羅婧媛 綜述,陳 姝 審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科,重慶 400010

血管性血友病(VWD)是人類最常見的常染色體遺傳性出血性疾病,由血管性血友病因子(VWF)基因突變導(dǎo)致VWF量(1型和3型VWD)或質(zhì)(2型VWD)的缺陷引起,以皮膚黏膜出血和創(chuàng)傷或侵入性手術(shù)后的過度出血為主要臨床表現(xiàn),嚴(yán)重者可發(fā)生胃腸道或關(guān)節(jié)肌肉出血。VWD復(fù)雜的分子病理機(jī)制使其診斷和治療一直是臨床上的難題。近年來的研究增強(qiáng)了對VWD發(fā)病機(jī)制的理解,同時(shí)開發(fā)出了新的診斷方法和治療手段。本文對 VWD 的分子基礎(chǔ)、診斷分型和治療的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展綜述如下。

1 VWF的生物學(xué)特點(diǎn)

1.1VWF的生物合成和分子結(jié)構(gòu) VWF是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓巨核細(xì)胞合成的一種多聚體糖蛋白,對血小板黏附于暴露的內(nèi)皮下膠原、血小板聚集和凝血因子Ⅷ(FⅧ)的穩(wěn)定至關(guān)重要,在生理性止血和血栓形成過程中起著重要作用[1]。VWF基因位于12號染色體,由52個(gè)外顯子和51個(gè)內(nèi)含子組成,編碼含2 813 個(gè)氨基酸殘基(aa)的前體蛋白,包括22個(gè)aa的信號肽(SP),741個(gè)aa的前肽(VWFpp)和2 050個(gè)aa的成熟亞單位,結(jié)構(gòu)域組成為D1-D2-D′-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK[2],功能結(jié)構(gòu)域包括血小板糖蛋白Ⅰb(GPⅠb)結(jié)合位點(diǎn)(A1結(jié)構(gòu)域)、蛋白裂解位點(diǎn)(A2結(jié)構(gòu)域)、膠原結(jié)合位點(diǎn)(A1和A3結(jié)構(gòu)域)、FⅧ結(jié)合位點(diǎn)(D′和D3結(jié)構(gòu)域)及血小板糖蛋白ⅡbⅢa(GPⅡb/Ⅲa)結(jié)合位點(diǎn)(C4結(jié)構(gòu)域),見圖1。

注:Exon為外顯子。圖1 VWF前體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及編碼基因

VWF前體蛋白在核糖體中翻譯完成,去除信號肽后轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng),CK結(jié)構(gòu)域之間通過二硫鍵(S-S)連接形成VWF二聚體,后者轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體,D3結(jié)構(gòu)域之間通過S-S連接形成VWF多聚體。VWFpp和D′結(jié)構(gòu)域使二聚體正確對齊,同時(shí)VWFpp通過其CGLC序列的蛋白二硫化物異構(gòu)酶活性催化D3結(jié)構(gòu)域之間的S-S形成[3],這對于多聚化至關(guān)重要。多聚體生成后,VWFpp被furin蛋白酶裂解,但仍與D′D3結(jié)構(gòu)域保持高親和力的非共價(jià)結(jié)合[4]。

1.2VWF的儲(chǔ)存、分泌和代謝 新生的VWF多聚體先被運(yùn)輸至內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade小體(WPBs)和巨核細(xì)胞/血小板的α-顆粒中儲(chǔ)存,后續(xù)通過基礎(chǔ)型、調(diào)節(jié)型和組成型3種分泌方式釋放入血[5-6]。多聚化程度越高的VWF具有越強(qiáng)的促血小板黏附和促血栓形成能力,金屬蛋白酶ADAMTSL3通過裂解高分子量的VWF多聚物(VWF-HMWMs)重塑了VWF多聚體的大小分布,從而防止VWF-HMWMs誘導(dǎo)的血小板過度聚集和血栓形成[7]。VWF主要被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞清除,半衰期為8～12 h,健康人血漿VWF水平在50～200 IU/dL波動(dòng)[8]。VWFpp與成熟VWF等比例地分泌入血,但其清除獨(dú)立于VWF,半衰期為2～3 h,水平約為100 IU/dL[4]。VWFpp與VWF在體內(nèi)等比例分泌而代謝途徑不同,因此VWFpp/VWF抗原(VWF:Ag)可以反映體內(nèi)VWF的清除情況,健康人VWFpp/VWF:Ag<3.0[9],VWFpp/VWF:Ag增加提示VWF清除增強(qiáng)。

