曹 蕾,周 琰,黃 劍,高姚怡,李懿皞,王蓓麗,潘柏申,郭 瑋

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院:1.藥劑科;2.檢驗(yàn)科;3.麻醉科,上海 200032

外科手術(shù)期間提供有效的疼痛管理對(duì)于提高手術(shù)效果、促進(jìn)患者恢復(fù)和提升患者滿意度非常重要。選擇合適的麻醉藥物是疼痛管理的重要環(huán)節(jié)之一[1]。芬太尼因其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng),見(jiàn)效時(shí)間較短,被廣泛用于術(shù)中麻醉和患者自控鎮(zhèn)痛[2]。然而,由于個(gè)體間對(duì)芬太尼的敏感性存在明顯差異,基于患者身高、體質(zhì)量和麻醉實(shí)施者臨床經(jīng)驗(yàn)的傳統(tǒng)麻醉用量估算方法,容易發(fā)生麻醉不完全或者過(guò)量的現(xiàn)象[3-4]。

多項(xiàng)研究表明芬太尼應(yīng)答的個(gè)體差異與人類遺傳學(xué)密切相關(guān),它的藥物作用靶點(diǎn)以及代謝通路中關(guān)鍵酶的基因多態(tài)性均會(huì)對(duì)手術(shù)期間麻醉效果產(chǎn)生影響[5-6]。本文旨在通過(guò)篩選CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met和OPRM1 A118G基因多態(tài)性與芬太尼藥物用量和圍術(shù)期視覺(jué)模擬評(píng)分法(VAS)評(píng)分之間的關(guān)系,助力圍術(shù)期精準(zhǔn)麻醉管理,提高阿片類藥物使用的安全性和有效性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年7月至2020年12月在本院擇期進(jìn)行腹腔鏡結(jié)腸腫瘤根治術(shù)的101例患者為研究對(duì)象,其中男58例、女43例,平均年齡(59.75±5.74)歲,平均體質(zhì)量(62.41±9.03) kg,平均身高(164.63±7.66)cm。所有患者均簽署知情同意書,本研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(B2018-054R)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡45～70歲;(2)美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(ASA)評(píng)分Ⅰ～Ⅱ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)病態(tài)肥胖[體質(zhì)量指數(shù)(BMI)>30 kg/m2或極度消瘦(BMI<20 kg/m2)];(2)肝腎功能不全;(3)慢性疼痛;(4)1個(gè)月內(nèi)服用過(guò)影響CYP3A4酶活性的酶誘導(dǎo)劑或酶抑制劑者。中途退出標(biāo)準(zhǔn):(1)受試者要求撤回知情同意書;(2)術(shù)中改變手術(shù)方式;(3)術(shù)中出血量超過(guò)500 mL。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及DNA提取 收集患者術(shù)前乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血2 mL。使用Lab-Aid 820核酸抽提Midi試劑(廈門致善生物科技股份有限公司),嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求抽提基因組DNA,并保存于-20 ℃低溫冰箱直至檢測(cè)。

1.2.2引物設(shè)計(jì)及合成 采用Oligo7軟件設(shè)計(jì)PCR引物,待測(cè)引物序列詳見(jiàn)表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 待測(cè)基因引物序列

1.2.3PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序 將熱啟動(dòng)Taq酶-PCR反應(yīng)體系 10 μL[Premix Taq@Hot Start Version,寶生物工程(大連)有限公司]、正向/反向引物各1 μL、DNA模板4 μL和去離子水4 μL,依次加入0.2 mL PCR反應(yīng)管中,PCR反應(yīng)總體積為20 μL,振蕩混勻后瞬時(shí)離心備用。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;4 ℃保溫,Applided Biosystems 7500 Fast Realtime PCR System[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,在ABI3130測(cè)序儀(美國(guó) ABI 公司)上進(jìn)行雙相Sanger測(cè)序,測(cè)序試劑購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件進(jìn)行分析。

1.2.4鎮(zhèn)痛方法及評(píng)價(jià) 患者入手術(shù)室前無(wú)任何術(shù)前用藥。誘導(dǎo)前使用麻醉面罩充分給氧去氮,直至自主呼吸時(shí)呼氣末氧濃度超過(guò)80%。使用芬太尼(3.0 μg/kg)、異丙酚(2.0 mg/kg)和順式阿曲庫(kù)銨(0.2 mg/kg)聯(lián)用的靜脈誘導(dǎo)方案;術(shù)中使用七氟醚和順式阿曲庫(kù)銨至關(guān)腹時(shí)停用?；颊呋謴?fù)意識(shí)后,送入麻醉后復(fù)蘇觀察室(PACU),使用鎮(zhèn)痛泵自控靜脈鎮(zhèn)痛(PCIA)。

