江培濤,方 敏,馬 超

南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院/揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇揚(yáng)州 211900

肺炎克雷伯菌(KP)是臨床常見的革蘭陰性條件致病菌,可以引起呼吸道、尿道、血流等多處感染。近年來由肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的肝膿腫病例不斷出現(xiàn)[1],高毒力肺炎克雷伯菌逐漸引起人們關(guān)注。高黏液型是高毒力肺炎克雷伯菌的主要生物學(xué)特性之一,但有研究認(rèn)為不能將高黏液型和臨床高毒力肺炎克雷伯菌劃等號(hào)[2]。本研究擬從高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力基因表達(dá)和其感染病例的臨床特征入手,探討高黏液型肺炎克雷伯菌感染的臨床特征及毒力基因的表達(dá)情況,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選擇2018年7月至2022年5月南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院門診和住院患者臨床分離的154株肺炎克雷伯菌為研究對(duì)象,剔除同一患者相同部位的重復(fù)分離菌株。標(biāo)本科室來源:呼吸內(nèi)科36株,神經(jīng)外科31株,ICU 30株,心胸外科18株,心血管內(nèi)科8株,兒科8株,普外科5株,其他科室18株;標(biāo)本類型:痰及肺泡灌洗液118株,尿液21株,膿液及傷口分泌物10株,血液3株,導(dǎo)管2株。所有菌株的鑒定均通過PCR實(shí)驗(yàn)檢測rpoB基因(rpoB-F:5′-CGTATCGTAAAGTGACCGACG-3′;rpoB-R:5′-GGCCGTTTTCATCCAGGTTG-3′)[3]進(jìn)行確認(rèn)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603,均購自法國生物梅里埃公司。

1.2主要儀器與試劑 GHP-9270數(shù)顯隔水式恒溫孵育箱(上海精宏醫(yī)療器械廠);MicroScan WalkAway 96 Plus 細(xì)菌鑒定藥敏分析儀(美國貝克曼公司);TGL-18R冷凍高速離心機(jī)(珠海Hema醫(yī)學(xué)儀器有限公司);NanoDrop2000分光光度計(jì)(美國Thermo公司);ABI7500PCR儀(美國ABI公司);細(xì)菌基因組提取、PCR檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司);瓊脂糖(廣州賽國生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株藥敏試驗(yàn) 所有菌株藥敏試驗(yàn)(微量肉湯稀釋法)均由MicroScan WalkAway 96 Plus 系統(tǒng)完成。藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2018版CLSI M100執(zhí)行。

1.3.2高黏液型鑒別 根據(jù)拉絲試驗(yàn)[4],用接種環(huán)挑取血平板上的菌落,以黏液絲長度大于5 mm的肺炎克雷伯菌為高黏液型菌株,將154株肺炎克雷伯菌分為高黏液型和非高黏液型。

1.3.3臨床資料信息采集 通過實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)(LIS)和醫(yī)院信息管理系統(tǒng)(HIS)獲取154株肺炎克雷伯菌感染病例的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果及年齡、性別、體溫、診斷等信息,其中實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果和體溫?cái)?shù)據(jù)以該菌株培養(yǎng)標(biāo)本送檢當(dāng)天或2 d內(nèi)最近一次結(jié)果為準(zhǔn)。

1.3.4毒力基因的檢測 采用實(shí)時(shí)PCR方法檢測毒力基因[黏液表型調(diào)節(jié)基因A (rmpA)、rmpA2、黏液相關(guān)基因A(magA)、氣桿菌素鐵載體基因(aerobactin)]的表達(dá)。基因引物序列rmpA-F:3′ACTGGGCTACCTCTGCTTC-5′;rmpA-R:3′-CTTGCATGAGCCAT CTTTCA-5′;rmpA2-F:3′-TGTGCAATAAGGATGTTACATTAGT-5′;rmpA2-R:3′-TTTGATGTGCACC ATTTTTCA-5′;magA-F:3′-GGTGCTCTTTACA TCATTGC-5′;magA-R:3′-GCAATGGCCATTTGCGTTAG-5′;aerobactin-F:3′-GCATAGGCGGA TACGAACAT-5′;AEROBACTIN-R:3′-CACAGGG CAATTGCTTACCT-5[4-8]。用TRIzol法提取總RNA并將其水平調(diào)整到150 ng/mL。按試劑盒說明書使用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因進(jìn)行測定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Whonet5.6軟件進(jìn)行抗菌藥物敏感性統(tǒng)計(jì);采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、百分率表示,比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1高黏液型鑒別結(jié)果 根據(jù)拉絲試驗(yàn),154株肺炎克雷伯菌分為高黏液型69株和非高黏液型85株。

