王鵬，李雯，王悅，武志鑫，臺(tái)蓮梅，靳學(xué)慧，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/黑龍江省作物有害生物互作生物學(xué)及生態(tài)防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319；2.黑龍江省植物抗性研究中心）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）種植面積廣，適應(yīng)性強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，能夠滿足人體營(yíng)養(yǎng)需求，深受人們喜愛。隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，出現(xiàn)倒茬困難和連作障礙問題，這使馬鈴薯土傳病害日益加重[1]。由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的馬鈴薯黑痣病是馬鈴薯主要的土傳病害，也是世界性土傳真菌病害[2]。病原菌寄主范圍廣泛，已知可侵染200 多種植物[3]。病菌以菌絲體或菌核在馬鈴薯塊莖、病殘?bào)w或土壤中越冬，主要危害馬鈴薯根莖、匍匐莖和薯塊，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可影響馬鈴薯出苗率和產(chǎn)量[4]。在國(guó)內(nèi)每年多省份均有不同程度發(fā)生，重病田病株率高達(dá)80%以上，病害制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。長(zhǎng)期以來(lái)，防治馬鈴薯黑痣病主要依靠化學(xué)藥劑，而化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用會(huì)影響土壤質(zhì)量、農(nóng)作物生產(chǎn)力、藥劑殘留等問題[6]。因此，需要尋找對(duì)環(huán)境、人類以及作物本身更安全的方法，利用微生物防治土傳病害具有對(duì)環(huán)境安全、投入低、資源充足等特點(diǎn)，是解決這些問題的有效途徑[7]。

目前，國(guó)內(nèi)外已有不少學(xué)者對(duì)生防菌防治土傳病害進(jìn)行研究，使用生防微生物防治馬鈴薯黑痣病已經(jīng)成為當(dāng)下熱點(diǎn)。Hussain 等[8]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以產(chǎn)生蛋白酶，能夠降解病原體細(xì)胞壁，降低病原體生長(zhǎng)或感染植物的能力，減輕馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。王天君等[9]從17 株木霉菌中篩選得到一株擬康寧木霉（Trichoderma pseudokoningii）78 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)立枯絲核菌的抑制率為92.90%，利用木霉菌劑處理薯塊，顯著降低馬鈴薯黑痣病的病情指數(shù)，盆栽試驗(yàn)防效達(dá)59.07%～70.11%。芽孢桿菌因其能形成芽孢，對(duì)外界抵抗能力強(qiáng)，并且分布廣，在植物病害防治上具有巨大潛力，因此成為研發(fā)微生物殺菌劑的重要資源。關(guān)小敏等[10]從甘肅省連作馬鈴薯田分離得到一株類芽孢桿菌（Paenibacillus jamilae）G1 對(duì)馬鈴薯黑痣病菌有較強(qiáng)的拮抗效果。朱明明等[11]從河北省和內(nèi)蒙古馬鈴薯根際土中分離得到141 株芽孢桿菌，其中貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HN-Q-8 發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黑痣病防效最強(qiáng)，該菌株在15 ℃以上就可以對(duì)病原菌起到抑制作用。許麗婷等[12]從馬鈴薯根際土壤分離篩選得到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XC-1 并分析了該菌株的生防特性，該菌株可以產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶抑制病原菌的生長(zhǎng)，小區(qū)試驗(yàn)，XC-1 對(duì)馬鈴薯黑痣病的防效達(dá)54.51%，增產(chǎn)22.02%。而黑龍江省此方面的研究報(bào)道較少，另外，地域不同，同種微生物所處環(huán)境條件不同，其防治效果和機(jī)理也不同[13-14]。

因此，從馬鈴薯黑痣病發(fā)病的連作田取樣，通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)篩選獲得對(duì)黑痣病菌有較好的拮抗菌株，進(jìn)一步盆栽試驗(yàn)確定其防效，鑒定其分類地位，為防治馬鈴薯黑痣病的生物菌劑研發(fā)提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試品種：延薯4 號(hào)（原種2 代），由訥河市鑫豐種業(yè)有限公司提供。

1.2 供試病原菌

病原真菌：立枯絲核菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 供試培養(yǎng)基

LB、NA、PDA、PDB 培養(yǎng)基參照《植病研究法》進(jìn)行配置[15]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌的分離和純化

采用土壤稀釋法分離細(xì)菌（土樣采集自黑龍江省克山農(nóng)場(chǎng)馬鈴薯黑痣病發(fā)病地塊根際土），吸取100 μL 土壤懸浮液涂布到LB 平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d。挑選不同菌落形態(tài)、顏色和大小，平板劃線純化培養(yǎng)后編號(hào)保存。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的篩選及病原菌菌絲形態(tài)觀察

首先進(jìn)行拮抗細(xì)菌初篩，PDA 培養(yǎng)基中心接種5 mm 活化好的黑痣病菌，十字交叉法接種待測(cè)菌株。每處理3 次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3 d，將對(duì)黑痣病菌有抑菌圈的細(xì)菌菌株進(jìn)一步復(fù)篩。