1.2.5評(píng)估指標(biāo)及方法 記錄芬太尼用量,包括術(shù)中用量、PACU用量、手術(shù)室用量、術(shù)后第1天PCIA用量(簡(jiǎn)稱術(shù)后第1天用量)、術(shù)后第2天PCIA用量(簡(jiǎn)稱術(shù)后第2天用量)和圍術(shù)期用量。手術(shù)室用量是術(shù)中用量和PACU用量的總和;圍術(shù)期用量是指從手術(shù)開始至術(shù)后48 h的時(shí)間內(nèi)芬太尼用量總和。記錄出PACU、術(shù)后24 h和術(shù)后48 h VAS評(píng)分。

主要終點(diǎn)指標(biāo)為拔除氣管導(dǎo)管前患者自主呼吸頻率穩(wěn)定在≤10次/分;次要終點(diǎn)指標(biāo)為患者出PACU時(shí)VAS評(píng)分<4分。

2 結(jié) 果

2.1待選基因多態(tài)性分布情況 待選基因在101例入組患者中的分布情況:CYP3A4*1G GG野生型50例(49.50%)、GA雜合子38例(37.62%)、AA純合子13例(12.88%);CYP3A5*3 AA野生型12例(11.88%)、AG雜合子44例(43.56%)、GG純合子45例(44.56%);OPRM1 A118G AA野生型2例(1.98%)、GA雜合子14例(13.86%)、GG純合子85例(84.16%);COMT Val158Met GG野生型53例(52.48%)、GA雜合子43 例(42.57%)、AA純合子5例(4.95%)。

2.2等位基因頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 在入組患者中分析CYP3A4*1G、CYP3A5*3、OPRM1 A118G和COMT Val158Met等位基因頻率,抽樣樣本符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 101例患者的等位基因頻率(%)

2.3CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met和OPRM1 A118G不同基因型患者芬太尼用量比較 在101例入組患者中,分析CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met和OPRM1 A118G不同基因型患者在術(shù)中、PACU、手術(shù)室、術(shù)后第1天、術(shù)后第2天、圍術(shù)期的芬太尼用量差異。結(jié)果顯示:(1)CYP3A4*1G不同基因型患者PACU芬太尼用量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),組間兩兩比較顯示GG基因型PACU芬太尼用量高于AA基因型和GA基因型(P<0.05),見(jiàn)表3。(2)OPRM1 A118G AA +GA基因型與GG基因型患者術(shù)后第2天芬太尼用量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),AA+GA基因型患者術(shù)中、PACU、手術(shù)室、術(shù)后第1天、圍術(shù)期的芬太尼用量高于GG基因型患者,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4。(3)CYP3A5*3不同基因型患者PACU芬太尼用量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035),組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)GG基因型和GA基因型患者PACU芬太尼用量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表5。(4)COMT Val158Met不同基因型患者在術(shù)中、PACU、手術(shù)室、術(shù)后第1天、術(shù)后第2天、圍術(shù)期芬太尼用量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表6。

表3 不同時(shí)間CYP3A4*1G不同基因型患者芬太尼用量比較[M(P25,P75),μg]

表4 不同時(shí)間OPRM1 A118G不同基因型患者芬太尼用量比較[M(P25,P75),μg]

表5 不同時(shí)間CYP3A5*3不同基因型患者芬太尼用量比較[M(P25,P75),μg]

表6 不同時(shí)間COMT Val158Met不同基因型患者芬太尼用量比較[M(P25,P75),μg]

2.4出PACU時(shí)不同VAS評(píng)分患者的一般資料、芬太尼用量及不同基因分型比較 出PACU時(shí)VAS評(píng)分<4分92例,≥4分9例。術(shù)中、PACU、手術(shù)室的芬太尼用量在出PACU時(shí)VAS評(píng)分<4分與≥4分患者間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),OPRM1 A118G GG基因型與AA+GA基因型比例在出PACU時(shí)VAS評(píng)分<4分和≥4分患者間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表7。

表7 出PACU時(shí)不同VAS評(píng)分患者的一般資料、芬太尼用量及不同基因分型比較或n(%)或M(P25,P75)]

2.5出PACU時(shí)不同VAS評(píng)分與患者的一般資料、芬太尼用量及多個(gè)基因分型的相關(guān)性分析 患者出PACU時(shí)VAS評(píng)分與PACU、手術(shù)室的芬太尼用量及OPRM1 A118G基因型呈正相關(guān)(r=0.598、0.220、0.426,P<0.05),見(jiàn)表8。