2 VWD 的分型及分子機(jī)制

VWD可分為3種類型:1型為VWF量的部分缺失,2型為VWF 質(zhì)的缺陷伴或不伴量的缺乏,3型為VWF量的完全缺失。

2.11型VWD 1型VWD為常染色體顯性遺傳,以VWF數(shù)量輕度或中度減少,但VWF功能及多聚體分布基本正常為特征,發(fā)病率最高,約占所有患者的75%。人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)中記錄了超過250種不同的1型VWD基因突變,大多數(shù)發(fā)生在28號外顯子,約80%為錯(cuò)義突變,其余為小缺失/插入、剪切突變、無義突變、啟動(dòng)子突變、基因轉(zhuǎn)換等,所占比例均<10%。分子致病機(jī)制包括以下3種:(1) VWF合成減少。低VWF產(chǎn)量一般與雜合性無效等位基因相關(guān)。無義突變、剪切突變、缺失和插入等均可產(chǎn)生無效等位基因,不能合成有功能的蛋白質(zhì)[10],VWF生成僅來自非突變的等位基因,導(dǎo)致VWF產(chǎn)量下降50%,如p.Arg1659X和p.Arg1853X;啟動(dòng)子突變破壞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,VWF基因轉(zhuǎn)錄衰減,蛋白生成減少。(2)VWF分泌受損。部分突變改變VWF前體蛋白結(jié)構(gòu),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制系統(tǒng)阻止缺陷蛋白向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn),VWF滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中或在細(xì)胞內(nèi)被降解[10]。所有破壞鏈內(nèi)S-S的特異性半胱氨酸突變都可能改變VWF構(gòu)象而導(dǎo)致這種細(xì)胞內(nèi)滯留[11],如p.Cys1060Tyr、p.Cys1130Phe、p.Cys1149Arg、p.Tyr1584Cys、p.Cys2257Ser和p.Cys2671Tyr。p.Tyr1584Cys是最常見的1型VWD突變,位于A2結(jié)構(gòu)域,可在約15%的VWD患者中檢測到雜合子,此類患者平均VWF:Ag為40 IU/dL,血型多為O型。p.Tyr1584Cys不僅導(dǎo)致VWF內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留,還會(huì)使VWF對ADAMTS13的敏感性增加[12]。部分突變干擾WPBs形成而使VWF基礎(chǔ)型和調(diào)節(jié)型分泌減少[13-14],如p.Cys2190Tyr和p.Ala1716Pro。(3)VWF清除增強(qiáng)。在>40%的1型VWD患者中觀察到病理學(xué)增加的VWF清除率,將這種VWF清除增強(qiáng)所導(dǎo)致的1型VWD稱為1C型。此類突變主要位于D3結(jié)構(gòu)域,如p.Arg1205His/Cys/Ser,p.Cys1130Phe/Gly/Arg,p.Trp1144Gly和p.Cys1149Arg,這提示D3結(jié)構(gòu)域可能包含VWF存活和清除的調(diào)控或識別位點(diǎn)。此外,位于D4結(jié)構(gòu)域的p.Ser2179Phe和位于C6結(jié)構(gòu)域的p.Cys2671Tyr也與VWF 清除增加有關(guān)[10]。VWD Vicenza(p.Arg1205His 雜合突變)是1C型VWD的經(jīng)典類型,VWF:Ag通常為10～15 IU/dL,VWFpp/VWF:Ag顯著升高(通常>10)并伴有VWF-HMWMs的輕微增加。研究表明p.Arg1205His通過增強(qiáng)VWF與肝脾巨噬細(xì)胞受體的結(jié)合提高清除率,因此有專家推薦將VWD Vicenza歸類為2型VWD(而不是1型),以強(qiáng)調(diào)與清除受體更強(qiáng)的相互作用是一種新的VWF功能缺陷[15]。

