張恩廳 布力布麗·巴哈提 朱洪濤

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是兒童時期較為常見的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病,同時也是一種以IgA免疫復(fù)合物沉積為主的一類系統(tǒng)性血管炎,多發(fā)生于學(xué)齡期兒童,其中超過90%的病例發(fā)生在10歲以下,平均發(fā)病年齡為6歲,臨床上主要以非血小板減少性的紫癜、腎損傷、皮膚及胃腸道受累等為主要表現(xiàn),預(yù)后一般尚可,但如果未得到及時診斷與治療,隨著疾病的進展可引起腎臟損害,出現(xiàn)血尿、蛋白尿等表現(xiàn),稱為紫癜性腎炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis,HSPN),嚴(yán)重患者可逐步進展為腎功能不全,是HSP最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,對機體健康造成巨大危害[1～3]。就目前的相關(guān)研究來說,該疾病的具體發(fā)病機制尚未十分明確,可能與感染、免疫紊亂、細(xì)胞因子分泌異常及基因多態(tài)性等方面相關(guān)[4]。研究表明,腸道微生物菌群的改變與失調(diào)也同樣在HSP的發(fā)病中占據(jù)了重要地位。Zhang 等[5]研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群中的Escherichia-Shigella屬對于HSP的復(fù)發(fā)具有重要的診斷價值,同時也發(fā)現(xiàn)鏈球菌和產(chǎn)丁酸細(xì)菌與HSP患兒消化道癥狀的出現(xiàn)相關(guān)。

SOCS-3是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一類對體內(nèi)多種細(xì)胞因子具有抑制作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,主要通過影響Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions,JAK/STAT)信號通路發(fā)揮相應(yīng)作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn),SOCS-3參與了多種腎臟疾病的發(fā)生。胡艷萍等[7]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)IgA腎病組外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中,SOCS-3的蛋白及mRNA表達量明顯高于正常對照組,SOCS-3在腎小管和腎小球中的表達量與腎臟組織的病理損害呈負(fù)相關(guān),推測SOCS-3可能對 IgAN腎損傷起保護作用。同時既往研究發(fā)現(xiàn),SOCS-3在一定程度上與HSP的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián),其內(nèi)在機制主要可能是通過影響JAK/STAT信號通路,進而影響機體免疫應(yīng)答及部分炎性介質(zhì)的釋放,從而產(chǎn)生一系列臨床表現(xiàn)[8]。但目前國內(nèi)外關(guān)于SOCS-3與HSP及HSPN的相關(guān)研究報道還相對較少,本課題通過研究SOCS-3在HSP及HSPN患兒外周血中的表達特點,探討其表達在HSP及HSPN發(fā)病中的相關(guān)作用及其意義,為今后的臨床工作提供新的思路。

資料與方法

1.研究對象：選取自2020年1月～2021年12月首次就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科中心的無腎臟損害的HSP患兒為HSP組,其中男性16例,女性9例。收集同期近6個月內(nèi)初次就診于筆者醫(yī)院被確診為HSP并出現(xiàn)腎臟損害,且未接受過相關(guān)治療的兒童25例作為HSPN組,其中男性12例,女性13例。另外選取同時期在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童保健科健康體檢的兒童共25例作為對照組,其中男性16例,女性9例。對于所有納入到研究中的HSP組兒童需符合2010年歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟和兒童風(fēng)濕病國際研究組織和兒童風(fēng)濕病聯(lián)盟共同制定的HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)。HSPN組兒童需符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟病學(xué)組2016年所指定的紫癜性腎炎診治循證指南中制定的紫癜性腎炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9,10]。上述兩組受檢兒童在研究前4周內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素、肝素及免疫抑制劑等藥物,同時排除年齡>14歲、患有原發(fā)性腎小球疾病、風(fēng)濕免疫性疾病及繼發(fā)性腎臟疾病、嚴(yán)重感染、過敏性疾病、腫瘤性疾病、免疫缺陷性疾病的兒童。所納入的對照組兒童在醫(yī)院兒童保健科健康體檢的兒童,且血、尿、便常規(guī)及生化、凝血等檢查未見明顯異常者,同時排除符合HSP及HSPN組兒童排除標(biāo)準(zhǔn)和不愿意參與研究及臨床資料缺失的兒童。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號：XJBKZR20190814),研究前均取得受試對象家屬知情同意并簽署相關(guān)知情文件。

2.標(biāo)本的采集：于入院后次日清晨空腹抽取3組兒童外周血置于肝素鈉抗凝管及非肝素鈉抗凝管中,每管抽血量5ml。

3.實驗標(biāo)本的處理：采用密度梯度離心法將肝素鈉抗凝管標(biāo)本分離出PBMC置于-20℃冰箱保存以備檢測SOCS-3mRNA水平,同時將非肝素鈉抗凝管標(biāo)本離心取出血清,保存于-20℃冰箱以備后期測定SOCS-3含量。