表8 出PACU時(shí)不同VAS評(píng)分與患者的一般資料、芬太尼用量及基因型的相關(guān)性分析

2.6影響出PACU時(shí)VAS評(píng)分的多因素分析 從表8中選取P<0.05的指標(biāo)進(jìn)行影響出PACU時(shí)VAS評(píng)分的多因素分析。由表9可知,OPRM1 A118G基因型和PACU芬太尼用量是出PACU時(shí)VAS評(píng)分的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。在沒(méi)有其他因素的影響下,攜帶OPRM1 A118G A等位基因的患者,VAS評(píng)分顯著高于突變純合子(GG型)。同時(shí),PACU芬太尼的用量越高,VAS評(píng)分越高。

表9 影響出PACU時(shí)VAS評(píng)分的多因素分析

2.7CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met和OPRM1 A118G不同基因型與術(shù)后24 h和48 h VAS評(píng)分的相關(guān)性分析 由表10可知,CYP3A5*3 GG基因型與AA+GA基因型患者的24 h VAS評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示,CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met和OPRM1 A118G不同基因型與術(shù)后24 h、48 h VAS 評(píng)分無(wú)相關(guān)性(P>0.05),見(jiàn)表11。

表10 CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met和OPRM1 A118G不同基因型患者術(shù)后24 h和48 h VAS評(píng)分比較[n(%)]

表11 CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met、OPRM1 A118G基因型與術(shù)后24 h和48 hVAS評(píng)分的相關(guān)性分析

3 討 論

隨著基因技術(shù)的進(jìn)步和麻醉藥物的深入研究,越來(lái)越多的研究表明,基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致同一種麻醉劑對(duì)不同人群和個(gè)體產(chǎn)生不同的影響[7]。不同人群和個(gè)體之間的基因多態(tài)性導(dǎo)致藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、靶受體和代謝酶功能的差異,從而影響麻醉藥物的效果[8]。本研究選擇了參與芬太尼作用和代謝機(jī)制的關(guān)鍵基因進(jìn)行研究,從單核苷酸多態(tài)性的角度,探討了基因型對(duì)麻醉效果的影響,試圖為臨床實(shí)施精確麻醉提供依據(jù),并根據(jù)患者不同基因組的特點(diǎn)合理用藥,以提高療效、降低和預(yù)防藥物不良反應(yīng)。

本研究中101例患者待選基因(CYP3A4*1G、CYP3A5*3、COMT Val158Met和OPRM1 A118G)的等位基因頻率遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)P>0.05,說(shuō)明抽樣樣本符合Hardy-Weinberg平衡定律,來(lái)自一個(gè)較大的、處于隨機(jī)婚配平衡狀態(tài)的群體,具有代表性。CYP3A5*3和COMT Val158Met等位基因頻率和SNPedia數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果基本一致,OPRM1 A118G野生型等位基因A的頻率顯著高于高加索人群和非洲人群。OPRM1 A118G和CYP3A4*1G等位基因突變頻率在不同人種中差異較大,在我國(guó)漢族人群中的報(bào)道不一。

本研究采用VAS評(píng)分評(píng)估患者手術(shù)期間的疼痛程度[9]。VAS是一種簡(jiǎn)單、有效的疼痛評(píng)估方法,可以客觀、準(zhǔn)確地評(píng)估疼痛,減少因夸大或忽視因素而導(dǎo)致的偏差,從而提高疼痛評(píng)估的準(zhǔn)確性。研究表明,OPRM1 A118G不同基因型患者術(shù)后第2天的芬太尼用量有差異,A等位基因的攜帶者需更多芬太尼才能達(dá)到相似的麻醉效果。OPRM1 A118G基因型和PACU芬太尼用量是出PACU時(shí)VAS評(píng)分≥4分的獨(dú)立影響因素,OPRM1 A118G A等位基因攜帶者VAS評(píng)分更高。本研究結(jié)果提示芬太尼用量和OPRM1 A118G基因型的相關(guān)性并不顯著,這可能是由于研究隊(duì)列的規(guī)模較小,導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定造成的。在后續(xù)研究中,本研究團(tuán)隊(duì)將通過(guò)擴(kuò)大研究隊(duì)列來(lái)持續(xù)關(guān)注OPRM1基因?qū)Ψ姨嵊昧康挠绊憽?/p>

芬太尼是臨床常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥物,主要作用于 δ、κ 及 μ 3 種阿片受體。其中,μ受體是主要的阿片類受體亞型之一,是內(nèi)源性和外源性阿片物質(zhì)鎮(zhèn)痛、耐受、依賴等效應(yīng)的關(guān)鍵性靶點(diǎn),由 μ 受體基因(OPRM1) 編碼。A118G單核苷酸多態(tài)性是OPRM1基因最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)。受體突變后與β-內(nèi)啡肽的親和力增強(qiáng),從而影響阿片類藥物的受體作用[10]。相對(duì)于突變型純合子(GG型),攜帶A等位基因的患者表現(xiàn)出對(duì)阿片類藥物反應(yīng)降低,可能需要更多的阿片類藥物進(jìn)行鎮(zhèn)痛。本研究中OPRM1 A118G 基因型對(duì)疼痛敏感性的影響與ZHANG等[11]的研究結(jié)果相似,A等位基因攜帶者對(duì)于疼痛更為敏感。但也有文獻(xiàn)報(bào)道OPRM1 A118G 基因型對(duì)疼痛敏感性幾乎沒(méi)有影響[12]。