2.22型VWD 2型VWD以VWF功能異常為特征,占所有VWD患者的20%～30%,基于VWF與血小板GPⅠb的結(jié)合異常進(jìn)一步分為2A、2B和2M型,與FⅧ的結(jié)合缺陷分為2N型。大多數(shù)2型VWD為顯性遺傳,但2N型和部分2A型為隱性遺傳。

2.2.12A型VWD VWF依賴的血小板黏附功能主要由VWF-HMWMs介導(dǎo)。2A型VWD的發(fā)病機(jī)制為VWF-HMWMs分泌減少或裂解增加,選擇性缺乏VWF-HMWMs導(dǎo)致的VWF-血小板結(jié)合活性下降。突變類型有錯(cuò)義、插入、缺失、移碼突變,大多數(shù)為錯(cuò)義突變且位于A2結(jié)構(gòu)域,集中在ADAMTS13酶解位點(diǎn)Tyr1605-Met1606周圍、Glu1504-Lys1672范圍內(nèi),導(dǎo)致2種不同的致病機(jī)制:(1)改變A2 區(qū)構(gòu)象使ADAMTS13切割位點(diǎn)(Tyr1605-Met1606)易于暴露,VWF對ADAMTS13的敏感性增加,VWF-HMWMs裂解增強(qiáng)[12],如p.Gly1505Glu、p.Met1528Val、p.Arg1597Trp,p.Val1607Asp、p.Gly1609Arg、p.Gly1629Glu、p.Gly1631Asp和p.Glu1638Lys;(2)損害VWF在細(xì)胞內(nèi)的合成和加工,蛋白缺陷而滯留于細(xì)胞內(nèi),VWF多聚體特別是VWF-HMWMs分泌減少[16],如p.Gly1505Arg、p.Ser1506Leu、p.Leu1540Pro、p.Val1607Asp。值得注意的是,p.Gly1505Glu與p.Gly1505Arg發(fā)生在同一個(gè)密碼子上,這說明A2結(jié)構(gòu)域中氨基酸替換的位置與2A型VWD的分子致病機(jī)制沒有關(guān)聯(lián)。此外,CK結(jié)構(gòu)域的突變可影響VWF二聚體化,如p.Cys2771Arg和p.Cys2773Arg;D3結(jié)構(gòu)域的突變可影響VWF多聚體化,如p.Cys1099Tyr、p.Cys1143Tyr和p.Cys1173Arg:上述突變均為半胱氨酸殘基被替換,導(dǎo)致二聚化或多聚化過程中所必需的分子間S-S生成障礙,VWF-HMWMs合成和分泌減少[17]。A1結(jié)構(gòu)域的突變也可使VWF多聚化受損,但機(jī)制尚不明確,同時(shí)常伴有VWF與血小板GPⅠb結(jié)合親和力的增強(qiáng)或降低,如p.Cys1272Arg/Gly、p.Val1314Phe、p.Arg1315Cys和p.Cys1458Tyr。A2、CK、D3和A1結(jié)構(gòu)域的突變均為顯性突變。D2結(jié)構(gòu)域的突變?yōu)殡[性突變,破壞VWFpp構(gòu)象而干擾VWF多聚體形成,如錯(cuò)義突變p.Asn528Ser、 p.Gly550Arg和p.Cys623Trp,插入突變p.Phe404_Thr405insAsnPro和 p.Asn624_Ala625insGly,以及缺失突變p.Cys709LeufsTer711。造成VWF生物合成缺陷、細(xì)胞內(nèi)滯留,多聚體不能正常分泌的2A型突變?yōu)镚roupⅠ突變;提高VWF-HMWMs對ADAMTS13的敏感性,使其裂解增加的突變?yōu)镚roup Ⅱ突變。GroupⅠ突變會(huì)導(dǎo)致比GroupⅡ突變更加嚴(yán)重的出血表現(xiàn),但Group Ⅰ突變的VWD患者對去氨加壓素(DDAVP)治療的反應(yīng)更好[12,18]。

