劉雨婷,劉曉慶Δ,武琳琳

西北婦女兒童醫(yī)院:1.藥劑科;2.婦女保健科,陜西西安 710061

子宮內(nèi)膜異位癥是內(nèi)膜細(xì)胞在子宮內(nèi)膜以外的位置種植的疾病,是婦科常見(jiàn)疾病[1]。該病多發(fā)生于育齡期女性,其主要癥狀包含慢性盆腔痛、異位結(jié)節(jié)、不孕、痛經(jīng)、月經(jīng)異常等,是一種需要終身治療的慢性疾病,對(duì)女性的身體健康造成了諸多不利影響[2-3]。目前臨床對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療主要依托于藥物與手術(shù),但仍需尋找更多有效藥物進(jìn)行治療。黃芪甲苷提取自黃芪的根,屬于黃芪的活性物質(zhì),具有抗炎、增強(qiáng)免疫及減弱癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用[4]。閔治紅等[5]研究顯示,黃芪可調(diào)控患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞趨化因子。黃芪甲苷可抑制黑色素瘤B16細(xì)胞[6]、受損內(nèi)皮細(xì)胞[7]的增殖。子宮內(nèi)膜異位癥雖屬良性疾病,但具有惡性增殖的性質(zhì)[8]。炎癥反應(yīng)是子宮內(nèi)膜異位病灶中的重要特征[9]。故本研究推測(cè)黃芪甲苷可能通過(guò)發(fā)揮抗炎和抑制細(xì)胞增殖的作用影響子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)展。Toll樣受體4(TLR4)-髓樣分化因子(MyD88)的活化可激活下游核因子(NF)-κB,進(jìn)而參與多種細(xì)胞因子的活化,在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖中發(fā)揮作用[10]。TLR4-MyD88信號(hào)通路的激活可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥病灶異位細(xì)胞的增殖和侵襲,抑制該信號(hào)通路可減輕子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的疼痛度[11-12]。黃芪甲苷能否對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠發(fā)揮治療作用及其對(duì)TLR4-MyD88信號(hào)通路的調(diào)控作用尚且未知,本研究將對(duì)此展開(kāi)分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑、儀器 SPF級(jí)無(wú)交配史SD大鼠(雌性)50只,購(gòu)自陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院,許可證號(hào):SYXK(陜)2018-002,常規(guī)飼養(yǎng),體質(zhì)量180～220 g,自然光照,溫度(22±2)℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。黃芪甲苷購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司;大鼠孕酮(P)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自北京博蕾德生物科技有限公司(批號(hào):AR E-8700);大鼠雌二醇(E2)、大鼠卵泡刺激素(FSH)、大鼠黃體生成素(LH)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、大鼠IL-8 ELISA試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào):ml002871、ml059034、ml470613、ml002859、ml102828、ml002885);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物公司(批號(hào):PC0020);兔抗鼠TLR4、MyD88、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、NF-κB、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH),以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(批號(hào):ab217274、ab219413、ab194726、ab16502、ab8245、ab6721)。酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices 美谷分子儀器(上海)有限公司。光學(xué)顯微鏡(光鏡)購(gòu)自上海豫光儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立以及分組 參考文獻(xiàn)[13],建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型,大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,麻醉后將大鼠固定至鼠板上,暴露大鼠腹部,備皮、消毒,開(kāi)腹,找到子宮,分離右側(cè)子宮,在距左側(cè)卵巢約1 cm處結(jié)扎腸系膜上的血管,再結(jié)扎右側(cè)子宮宮頸處兩端,剪取中間子宮體2 cm,將剪下的組織在生理鹽水中培養(yǎng),沿系膜部位將組織縱行剪開(kāi),剪取兩段內(nèi)膜組織片段,約4 mm×4 mm,將子宮內(nèi)表面上皮與腹壁相貼合。術(shù)后縫合皮膚,注射抗生素防止感染。4周后開(kāi)腹,若出現(xiàn)移植物體積增大、液體聚集,出現(xiàn)白色透明或暗紅色小囊腫則為造模成功。

