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        IL-4/STAT6通路相關(guān)基因?qū)raves病患者外周血B淋巴細胞水平的影響*

        2023-06-28 09:23:02查兵兵
        檢驗醫(yī)學(xué)與臨床 2023年12期
        關(guān)鍵詞:病組病患者外周血

        楊 倩,查兵兵

        復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200240

        Graves病是器官特異性自身免疫性甲狀腺疾病,患病率約為1%[1]。目前認為抑制性免疫細胞功能的減弱[2],以及輔助性T淋巴細胞和B淋巴細胞功能的增強[3],導(dǎo)致Graves病致病性抗體促甲狀腺素受體抗體(TRAb)的產(chǎn)生。本課題組既往研究顯示CD20+B淋巴細胞在Graves病患者甲狀腺組織中浸潤[3],占Graves病甲狀腺淋巴細胞的9%左右,外周血CD19+B淋巴細胞也顯著增加[4]。但目前Graves病B淋巴細胞增多機制還有待進一步研究。

        白細胞介素-4(IL-4)主要由活化T細胞產(chǎn)生,通過促甲狀腺激素受體(THSR)免疫野生型(WT)、IL-4基因敲除的老鼠發(fā)現(xiàn),只有IL-4基因敲除的老鼠不易發(fā)展成為Graves病,證實IL-4在Graves病發(fā)生中的重要作用[5]。而Graves病患者血清IL-4水平與健康人對比目前存在爭議,結(jié)果不一致[6-7]。此外IL-4對于B淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)起著重要的作用。促進B淋巴細胞增殖是IL-4被識別的第一個生物學(xué)功能[8]。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)IL-4可促進前B淋巴細胞分化為成熟B淋巴細胞,拮抗Fas介導(dǎo)的B淋巴細胞凋亡,延長B淋巴細胞的壽命,促進B淋巴細胞抗體類別轉(zhuǎn)換以及促進主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-Ⅱ生成,增強抗原遞呈等[8-10]。IL-4在B淋巴細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用依賴信轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)信號[11]。STAT6屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子家族一員,在B淋巴細胞發(fā)育、分化以及抗體類別轉(zhuǎn)化中也起著重要的作用[12]。目前IL-4/STAT6通路相關(guān)基因?qū)raves病患者外周血B淋巴細胞的影響尚不清楚。

        1 資料與方法

        1.1一般資料 選擇2021年1-6月在上海市第五人民醫(yī)院門診及病房初發(fā)、未使用過抗甲狀腺藥物治療的Graves病患者20例作為Graves病組,其中男8例、女12例,年齡21~78歲、平均(42.0±2.8)歲。選擇同期在上海市第五人民醫(yī)院體檢健康且性別、年齡匹配的20例健康者作為健康對照組。Graves病的診斷依據(jù)美國甲狀腺協(xié)會(ATA)2016年相關(guān)指南[13]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)甲狀腺炎及其他可引起甲狀腺素水平升高的疾病;(2)近期服用過胺碘酮及其他可影響甲狀腺功能的藥物;(3)妊娠期女性;(4)患嚴重心腦血管疾病,肝、腎衰竭,腫瘤,急性感染,慢性炎癥性疾病,其他自身免疫性疾病。

        1.2儀器與試劑 羅氏 Cobas 800全自動生化免疫分析儀,Beckman Counter CyAn流式細胞儀。Human BD Fc BlockTM購自BD Biosciences公司,anti-human CD19購自Biolegend公司,anti-hu/mo pSTAT6購自Ebioscience公司,anti-human IL-4R購自Biolegend公司,RNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自TaKaRa公司,IL-4 ELISA試劑盒購自Abcam公司。

        1.3方法 所有研究對象采血前禁食12 h,并于次日清晨8點采血,抽取3 mL于采血管中,每人采血2管。(1)甲狀腺功能及甲狀腺抗體檢測:取3 mL外周血送上海市第五人民醫(yī)院檢驗科檢測甲狀腺功能[游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素 (FT4)]、甲狀腺抗體[甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、TRAb]。TRAb是Graves病生化診斷指標(biāo),健康對照組未檢測該抗體。(2)流式檢測CD19+B淋巴細胞、IL-4受體(IL-4R)和pSTAT6:取3 mL外周血于EDTA抗凝管中,根據(jù)密度梯度離心法獲得單個核細胞。向細胞懸液中加入Fc Block 抗體,4 ℃ 孵育 15 min,再加入熒光抗體anti-human CD19、 anti-hu/mo pSTAT6、anti-human IL-4R,4 ℃ 避光孵育 0.5 h。洗去未與細胞表面抗原結(jié)合的抗體后重懸細胞,上機檢測IL-4R、CD19+B淋巴細胞水平。將表染后的細胞用PBS 洗滌后加入穿核液,4 ℃ 孵育45 min。再予Perm 洗滌細胞加入含熒光抗體的Perm,4 ℃ 避光孵育 40 min。一管加入Perm洗去未與細胞核內(nèi)分子的抗體,再重懸細胞,上機進行pSTAT6流式檢測。(3)IL-4R mRNA檢測:為驗證RNA-seq芯片數(shù)據(jù)的可靠性,通過磁珠分選8例Graves病患者和5例健康者外周血B淋巴細胞進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測驗證IL-4R mRNA表達。使用TRIzol試劑提取總RNA,并按照說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計和合成由捷瑞生物公司完成,以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內(nèi)參。RT-PCR檢測嚴格按照說明書進行操作。RT-PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃ 30 s預(yù)變性,95 ℃ 5 s,55 ℃ 34 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s,55 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCt計算IL-4R mRNA的水平。(4)ELISA檢測IL-4:按照人IL-4 ELISA試劑盒操作步驟進行,最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物濃度與吸光度(A)計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線方程,將A代入方程式,計算出濃度,再根據(jù)稀釋倍數(shù),算出實際濃度。