2.2.22B型VWD 2B型VWD的發(fā)病機(jī)制為VWF-HMWMs與血小板GPⅠb的親和力增強(qiáng),在體內(nèi)自發(fā)性形成VWF-血小板復(fù)合物后被清除,因此2B型患者還常有不同程度的間歇性血小板減少,可因應(yīng)激而加重,特別是妊娠期間經(jīng)常發(fā)生嚴(yán)重的血小板減少,嬰兒往往有新生兒血小板減少癥[19]。VWF與血小板GPⅠb的結(jié)合位點(diǎn)位于A1結(jié)構(gòu)域。2B型突變?yōu)锳1內(nèi)的功能獲得性突變,穩(wěn)定A1的結(jié)合構(gòu)象使VWF與GPⅠb的結(jié)合能力增強(qiáng)。2B型突變大部分為錯(cuò)義突變,主要在Cys1272-Cys1458二硫環(huán)中,Arg1306、Arg1308、Arg1341為突變熱點(diǎn)[20],p.Arg1306Trp、p.Arg1308Cys、p.Arg1341Gln和p.Val1316Met 4種突變約占2B型突變的90%,其中p.Val1316Met會(huì)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的血小板減少和出血癥狀,增加孕期流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[14,21]。p.Arg1308Leu和p.Pro1266Gln/Leu為經(jīng)典的非典型2B型突變,不影響多聚體分布,也不會(huì)使血小板減少[20,22]。SACCO等[23]報(bào)告了第1例攜帶D′和D4結(jié)構(gòu)域突變的2B型VWD,并發(fā)現(xiàn)p.Arg924Gln/p.Ala2178Ser雙雜合突變引起VWF分子的構(gòu)象轉(zhuǎn)變而導(dǎo)致2B型VWD表型。

2.2.32M型VWD 2M型VWD的發(fā)病機(jī)制為VWF-HMWMs與血小板GPⅠb或膠原的親和力減弱,其多聚體分布基本正常。2M型突變?yōu)锳1區(qū)域內(nèi)的功能缺失性突變,損害VWF與GPⅠb的相互作用使VWF與GPⅠb的結(jié)合能力減弱。絕大多數(shù)為錯(cuò)義突變,如p.Ser1285Phe、p.Gly1324Ser/Ala、p.Glu1359Lys、p.Phe1369Ile和p.Ile1425Phe,其余部分為小的框內(nèi)缺失,如p.Lys1408delLys。部分位于A3結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)義突變直接降低VWF與膠原結(jié)合的親和力也導(dǎo)致2M型VWD[24],如p.Ser1731Thr、p.Leu1733Pro、p.Ser1738Ala、p.Trp1745Cys、p.Ser1783Ala、p.His1786Asp。2M型VWD一般對DDAVP治療反應(yīng)不佳,但A3結(jié)構(gòu)域突變的患者對DDAVP反應(yīng)良好[18,25]。

2.2.42N型VWD 2N型VWD較為少見,由VWF結(jié)合FⅧ的能力缺陷引起,為常染色體隱性遺傳,基因型可以是單一2N突變的純合子、2種不同2N突變的復(fù)合雜合子或一種2N突變和一種VWF無效突變的復(fù)合雜合子(同時(shí)伴有血漿VWF:Ag水平降低)。突變主要位于VWF-FⅧ結(jié)合位點(diǎn)D′和部分D3結(jié)構(gòu)域(Ser764-Argl035)內(nèi),一些結(jié)合區(qū)域附近的突變也可以阻礙VWF-FⅧ結(jié)合[20],如p.Gln1053His、p.Cys1060Arg。此外,實(shí)現(xiàn)VWF-FⅧ結(jié)合需要VWFpp從VWF成熟亞單位中裂解,furin酶作用位點(diǎn)在Arg763-Ser764,同時(shí)Arg760和Lys762確保furin酶對底物的恰當(dāng)識別,因此p.Arg760Cys、p.Arg763Gly等突變通過影響furin酶切而抑制VWF-FⅧ結(jié)合,導(dǎo)致2N型VWD[20,26]。超過90%的2N型突變?yōu)殄e(cuò)義突變,其中p.Arg816Trp和p.Arg854Gln最常見。FⅧ活性(FⅧ:C)水平與特定的突變相關(guān),例如,p.Arg816Trp突變導(dǎo)致FⅧ:C嚴(yán)重下降(<10 IU/dL),而p.Arg854Gln突變則導(dǎo)致FⅧ:C水平約為25 IU/dL[20]。大多數(shù)2N型VWD患者VWF多聚體分布正常,但部分突變會(huì)促使超大型多聚體生成[26],如p.Arg760Cys、p.Arg763Gly、p.Tyr795Cys、p.Gln1053His;部分突變會(huì)導(dǎo)致VWF-HMWMs減少[26],如p.Cys788Tyr、p.Cys804Phe、p.Cys1060Arg、p.Asp879Asn。