4.SOCS-3mRNA表達水平的檢測：(1)mRNA提取和cDNA的合成：DEPC處理水、50×TAE緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司;SYBR Green PCR試劑盒、mRNA熒光定量檢測試劑盒等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄酶購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;具體實驗步驟：根據(jù) TRIzol 試劑盒說明書的步驟提取總RNA,然后參照PCR試劑盒的方法將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系為20μl,在0.2ml的EP管里進行。(2)SOCS-3表達量的測定：用SYBR Green PCR試劑盒檢測,反應(yīng)體系為50μl。以β-actin作為內(nèi)參照,目的基因和內(nèi)參基因的引物序列詳見表1,SOCS-3、β-actin的引物設(shè)計和合成由北京擎科生物科技有限公司完成。其中 SYBR Green 25μl,cDNA 2μl,上下游引物各0.5μl,加雙蒸水至50μl。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5s變性,60℃ 30min退火,共40個循環(huán)。使用2-ΔΔct方法分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

結(jié) 果

1.HSP、HSPN組及對照組3組兒童在年齡性別等的一般資料分析：研究共收集25例對照組兒童,男性16例,女性9例,平均年齡為9.62±2.55歲;HSP組共25例,男性16例,女性9例,患兒平均年齡為8.20±2.57歲;HSPN組兒童25例,其中男性12例,女性13例,患兒平均年齡為9.66±2.67歲。3組兒童年齡、性別比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3組兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量的比較：對照組SOCS-3mRNA相對表達量為1.00(0.04,1.02);HSP組SOCS-3mRNA相對表達量為1.06(0.64,1.58);HSPN組SOCS-3mRNA相對表達量為1.47(1.08,2.98),且HSPN組SOCS-3mRNA相對表達量高于HSP組及對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對3組兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量進行兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中HSPN組兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量較其余兩組升高更顯著(圖1)。

圖1 3組兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量的箱式圖

3.HSPN組中各分型兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量的分布特點：所收集的25例紫癜性腎炎兒童分別為8例為單純型HSP進展、11例為腹型紫癜進展、2例為關(guān)節(jié)型紫癜進展、4例為混合型紫癜進展。通過對HSPN組中各分型兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量的比較得出,HSPN組中各分型兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步通過各臨床分型中的組間比較發(fā)現(xiàn)腹型紫癜兒童較其余幾個類型外周血SOCS-3mRNA有著較高的表達量,說明腹型紫癜的兒童可能更易發(fā)生腎臟損害(表2)。

表2 HSPN組中各分型兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量的分布特點[M(Q1,Q3)]

4.50例HSP兒童各分型中外周血SOCS-3mRNA相對表達量的分布特點：各臨床分型之間外周血SOCS-3mRNA相對表達量分布特點比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=9.17,P<0.05)。同樣,進一步通過各臨床分型中的組間比較發(fā)現(xiàn)腹型紫癜兒童較其余幾個類型外周血SOCS-3mRNA有著較高的表達量,說明腹型紫癜的兒童可能更易發(fā)生腎臟損害(表3)。

表3 50例HSP兒童各分型中外周血SOCS-3mRNA相對表達量的分布特點[M(Q1,Q3)]

討 論

HSP又稱亨-舒綜合征,是臨床中兒童時期最常見的血管炎之一,是一種以小血管炎為主要病理改變的全身綜合征,臨床主要表現(xiàn)為非血小板減少性可觸性皮膚紫癜、伴或不伴腹痛、胃腸道出血、關(guān)節(jié)痛等癥狀,多呈良性自限性過程[11]。HSP患兒的預(yù)后主要取決于該病腎臟受累的程度,研究報道約1/3HSP患兒存在腎臟受累,該表現(xiàn)可發(fā)生于HSP的任何時期,但大多數(shù)于紫癜后1個月內(nèi)出現(xiàn),也可以出現(xiàn)于皮疹消退后或靜止期[9]。同時,也有研究提到大約20%以上的兒童可在紫癜性腎炎診斷20年內(nèi)進展為終末期腎病[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)皮膚紫癜、消化道出血、呼吸道病原體感染、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值≥6.11是HSP發(fā)生腎臟損害的危險因素,會明顯增加腎臟損害發(fā)生的概率[12,13]。但由于HSP是一種系統(tǒng)性血管炎癥,參與發(fā)病的因素眾多,目前發(fā)病機制尚不十分明確,病因可能涉及免疫紊亂、遺傳等多個方面,大多數(shù)研究 IgA1的異常糖基化、T淋巴細(xì)胞功能的改變以及細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的改變在HSP的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[14]。

