平膽紅素相關,盡管其在歐美和歐洲人群中存在相關性[9,10]。使用MAGMA軟件的分析結果中,在早產(chǎn)孕婦樣本中驗證了基因DNAJB3與TB的相關,與韓國、中國人群的GWAS分析結果一致[7,8]。DNAJB3的表達降低與2型糖尿病有關,膽紅素濃度升高與2型糖尿病也有密切聯(lián)系[18,19]。另外,通過本研究,在中國人群中發(fā)現(xiàn)基因ATG16L1、MROH2A與TB的相關,這2個基因分別在韓國、西班牙、美國人群的研究中發(fā)現(xiàn)與TB濃度呈現(xiàn)相關[8,10,15]。

另外,本研究驗證了基因ABO與ALP的相關性?；駻BO負責編碼糖基轉移酶,催化 ABO 血型抗原結構的形成,因此推測不同血型同工酶變化可能與ALP 水平有關[7]。

本研究在中國人群中發(fā)現(xiàn)了與GGT相關的基因PKD1、EDAR。EDAR基因編碼腫瘤壞死因子受體家族的一個成員。EDA是一種肝因子,主要表達于肝臟,分泌進入循環(huán)系統(tǒng),參與能量和糖脂代謝[21]。EDA通過剪接變體EDA- a1結合EDA受體(EDAR),導致細胞內EDAR相關死亡結構域 (EDARADD) 適配器蛋白的招募和NF-κB信號通路的激活,肝組織分泌的EDA與非酒精性脂肪肝有關[22]。通過MAGMA軟件的分析,首次發(fā)現(xiàn)基因ATP8B1、MICAL3 與GGT的相關,該結果與之前在歐美人群中的報道的一致[20]。ATP8B1參與膽汁轉運,編碼在膽汁形成和流動中起關鍵作用的膽管轉運蛋白,其突變與進行性家族性肝內膽汁淤積有關,并與高GGT濃度相關。

通過PLINK和MAGMA兩款軟件的數(shù)據(jù)分析,在世界范圍內發(fā)現(xiàn)基因SMAD6、LAMA2、ZNF883基因與AST的相關,但相關機制尚未有相關報道,有待于進一步探索。通過MAGMA軟件分析,筆者發(fā)現(xiàn)了大量未被報道的,與肝功能檢測指標相關的基因,同時與早產(chǎn)相關,例如與TB相關的TNR、IL10、HTR3A、B3GNTL1、RAB31,與ALP相關的RALB、STAT5B、B3GNTL1、PMP22、TEKT3;與GGT相關的LOC283710,與AST相關的MKNK1、MAML3、VAV2、HTR3A[23]。

綜上所述,本研究在中國344例早產(chǎn)孕婦樣本人群中,同時使用PLINK和MAGMA兩款全基因組關聯(lián)分析軟件,對于肝功能檢測指標開展全基因組關聯(lián)分析。一方面,驗證了在中國人群中,與肝功能檢測指標關聯(lián)的基因,為進一步研究不同人群肝功能檢測指標人群特異性提供了基礎;另一方面,篩選出部分與早產(chǎn)和肝功能檢測指標均相關的基因,為進一步研究早產(chǎn)機制提供關鍵信息。