將造模成功的40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和黃芪甲苷低、中、高劑量組,每組10只。另取10只大鼠僅切開(kāi)皮膚,不移植子宮內(nèi)膜,作為對(duì)照組。黃芪甲苷低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予20、40、80 mg/kg黃芪甲苷灌胃處理(二甲基亞砜溶解并添加生理鹽水至所需濃度),連續(xù)給藥28 d;對(duì)照組、模型組以等量生理鹽水代替。

1.2.2子宮內(nèi)膜組織收集以及處理 末次給藥結(jié)束后給予戊巴比妥鈉麻醉大鼠,眼靜脈采集血液1 mL,對(duì)大鼠進(jìn)行開(kāi)腹,取腹壁移植物,測(cè)量移植物長(zhǎng)、寬、高,并計(jì)算體積,對(duì)照組收集子宮,將標(biāo)本沖洗干凈,吸去水分,模型組等其他組開(kāi)腹取腹壁移植物,將組織分為2部分,一部分進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色法檢測(cè)(多聚甲醛固定),另一部分于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3血清E2、P、LH、FSH、TNF-α、IL-6、IL-8水平檢測(cè) 分離獲得血清,通過(guò)相應(yīng)ELISA試劑盒測(cè)定血清中E2、P、LH、FSH、TNF-α、IL-6、IL-8水平。

1.2.4HE染色 將固定的子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行脫水,石蠟包埋,切片,并進(jìn)行HE染色,中性樹(shù)脂封片,光鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織病理變化。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中TLR4-MyD88信號(hào)通路蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白,對(duì)蛋白定量(BCA試劑盒),進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,分離蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜,封閉,加入兔抗TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000),4 ℃過(guò)夜,加入HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,測(cè)定TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1黃芪甲苷對(duì)各組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積增大(P<0.05);與模型組相比,黃芪甲苷低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積縮小(P<0.05),且呈劑量依賴性(F=119.978,P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積比較

2.2黃芪甲苷對(duì)各組大鼠血清性激素的影響 多組間FSH水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清E2、P、LH水平升高(P<0.05);與模型組相比,黃芪甲苷低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清E2、P、LH水平降低(P<0.05),且存在劑量依賴性(F=298.466、104.096,F=81.817,均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清E2、P、LH、FSH水平

2.3黃芪甲苷對(duì)各組大鼠血清炎癥因子的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(P<0.05);與模型組相比,黃芪甲苷低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.05),且呈劑量依賴性(F=96.970、59.955、63.928,均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

2.4黃芪甲苷對(duì)各組大鼠子宮內(nèi)膜組織的影響 對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)良好,結(jié)構(gòu)完整,清晰可見(jiàn),上皮內(nèi)細(xì)胞核豐富,血管、間質(zhì)正常;模型組大鼠可見(jiàn)移植內(nèi)膜生長(zhǎng),被覆柱狀上皮,間質(zhì)較多,可見(jiàn)炎性浸潤(rùn);黃芪甲苷低劑量組、中劑量組、高劑量組移植內(nèi)膜與模型組相比變少,生長(zhǎng)不完整,腺體減少或消失,腺上皮萎縮。見(jiàn)圖1。

注:A為對(duì)照組;B為模型組;C為黃芪甲苷低劑量組;D為黃芪甲苷中劑量組;E為黃芪甲苷高劑量組。圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理(HE染色,×200)

2.5黃芪甲苷對(duì)各組大鼠TLR4-MyD88信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平升高(P<0.05);與模型組相比,黃芪甲苷低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平降低(P<0.05),且存在劑量依賴性(F=149.634、121.363、117.281、134.361,均P<0.05)。見(jiàn)表4、圖2。

注:A為對(duì)照組;B為模型組;C為黃芪甲苷低劑量組;D為黃芪甲苷中劑量組;E為黃芪甲苷高劑量組。圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織TLR4-MyD88信號(hào)通路蛋白表達(dá)電泳圖