2.2藥敏試驗(yàn) 除氨芐西林(氨芐西林為固有耐藥)及妥布霉素外,高黏液型菌株對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均明顯低于非高黏液型(P<0.05)。高黏液型菌株檢出產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株3株(4.35%),非高黏液型菌株檢出產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株6株(7.06%),二者產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株檢出率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高黏液型菌株檢出碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌(CRE)8株(11.59%),非高黏液型菌株檢出CRE 28株(32.94%),二者CRE檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高黏液型菌株檢出廣泛耐藥肺炎克雷伯菌(XDR-KP)9株(13.04%),非高黏液型菌株檢出XDR-KP 25株(29.41%),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性[n(%)]

2.3肺炎克雷伯菌感染病例臨床特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)果 高黏液型菌株和非高黏液型菌株感染者性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、超敏C反應(yīng)蛋白和科室分布情況比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但高黏液型菌株感染者中體溫>37.2 ℃和中性粒細(xì)胞百分比>70%的比例高于非高黏液型菌株感染者(P<0.05),高黏液型菌株在呼吸道感染患者的檢出構(gòu)成比高于非高黏液型菌株(P<0.05),高黏液型菌株在泌尿系統(tǒng)感染患者的檢出構(gòu)成比卻低于非高黏液型菌株(P<0.05)。見表2。

表2 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌感染病例臨床特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)果[n(%)]

2.4肺炎克雷伯菌毒力基因的攜帶情況 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌rmpA、rmpA2、aerobactin 3種毒力基因的攜帶率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而magA毒力基因的攜帶率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌毒力基因的攜帶情況[n(%)]

3 討 論

肺炎克雷伯菌廣泛分布于自然界,其肺炎亞種可引起重癥肺炎、支氣管炎及各種肺外感染。其中高毒力肺炎克雷伯菌是社區(qū)獲得性肝膿腫、壞死性筋膜炎及眼內(nèi)炎的重要原因。但目前區(qū)分高毒力肺炎克雷伯菌和經(jīng)典克雷伯菌主要依賴于拉絲試驗(yàn),但該試驗(yàn)的靈敏度和特異度尚無定論,更好的高毒力肺炎克雷伯菌診斷試驗(yàn)仍有待開發(fā)。

本研究中,除氨芐西林和妥布霉素外,高黏液型菌株對(duì)其他抗菌藥物的耐藥性均明顯低于非高黏液型菌株,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)于肺炎克雷伯菌而言,氨芐西林為天然耐藥,而妥布霉素在臨床主要用于革蘭陰性桿菌及葡萄球菌感染,特別是用于對(duì)慶大霉素耐藥的革蘭陰性桿菌的治療,但因其對(duì)聽神經(jīng)和腎臟功能的損害等不良反應(yīng),限制了其在臨床的應(yīng)用,故本研究中高黏液型與非高黏液型菌株對(duì)妥布霉素的耐藥率均較低(<20.00%)。而對(duì)于阿米卡星和慶大霉素這兩種常用的氨基糖苷類及氟喹諾酮類抗菌藥物,高黏液型與非高黏液型菌株的總體耐藥率與中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)所報(bào)道的近幾年全國數(shù)據(jù)[9]相近。對(duì)于臨床常用的第3代頭孢菌素及碳青霉烯類抗菌藥物,本研究中非高黏液型菌株耐藥率與CHINET數(shù)據(jù)相近,而高黏液型菌株耐藥率則遠(yuǎn)低于全國數(shù)據(jù),這與地區(qū)差異及全國數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)并不區(qū)分是否高黏液型有關(guān)。本研究在高黏液型菌株中檢出8株CRE,而非高黏液型菌株中檢出28株,兩組之間CRE檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高黏液型菌株的CRE檢出率明顯低于非高黏液型菌株,而且CRE菌株也均表現(xiàn)為廣泛耐藥。