        2 結(jié) 果

        2.1兩組甲狀腺功能、甲狀腺抗體比較 與健康對照組比較,Graves病組FT3、FT4、TPOAb、TGAb水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

        表1 兩組甲狀腺功能、甲狀腺抗體水平比較[M(P25,P75)或

        2.2兩組CD19+B淋巴細胞比例和IL-4R水平比較 Graves病組外周血CD19+B淋巴細胞比例為(7.74±2.68)%,高于健康對照組的(3.38±1.59)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.235,P<0.05)。Graves病患者B淋巴細胞IL-4R mRNA的水平為3.415±0.813,高于健康者的1.037±0.210,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.747,P<0.05)。mRNA芯片原始文件可從GEO數(shù)據(jù)庫(編號GSE136709)獲取,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE136709。

        2.3兩組IL-4、CD19+IL-4R+B淋巴細胞和CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平比較 Graves病組血清IL-4水平及外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與健康對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        表2 血清IL-4及外周血CD19+IL-4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞組間比較或M(P25,P75)]

        2.4IL-4、CD19+IL4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞與Graves病患者甲狀腺功能及甲狀腺抗體相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示,Graves病IL-4、CD19+IL4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與甲狀腺功能(FT3、FT4)、甲狀腺抗體(TPOAb、TGAb、TRAb)均無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

        表3 IL-4、CD19+IL-4R+和CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與Graves病甲狀腺功能及甲狀腺抗體之間的相關(guān)性

        3 討 論

        Graves病的病因目前尚未完全闡明,現(xiàn)認為其發(fā)病與遺傳、精神因素、自身免疫系統(tǒng)密切相關(guān),是多種因素共同作用的結(jié)果[14]。B淋巴細胞是Graves病自身抗體TRAb的來源,在Graves病患者外周血和甲狀腺組織中均顯著增加。當(dāng)前研發(fā)針對B淋巴細胞的藥物以期從根本上阻斷Graves病異常免疫應(yīng)答,成為Graves治療的新方向[15]。可以說B淋巴細胞在Graves病發(fā)生和治療中均發(fā)揮著重要的作用。

        Graves病是以Th2免疫為主的器官特異性自身免疫性疾病,而IL-4是Th2細胞分泌的細胞因子,在Graves病患者甲狀腺組織中高表達[16]。B淋巴細胞的增殖、分化需要多種細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用。目前研究發(fā)現(xiàn)IL-4依賴STAT6在B淋巴細胞增殖、延長B淋巴細胞生存周期及減少B淋巴細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[9]。IL-4在B淋巴細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控很大程度上依賴于STAT6。即IL-4與IL-4R結(jié)合后,激活Jak1和Jak3激酶,而后使得STAT6磷酸化(pSTAT6),磷酸化的STAT6形成二聚體進入細胞核參與目的基因的轉(zhuǎn)錄[17]。本課題組既往研究證實了TRAb刺激甲狀腺細胞后導(dǎo)致甲狀腺細胞自分泌IL-4,IL-4與IL-4R結(jié)合促進STAT6磷酸化,再通過促進增生相關(guān)基因Bcl-xL、Cyclin D1表達,來促進甲狀腺濾泡上皮細胞增生,導(dǎo)致Graves病的發(fā)生[18]。IL-4/STAT6對B淋巴細胞生發(fā)中心的形成和抗體類別轉(zhuǎn)換至關(guān)重要[19],但目前IL-4/STAT6對B淋巴細胞增殖、分化尚不清楚。雖然IL-4對Graves病的發(fā)病和B淋巴細胞的增殖起著重要的作用,但本研究發(fā)現(xiàn)血清IL-4水平在Graves病組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        本課題組mRNA表達譜芯片結(jié)果顯示參與激活B淋巴細胞增殖的IL-4R mRNA在Graves病患者B淋巴細胞中上調(diào),并且PCR驗證IL-4R mRNA在Graves病患者外周血B淋巴細胞中顯著增加,但流式細胞術(shù)檢測顯示外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平在Graves病組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。STAT6作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與細胞的增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)效應(yīng),缺乏會導(dǎo)致B淋巴細胞免疫功能受損、糖酵解能力降低以及細胞形態(tài)改變,導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生、發(fā)展。STAT6的活化需要IL-4介導(dǎo),本課題組猜想外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平在Graves病組和健康對照組間無明顯差異可能是因為本研究納入的樣本量小,Graves病組和健康對照組間血清IL-4水平無差異所致,本課題組后續(xù)將擴大樣本量進行深入探討。甲狀腺微環(huán)境下CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平尚不明確,后續(xù)需要動物實驗進行驗證。經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),IL-4、CD19+IL-4R+B淋巴細胞、CD19+pSTAT6+B淋巴細胞水平與甲狀腺功能和甲狀腺抗體均無相關(guān)性。雖然B淋巴細胞和IL-4/STAT6通路在Graves病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,但IL-4/STAT6通路相關(guān)基因并不能反映Graves病的疾病狀態(tài)。

        綜上所述,Graves病患者外周血B淋巴細胞顯著增加,IL-4/STAT6信號通路相關(guān)基因可能并不影響Graves病患者外周血B淋巴細胞增殖和Graves病的疾病狀態(tài)。

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