2.33型VWD 3型VWD以VWF完全缺乏為特征,發(fā)病率最低,在所有VWD患者中所占比例<1%,經(jīng)典遺傳模式為常染色體隱性遺傳,由純合或復(fù)合雜合突變導(dǎo)致VWF合成或分泌重度缺陷引起。然而據(jù)報(bào)道,40%～50%的3型VWD患者表現(xiàn)出共顯性遺傳,其家族中的雜合子攜帶者符合1型VWD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。HGMD數(shù)據(jù)庫中記錄了超過320種不同的3型VWD基因突變,無義突變最常見,錯(cuò)義突變次之,其余包括各種剪切突變、缺失/插入、基因轉(zhuǎn)換等,分子致病機(jī)制為VWF合成或分泌減少。(1)VWF合成減少。除錯(cuò)義突變外的絕大多數(shù)突變(約80%)均產(chǎn)生無效等位基因,且廣泛分布于各結(jié)構(gòu)域;而錯(cuò)義突變在D1～D2和CK結(jié)構(gòu)域顯示出聚集性,破壞VWFpp構(gòu)象使VWF多聚化受損或破壞VWF的二聚體化[12],如p.Gly39Arg、p.Asp141Tyr/Asn、p.Lys157Glu、p.Cys275Ser、p.Cys2574Trp、p.Cys2806Arg。(2)VWF分泌減少。部分位于D1～D2結(jié)構(gòu)域的突變阻止VWF從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)抑制WPBs生成,導(dǎo)致VWF內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留、儲(chǔ)存和分泌障礙[27],如p.Gly55Glu、p.Val86Glu、p.Trp191Arg和 p.Cys608Trp。

3 VWD的臨床診斷

VWD的診斷很復(fù)雜,需要出血個(gè)人史、出血或VWD的家族史及確認(rèn)性實(shí)驗(yàn)室檢測。對于疑似VWD的患者,首先推薦使用國際血栓與止血協(xié)會(huì)(ISTH)開發(fā)的出血評分工具(ISTH-BAT)進(jìn)行評估,分?jǐn)?shù)異常(男性≥4分,女性≥6分,兒童≥3分)則需完善VWD相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測。對于轉(zhuǎn)診到血液內(nèi)科和(或)一級親屬確診為VWD的男性和兒童,即使出血評分正常,也應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢查。VWD的診斷試驗(yàn)包括篩查、確診以及分型試驗(yàn)三大部分。篩查試驗(yàn)包括血小板計(jì)數(shù)(PLT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)及血漿纖維蛋白原(Fg)測定;確診試驗(yàn)包括VWF:Ag、VWF-血小板結(jié)合活性(VWF:Rco,VWF:GPⅠbM,VWF:GPⅠbR)和FⅧ:C測定;分型試驗(yàn)包括VWF多聚體分析、瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集(RIPA)試驗(yàn)、VWF-膠原結(jié)合活性(VWF:CB)、VWF-FⅧ結(jié)合活性(VWF:FⅧB)、VWFpp測定、DDAVP試驗(yàn)及VWF基因測序等。