SOCS-3是SOCS蛋白家族中研究較為深入的成員之一,可以通過JAK/STAT信號通路發(fā)揮作用。SOCS-3是JAK2/STAT3信號通路的下游蛋白,可以負(fù)反饋調(diào)控STAT3通路的活化,在正常機體中SOCS-3的表達量很低或者不表達,當(dāng)受到外界或自身炎癥損傷等刺激時可出現(xiàn)過度表達現(xiàn)象[15,16]。SOCS3表達于Th2細(xì)胞,能夠促進Th2細(xì)胞分化,抑制Th1細(xì)胞分化,增強Th2型免疫反應(yīng)。CD4+的T淋巴細(xì)胞是機體參與免疫應(yīng)答的重要成分,它能夠在某些因素的刺激下分化成為Th1、Th2、Th17、Treg等不同的亞群,進一步參與HSP病程中毛細(xì)血管的相關(guān)炎性反應(yīng),近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),HSP組患兒外周血中Th1的含量低于對照組Th2的含量高于對照組,這就說明Th1/Th2平衡向Th2的偏移與HSP的發(fā)生密切相關(guān)[17～19]。常紅等[20]研究發(fā)現(xiàn),在HSP中同時存在著Th17細(xì)胞的過度活化,這種現(xiàn)象在急性期的HSP患兒中表現(xiàn)尤為顯著,進一步通過實驗發(fā)現(xiàn)其可能是通過IL-6/STAT3信號異?；罨斐傻?推測SOCS-3提示 HSP急性期患兒可能存在 SOCS1 和 SOCS3 表達的相對不足。楊潔等[21]研究發(fā)現(xiàn),孟魯司特作為特異性白三烯受體抑制劑可以有效調(diào)控T淋巴細(xì)胞亞群,用于HSP的臨床治療,進而緩解機體的炎性反應(yīng),降低血清中SOCS-3的水平,改善血管通透性。

Toll樣受體4(Toll-like recepter 4,TLR4)作為最早在人免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的參與脂多糖誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的Toll樣受體能夠誘導(dǎo)炎性因子和細(xì)胞因子相關(guān)基因表達,參與感染性疾病、過敏性疾病等的發(fā)病。黃可等[22]研究發(fā)現(xiàn),在HSP患兒中有著TLR4的高表達,其機制可能是TLR4可以通過MyD88依賴途徑引起T細(xì)胞功能紊亂和多種促炎性因子失調(diào),進而誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞分化及IL6、Th17等大量炎性細(xì)胞因子的釋放。

研究發(fā)現(xiàn),在IgA腎病中同樣存在著SOCS-3的表達增強,但與HSP及紫癜性腎炎不同的是SOCS-3的表達在IgA腎病中起著一定的保護作用,如胡艷萍[7]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)SOCS-3水平可以降低IgA的濃度,并可以通過TLR4的負(fù)調(diào)節(jié)作用抑制過強的炎性反應(yīng),抑制腎臟系膜細(xì)胞及基質(zhì)的增生,從而達到對腎臟的保護作用。王鳳英等[23]研究發(fā)現(xiàn),SOCS-3的表達量在HSP患兒中明顯升高,并且混合型HSP較單純型HSP患兒的表達量增高更明顯,SOCS-3表達越高的患兒越易合并皮膚外的臟器受累,提示SOCS-3表達越高者炎性反應(yīng)越重,說明SOCS-3可能參與了兒童HSP的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn),在HSP組、HSPN組及對照組3組兒童外周血SOCS-3mRNA相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,同時發(fā)現(xiàn)HSPN組SOCS-3mRNA相對表達量高于HSP組及對照組,說明SOCS-3可能參與了HSP的發(fā)病過程,并且可能進一步導(dǎo)致了紫癜性腎炎的發(fā)生,這一點與王鳳英等[23]的研究結(jié)果相一致。

本研究發(fā)現(xiàn),HSP各分型中外周血SOCS-3mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明HSP單純型、腹型、關(guān)節(jié)型及混合型及腎型幾個分型中的外周血SOCS-3mRNA相對表達量并無明顯差異,這一點與王鳳英等[23]的研究結(jié)果不同,造成這一結(jié)果的原因可能與本研究所納入的試驗對象樣本量不足所致有關(guān),同時也不除外與實驗室誤差有關(guān),后期可以通過增加更多的樣本量去進行深入研究。

綜上所述,HSP及紫癜性腎炎患兒中的SOCS-3表達量相對升高,并且在多種免疫相關(guān)性疾病或腎臟相關(guān)疾病中都有一定表達,后期可進一步深入探討SOCS-3在HSP及HSPN發(fā)病過程中的分子機制及其相關(guān)影響因素,也可通過動物實驗或臨床研究進一步探討SOCS-3在HSP及HSPN中各臨床表型或病理分型中的表達特點,為臨床中HSP及HSPN發(fā)病特點及機制提供新的研究方向。