另一個(gè)與阿片類藥物有關(guān)的指標(biāo)是人體肝臟內(nèi)含量豐富的細(xì)胞色素P450酶(CYP450),有研究報(bào)道CYP3A4、CYP3A5基因多態(tài)性在一些阿片類藥物的代謝方面發(fā)揮重要作用。CYP450主要存在于肝臟微粒體中,它是由一組結(jié)構(gòu)和作用相似的同工酶組成的B族細(xì)胞色素酶系。CYP3A4是CYP基因家族最重要的成員之一,在芬太尼代謝中發(fā)揮了重要作用,其編碼序列發(fā)生單核苷酸多態(tài)性會(huì)改變酶的活性,從而影響芬太尼在肝臟中的烷基化過(guò)程[13]。攜帶CYP3A4*1G的受試者血藥濃度增加,麻醉效果增強(qiáng),鎮(zhèn)痛維持時(shí)間更久。因此,CYP3A4酶活性和芬太尼代謝顯著相關(guān),不同基因型受試者芬太尼用量存在明顯差異[14]。本研究在基因型和芬太尼用量關(guān)系的分析中也發(fā)現(xiàn)攜帶CYP3A4*1G野生型的患者,相比攜帶突變基因的患者疼痛敏感度升高,在PACU的疼痛管理中,需消耗更多的芬太尼才能獲得相同的麻醉效果。本研究與ZHANG等[15]的報(bào)道是一致的,攜帶CYP3A4*1G基因的患者術(shù)后芬太尼用量較少,這可能是由于CYP3A4*1G第82266位的2個(gè)等位基因堿基突變導(dǎo)致CYP3A4編碼蛋白的代謝活性降低,從而使芬太尼鎮(zhèn)痛效應(yīng)增強(qiáng)。

有文獻(xiàn)報(bào)道CYP3A5酶參與芬太尼代謝,影響芬太尼通過(guò)腎臟代謝的速率[16]。CYP3A5*3是最常見(jiàn)的突變類型,基因突變后會(huì)導(dǎo)致編碼的蛋白活性發(fā)生10～40倍的差異。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)在PACU芬太尼用量中,GG基因型患者用量高于GA基因型,可能和CYP3A5參與了芬太尼代謝有關(guān)。但是,張衛(wèi)等[17]在2009年的一項(xiàng)研究中報(bào)道CYP3A5*3基因多態(tài)性不是芬太尼靜脈鎮(zhèn)痛效應(yīng)個(gè)體差異的遺傳因素。目前關(guān)于CYP3A5影響芬太尼代謝的觀點(diǎn)仍有爭(zhēng)議。

本研究的局限性在于待選基因尚不全面,ABCB1 C3435T等基因多態(tài)性與芬太尼用量和麻醉耐受性有關(guān)[18]。此外,由于研究隊(duì)列的規(guī)模有限,本研究無(wú)法創(chuàng)建獨(dú)立的驗(yàn)證集,還需在未來(lái)更大樣本量的隊(duì)列中作進(jìn)一步的研究。術(shù)后并發(fā)癥也與疼痛管理密切相關(guān)[19]。BOSTR?M等[20]的研究揭示吻合口瘺是PACU患者疼痛增加的獨(dú)立影響因素。本研究?jī)H關(guān)注短期預(yù)后,術(shù)后隨訪僅限于48 h;吻合口瘺、TNM分期、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等長(zhǎng)期因素未納入患者的基本特征進(jìn)行分析。這些局限性在一定程度上削弱了本文的臨床價(jià)值和適用性。在未來(lái)的研究中,筆者將重點(diǎn)關(guān)注術(shù)后疼痛程度與更多臨床參數(shù)、并發(fā)癥以及不良反應(yīng)發(fā)生率之間的相關(guān)性。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),CYP3A4*1G、CYP3A5*3、OPRM1 A118G基因型與芬太尼用量存在一定關(guān)系。OPRM1 A118G基因型是出PACU時(shí)VAS評(píng)分的獨(dú)立影響因素。術(shù)后24 h和48 h VAS評(píng)分與CYP3A4*1G、CYP3A5*3、OPRM1 A118G基因型無(wú)相關(guān)性。術(shù)前檢測(cè)麻醉藥物代謝或效應(yīng)相關(guān)基因型可為臨床推進(jìn)精準(zhǔn)化的麻醉管理提供實(shí)驗(yàn)室支持。