VWF瑞斯托霉素輔因子測定(VWF:Rco)是歷年來檢測VWF活性的“金標(biāo)準(zhǔn)”,且根據(jù)VWF:RCo/VWF:Ag可以確定VWF-血小板結(jié)合活性缺陷是由于VWF的質(zhì)量異常還是數(shù)量異常。然而,VWF:Rco具有顯著的局限性。一方面,VWF:Rco變異系數(shù)高,易出現(xiàn)誤診或漏診;另一方面,VWF:Rco檢測下限為10～20 IU/dL,這使得在低VWF:Ag患者中準(zhǔn)確識別2型VWD存在困難[28]。此外,VWF:Rco使用瑞斯托霉素在體外橋接VWF與GPⅠb,所以有可能因?yàn)閂WF結(jié)合瑞斯托霉素的能力缺陷而出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果[28],VWF:Rco明顯下降,但實(shí)際體內(nèi)血小板依賴的VWF活性正常。近年來開發(fā)出了新的檢測方法:功能獲得性突變的GPⅠb 結(jié)合分析(VWF:GPⅠbM)和瑞斯托霉素誘導(dǎo)的 GPⅠb 結(jié)合分析(VWF:GPⅠbR)。VWF:GPⅠbM使用功能增益性突變的GPⅠb,使其在體外不需要瑞斯托霉素也可自發(fā)地結(jié)合VWF[29]。VWF:GPⅠbM同時(shí)還具有高精確度及低變異系數(shù)的優(yōu)勢[29],是指南推薦的血小板依賴的VWF活性檢測方法[30]。VWF:GPⅠbR使用重組GPⅠb片段而非血小板,受影響因素較少,檢測下限更低,但仍需使用瑞斯托霉素。

1型VWD患者血漿VWF水平在3～50 IU/dL,臨床表現(xiàn)為輕至中度的皮膚黏膜出血。對VWF:Ag為30～50 IU/dL伴異常出血的患者及無論出血情況如何,VWF:Ag<30 IU/dL的患者,均應(yīng)考慮1型VWD的診斷,當(dāng)VWF-血小板結(jié)合活性(如VWF:Rco,VWF:GPⅠbM,VWF:GPⅠbR)與VWF:Ag的比值>0.7時(shí),可診斷為1型VWD[30-31]。1C型VWD的特點(diǎn)是VWF半衰期明顯縮短至1～3 h(正常8～12 h),VWFpp/VWF:Ag增加至>3.0(正常<3.0)。DDAVP可使儲(chǔ)存在血管內(nèi)皮細(xì)胞WPBs中的VWF釋放,但對于1C型VWD患者,釋放的VWF會(huì)很快被清除,DDAVP輸注后4 h血漿VWF水平比1 h(峰值)降低超過30%[32]。ISTH優(yōu)先推薦將DDAVP試驗(yàn)作為1C型VWD的診斷依據(jù)[30]。

2型VWD的出血嚴(yán)重程度介于1型和3型之間,常表現(xiàn)為瘀斑、鼻出血、牙齦出血、小傷口持續(xù)出血、月經(jīng)過多及術(shù)后出血,其中2A型胃腸道出血多見。2N型主要是外傷后或與手術(shù)有關(guān)的出血,自發(fā)性出血通常不嚴(yán)重,女性月經(jīng)過多和產(chǎn)后出血常見。當(dāng)VWF-血小板結(jié)合活性(如VWF:Rco,VWF:GPⅠbM,VWF:GPⅠbR)與VWF:Ag的比值<0.7時(shí),應(yīng)考慮2A、2B或2M型VWD,其中2M型多聚體分布正常,2A和2B型同時(shí)伴有VWF-HMWMs缺失。RIPA用于進(jìn)一步區(qū)分2B型與2A型。2B型患者瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集率增強(qiáng),低水平的瑞斯托霉素(≤0.7 mg/mL)即可誘導(dǎo)血小板的聚集[33-34],但該試驗(yàn)靈敏度較低。2N型VWD患者血漿VWF:Ag 正?；蜉p度減少,未結(jié)合的FⅧ加速清除導(dǎo)致FⅧ:C減少至5～40 IU/dL,少數(shù)患者表現(xiàn)出更明顯的下降(1～5 IU/dL),但迄今從未低于1 IU/dL,其診斷標(biāo)志是VWF:Ag和FⅧ:C水平明顯不一致,FⅧ:C/VWF:Ag明顯降低。2N型VWD需要與輕型/中間型血友病A及其女性攜帶者鑒別,通過VWF:FⅧB或基因檢測來區(qū)分。