本研究除了比較高黏液型與非高黏液型菌株耐藥性差異之外,進(jìn)一步分析其臨床病例特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),高黏液型菌株和非高黏液型菌株感染者性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、超敏C反應(yīng)蛋白和科室分布情況比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但高黏液型菌株感染者中體溫>37.2 ℃和中性粒細(xì)胞百分比>70%的比例均高于非高黏液型菌株(P<0.05)。這說明本研究中高黏液型菌株的毒力總體上強(qiáng)于非高黏液型,但仍有20%左右的高黏液型菌株不具有這些特征,因而不能把菌株的高黏液表型完全等同于高毒力。就感染部位而言,高黏液型菌株和非高黏液型菌株檢出構(gòu)成比最高的均為呼吸道,其次為泌尿系統(tǒng)。但高黏液型菌株在呼吸道感染患者的檢出構(gòu)成比高于非高黏液型菌株(P<0.05),高黏液型菌株在泌尿系統(tǒng)感染患者的檢出構(gòu)成比卻低于非高黏液型菌株(P<0.05)。推測其原因可能是肺炎克雷伯菌呼吸道感染多為社區(qū)獲得性,常為野生型菌株,表現(xiàn)為高黏液型,而肺炎克雷伯菌泌尿系統(tǒng)感染常為醫(yī)院獲得性,多為變異株,表現(xiàn)為莢膜缺失的非高黏液型[10]。就科室分布而言,高黏液型菌株和非高黏液型菌株在呼吸內(nèi)科、ICU、神經(jīng)外科等病房的檢出構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但以這3個(gè)科室的檢出構(gòu)成比最高。本研究的不足之處是樣本量較小,高黏液型菌株和非高黏液型菌株在血流和其他部位的感染率以及其他科室分布的真實(shí)差異有待進(jìn)一步研究。

有研究認(rèn)為,介導(dǎo)肺炎克雷伯菌莢膜合成的基因可在不同菌株間通過水平方式傳遞,使不具備高毒力特征的菌株也表現(xiàn)出高黏性[10]。rmpA主要調(diào)控莢膜的合成,導(dǎo)致高毒力肺炎克雷伯菌呈現(xiàn)高黏液表型以及細(xì)菌毒力增加[11]。本研究中rmpA和rmpA2基因在高黏液型肺炎克雷伯菌中的攜帶率分別為89.86%和84.06%,明顯高于非高黏液型組的16.47%和27.06%,結(jié)果與部分研究[12-13]相近。這說明雖然rmpA和rmpA2基因在高黏液型肺炎克雷伯菌中廣泛表達(dá),但仍有10%以上的非高黏液型菌株攜帶黏液表型調(diào)節(jié)基因。magA僅存在于K1血清型中,被認(rèn)為是高黏液表型的介導(dǎo)因子[14-15]。本研究中magA基因在高黏液型和非高黏液型兩種菌株中的攜帶率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這說明magA基因與肺炎克雷伯菌高黏液型特征之間并無直接關(guān)系,這可能與本研究中的菌株來源主要以呼吸道和泌尿系統(tǒng)感染患者為主有關(guān),其血清型與主要來源于化膿性肝膿腫的攜帶magA基因的K1型菌株之間有很大差異[10]。與經(jīng)典肺炎克雷伯菌相比,氣桿菌素可以使高毒力肺炎克雷伯菌中的鐵載體增加,是增強(qiáng)肺炎克雷伯菌毒力的重要因子[16]。在本研究中,aerobactin在高黏液型菌株中的表達(dá)明顯高于非高黏液型菌株,說明高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力總體上強(qiáng)于非高黏液型,但是仍有25%左右的高黏液型菌株和20%左右的非高黏菌株并非如此。

總之,高黏液型與非高黏液型肺炎克雷伯菌感染患者的主要差異在于體溫升高以及中性粒細(xì)胞百分比升高,且高黏液型菌株毒力基因rmpA、rmpA2及aerobactin的攜帶率明顯高于非高黏液型菌株。但本研究納入樣本量較少,且可供實(shí)驗(yàn)室檢測的肺炎克雷伯菌毒力基因、炎癥指標(biāo)及臨床指征還有很多,高黏液型與非高黏液型肺炎克雷伯菌在毒力和臨床特點(diǎn)之間的差異還可進(jìn)一步研究。