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織TLR4-MyD88信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是子宮內(nèi)膜存在的內(nèi)膜細(xì)胞擴(kuò)散至子宮內(nèi)膜以外種植的疾病,屬于婦科常見(jiàn)疾病[14]。育齡期婦女易患此病,子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)是當(dāng)今的主流發(fā)病機(jī)制觀點(diǎn)[15]。異位內(nèi)膜細(xì)胞的持續(xù)增殖可加速子宮內(nèi)膜異位癥的疾病進(jìn)程[16]。組織細(xì)胞遷移是子宮內(nèi)膜異位病灶病理形成的前提條件,調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移可能影響內(nèi)膜組織細(xì)胞在異位的種植與存活,從而影響子宮內(nèi)膜異位病灶的形成[17]。

黃芪甲苷是提取自黃芪根中的活性物質(zhì),藥理研究表明,黃芪甲苷具有增加免疫力、抗炎、抗腫瘤的作用[4]。黃芪甲苷可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。楊紅等[18]研究顯示,黃芪甲苷可抑制HL60細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,在治療急性髓系白血病中發(fā)揮重要作用;劉鈺等[19]研究顯示,黃芪甲苷可促進(jìn)高糖受損人內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移;張振飛等[20]研究顯示,黃芪甲苷可抑制A549(非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)細(xì)胞增殖與遷移。張冀寧等[21]研究顯示,趨化因子受體CXCR1、CCR5在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮重要作用,黃芪可調(diào)控CXCR1、CCR5水平。韓曉波[22]通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘分析子宮內(nèi)膜異位癥用藥規(guī)律,發(fā)現(xiàn)黃芪是其中最常用的藥物。因此,推測(cè)黃芪甲苷對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥可能具有治療作用。

本研究中,黃芪甲苷可明顯縮小病灶,改善病灶組織形態(tài),模型大鼠移植的內(nèi)膜組織被覆柱狀上皮結(jié)構(gòu)清晰,存在炎性浸潤(rùn),擁有較多腺體,黃芪甲苷可減少炎性浸潤(rùn)與腺體,病理改變減輕,提示黃芪甲苷具有治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用。子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病,體內(nèi)激素水平反映了內(nèi)膜的生長(zhǎng)情況。有研究顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者的E2、LH、P水平升高,內(nèi)膜容受度較差,內(nèi)膜厚度較薄[23]。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)黃芪甲苷處理后,子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清E2、LH、P水平降低,提示黃芪甲苷可抑制大鼠性激素的分泌,進(jìn)而治療子宮內(nèi)膜異位癥。

子宮內(nèi)膜異位癥是一種低度炎癥性疾病[24],其特征是促炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-8和TNF-α的產(chǎn)生增加,可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和黏附[25-26]。本研究中模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著高于對(duì)照組,且經(jīng)黃芪甲苷處理后,大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低,提示黃芪甲苷可控制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠炎癥反應(yīng),控制異位灶的形成。

TLR4是機(jī)體固有免疫受體,誘發(fā)炎癥反應(yīng)與獲得性免疫反應(yīng),具有免疫調(diào)節(jié)作用,在多種疾病中發(fā)揮作用,可通過(guò)MyD88依賴性通路誘導(dǎo)炎癥介質(zhì),激活NF-κB,參與疾病的炎癥反應(yīng)[27]。有研究顯示,TLR4-MyD88信號(hào)通路可參與子宮內(nèi)膜異位癥病灶內(nèi)細(xì)胞增殖與遷移的調(diào)控,且抑制TLR4-MyD88信號(hào)通路能夠阻礙異位病灶細(xì)胞的增殖和侵襲,從而減緩子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)展[11,28]。MARCHIONNI等[29]研究顯示,TLR4是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制中一個(gè)較好的候選者。王芳等[30]研究顯示NF-κB在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位病灶的生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。本研究中,模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平升高,經(jīng)黃芪甲苷處理后其水平降低,提示黃芪甲苷可抑制TLR4-MyD88信號(hào)通路的激活。黃芪甲苷可能通過(guò)抑制TLR4-MyD88通路激活發(fā)揮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用,但相應(yīng)機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

綜上所述,黃芪甲苷可抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位病灶生成,減輕炎癥反應(yīng)和降低性激素水平,抑制TLR4-MyD88信號(hào)通路激活,且呈劑量依賴性。