3型VWD患者血漿VWF水平通常<3 IU/dL,伴FⅧ:C<10 IU/dL,臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的皮膚黏膜出血和關(guān)節(jié)肌肉出血。

4 VWD的治療

4.1非替代治療

4.1.1DDAVP DDAVP可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌儲(chǔ)存在WPBs中的VWF,是VWD的有效治療方法。然而,VWF清除增強(qiáng)的患者在接受DDAVP治療后血漿VWF水平會(huì)迅速降至低水平,DDAVP療效不佳,特別是在嚴(yán)重出血時(shí)。為了充分確定DDAVP治療后個(gè)體VWF的藥代動(dòng)力學(xué)反應(yīng),建議進(jìn)行DDAVP試驗(yàn),即分別檢測VWF基線值以及給予DDAVP后1 h、4 h的VWF水平,若VWF增加3倍及以上并可維持則表示對DDAVP反應(yīng)良好。愛爾蘭的一項(xiàng)隊(duì)列研究表明,大多數(shù)VWF水平在30～50 IU/dL的患者在接受DDAVP治療后有很好的持續(xù)性VWF反應(yīng),這些患者在診斷時(shí)不需要進(jìn)行正式的DDAVP試驗(yàn),而是在首次臨床應(yīng)用DDAVP治療后可以簡單地確認(rèn)VWF反應(yīng)[29,35]。DDAVP可以皮下注射(0.3 μg/kg)、靜脈注射(0.3 μg/kg,溶解于100 mL正常生理鹽水中,20 min內(nèi)輸完)或以鼻腔噴霧的形式給藥(成年患者300 μg,兒童150 μg)。不良反應(yīng)包括面部潮紅、頭痛和低血壓,還可引起液體潴留、繼發(fā)性低鈉血癥和癲癇發(fā)作,建議患者在每次給藥后24 h內(nèi)限制總液體攝入量,高?；颊咝枰O(jiān)測血鈉濃度[28]。2歲以下的兒童以及患有心血管疾病的成人患者通常避免使用DDAVP。2B型VWD患者禁止使用DDAVP,因?yàn)獒尫诺腣WF可引起明顯的血小板減少而加重出血。

4.1.2抗纖維蛋白溶解藥物——氨甲環(huán)酸(TA) TA通過與纖溶酶原的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合來抑制纖維蛋白溶解,已被廣泛用于治療VWD,可用于治療所有類型患者的黏膜出血及大量的月經(jīng)出血。越來越多的證據(jù)強(qiáng)調(diào),即使在高危人群中(如創(chuàng)傷、產(chǎn)后出血、重大骨科手術(shù)),TA的使用似乎與顯著的血栓風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)[29]。TA可以口服(15～25 mg/kg,每天3次)、靜脈注射(15 mg/kg,每天3次)或作為漱口水使用。不良反應(yīng)包括惡心、嘔吐和腹痛。此外,上尿路有明顯血尿的患者一般避免使用TA,因?yàn)槠淇赡軙?huì)導(dǎo)致輸尿管血栓性絞痛和梗阻[36]。

4.1.3性激素 對于經(jīng)期大量出血的無生育需求的女性VWD患者,采用雌激素/孕激素聯(lián)合避孕藥或左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋節(jié)育系統(tǒng)能有效地減少經(jīng)期失血量[37]。

4.2替代治療

4.2.1血漿源性的VWF濃縮物(pd-VWF) pd-VWF在治療VWD的出血方面既安全又有效,對于有DDAVP禁忌證的患者,或給予DDAVP后VWF反應(yīng)不足以應(yīng)對特定出血事件或手術(shù)挑戰(zhàn)的患者,pd-VWF是治療首選。治療劑量取決于患者的內(nèi)源性VWF水平和出血的嚴(yán)重程度,劑量標(biāo)定以制劑的VWF活性為準(zhǔn),由于半衰期約為12 h,通常需要重復(fù)給藥。大多數(shù)pd-VWF同時(shí)含有FⅧ,加之患者體內(nèi)的內(nèi)源性FⅧ被輸注的VWF穩(wěn)定,因此反復(fù)使用pd-VWF可導(dǎo)致血漿FⅧ:C明顯升高。FⅧ:C升高已被證明是普通人群中靜脈血栓栓塞的一種劑量依賴性危險(xiǎn)因素,一些VWD患者在使用pd-VWF后的確出現(xiàn)了血栓并發(fā)癥,但目前FⅧ:C的升高在pd-VWF治療后VWD患者血栓形成病因中的重要性尚不清楚[29,36]。VWF大量缺失的患者在重復(fù)給予pd-VWF后抑制物形成風(fēng)險(xiǎn)較大,有5%～10%的3型VWD患者接受pd-VWF治療后出現(xiàn)了抗VWF中和抗體[38]。

4.2.2重組人VWF濃縮物(rVWF) 第一種rVWF已經(jīng)在許多國家開發(fā)并獲批用于治療成人VWD,其在生產(chǎn)過程中不暴露于ADAMTS13,因此富含VWF-HMWMs,對VWD患者的出血療效較好。此外,rVWF的耐受性強(qiáng),盡管富含VWF-HMWMs,但無發(fā)生血栓或微血管病變并發(fā)癥的證據(jù),這可能與體內(nèi)ADAMTS13介導(dǎo)的蛋白分解在rVWF輸液后迅速發(fā)生相關(guān)[39-40]。最重要的是,rVWF不會(huì)導(dǎo)致抑制物形成。需注意的是rVWF不含F(xiàn)Ⅷ,故對伴有FⅧ:C降低的VWD出血患者,在首次用藥時(shí)需同時(shí)補(bǔ)充重組FⅧ(rFⅧ),以確保立即達(dá)到止血FⅧ水平。不聯(lián)合應(yīng)用rFⅧ的情況下,單獨(dú)輸注rVWF仍可使血漿FⅧ:C正常化,這是由于rVWF穩(wěn)定了內(nèi)源性分泌的FⅧ。例如,在單獨(dú)給藥rVWF 6 h后3型VWD患者的FⅧ:C上升至>40 IU/dL,48 h后血漿FⅧ:C仍可維持在>70 IU/dL[41]。與pd-VWF相比,rVWF似乎能更有效地穩(wěn)定內(nèi)源性FⅧ,這可能與其更長的半衰期(約25.5 h)或更高的VWF-HMWMs水平有關(guān)。

4.2.3血小板源性的VWF 正常富血小板血漿中,VWF總量的15%～20%儲(chǔ)存在血小板α顆粒中,在血管損傷部位血小板激活后,以高水平局部分泌,發(fā)揮重要的止血作用。有研究表明,血小板源性的VWF不僅富含HMWMs,而且對ADAMTS13蛋白裂解具有部分抗性[29]。未來需要進(jìn)一步的研究來充分確定血小板源性的VWF的生物學(xué)重要性,特別是其在與VWD相關(guān)的可變出血表型中的作用。

5 結(jié) 語

近年來對VWD分子致病機(jī)制的認(rèn)識取得了重大進(jìn)展,這些新穎的見解改進(jìn)了VWD的診斷和治療策略。新的血小板依賴性VWF活性測定、DDAVP試驗(yàn)、VWF基因測序等手段提高了VWD診斷的準(zhǔn)確性,但國內(nèi)只有極少數(shù)醫(yī)院常規(guī)開展;rVWF的面世給VWD的治療帶來了突破,但暫未能被大范圍使用。因此,VWD的分型診斷和治療仍面臨困難與挑戰(zhàn),需要更多的工作來簡化診斷,優(yōu)化治療。