復(fù)篩采用平板對(duì)峙法。將初篩獲得的菌株劃線活化，取單菌落接種于LB 培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 d，將菌液調(diào)至OD600=0.8 備用。PDA 培養(yǎng)基中心接種5 mm 黑痣病菌，十字交叉法接種待測(cè)菌株菌液5 μL，接無(wú)菌水為對(duì)照，每處理3 次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3 d。將抑制效果最好的拮抗菌株保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)，利用顯微鏡觀察拮抗效果最好的菌株在峙平板上對(duì)馬鈴薯黑痣病菌菌絲的影響。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.4.3 拮抗細(xì)菌分泌胞外酶測(cè)定

拮抗菌株分泌纖維素酶的測(cè)定參考穆春雷[16]的方法；拮抗菌株分泌蛋白酶的測(cè)定參考尹春筱[17]的方法；拮抗菌株分泌葡聚糖酶的測(cè)定參考趙軍崗[18]的方法。

1.4.4 拮抗菌株對(duì)馬鈴薯黑痣病盆栽防效的測(cè)定

在室外條件下采用桶栽接種測(cè)定菌株對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果。選取大小一致健康馬鈴薯種薯，切成大小相近的薯塊備用。將活化好的立枯絲核菌10 個(gè)菌餅（5 mm）接種至PDB 培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)7 d，利用豆?jié){機(jī)將菌落打散，調(diào)節(jié)濃度為1×103cfu·mL-1備用。將拮抗菌株單菌落接種于LB 培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 d，調(diào)節(jié)拮抗菌濃度為1×108cfu·mL-1備用。用口徑20 cm、深25 cm的桶種植馬鈴薯，每桶裝土15 kg，將150 mL 立枯絲核菌菌懸液和土壤充分混合配成帶菌土。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下，處理1：每桶加入240 mL 無(wú)菌水為空白對(duì)照；處理2：每桶加入240 mL 無(wú)菌LB 培養(yǎng)液；處理3：每桶加入240 mL 的拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng)液。每桶種植3 塊馬鈴薯薯塊，每個(gè)處理5 桶，3 次重復(fù)。每桶播種出苗60 d 后調(diào)查發(fā)病情況，同時(shí)測(cè)量株高、莖粗、側(cè)根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、匍匐莖數(shù)，并計(jì)算防效。

馬鈴薯黑痣病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Weinhold[19]地下莖分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=Σ（發(fā)病株數(shù)×發(fā)病級(jí)別/調(diào)查總株數(shù)×最高發(fā)病級(jí)別）×100

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.4.5 拮抗菌株的鑒定

將拮抗菌株劃線接種至NA 平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)，并參照東秀珠和劉波等[20-21]描述進(jìn)行生理生化特征鑒定。

采用北京天根生化科技有限公司的試劑盒提取菌體DNA；參考陳志垚等[22]擴(kuò)增16S rRNA 基因，PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離篩選及病原菌菌絲形態(tài)觀察

從馬鈴薯根際土樣中分離得到303 株細(xì)菌，最終篩選出一株細(xì)菌菌株對(duì)立枯絲核菌抑制效果最好，抑制率達(dá)78.91%（圖1B），將其編號(hào)為KSD17。顯微鏡觀察，CK 對(duì)照菌絲表面光滑、勻稱，內(nèi)容物均勻（圖1C）；菌株KSD17 處理過(guò)的菌絲膨大、彎曲、表面干癟、皺縮，內(nèi)容物不均勻（圖1D）。

圖1 菌株KSD17 對(duì)立枯絲核菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of strain KSD17 on Rhizoctonia solani

2.2 拮抗菌株KSD17 胞外酶測(cè)定

對(duì)菌株KSD17 產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶及β-1，3-葡聚糖的能力進(jìn)行測(cè)定（圖2）。菌株KSD17 在羧甲基纖維素酶鑒別培養(yǎng)基和蛋白酶鑒別培養(yǎng)基中產(chǎn)生明顯的水解圈（圖2A，B），在β-1，3-葡聚糖檢測(cè)培養(yǎng)基中產(chǎn)生較小的水解圈（圖2C）。說(shuō)明該菌株具有產(chǎn)羧甲基纖維素酶、蛋白酶能力以及β-1，3-葡聚糖的能力。

圖2 菌株KSD17 在鑒定培養(yǎng)基上的透明圈Fig.2 The transparent circle of strain KSD17 on the identification medium

2.3 拮抗菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯黑痣病的盆栽防效

采用盆栽試驗(yàn)進(jìn)行了菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯黑痣病的防效試驗(yàn)。結(jié)果表明，CK 空白對(duì)照和LB 培養(yǎng)液對(duì)照處理的馬鈴薯地下莖發(fā)病重，發(fā)病率分別為98.33%、95.00%，病情指數(shù)分別為59.11、64.00，處理間差異不顯著，但顯著高于菌株KSD17 發(fā)酵液處理的病情指數(shù)（P＜0.05）（表1）。CK 空白對(duì)照和LB 培養(yǎng)液處理馬鈴薯植株莖部出現(xiàn)大面積褐色病斑，病害程度比較嚴(yán)重（圖3）。 KSD17 發(fā)酵液處理黑痣病發(fā)病率為56.67%，病情指數(shù)20.00，菌株KSD17 對(duì)黑痣病的防效為66.17%。說(shuō)明菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯黑痣病有較好的防治效果。

表1 菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯黑痣病的盆栽防效Table 1 Determination of potted control effect of strain KSD17 against potato black scurf

圖3 菌株KSD17 的盆栽防效Fig.3 Determination of potted control effect of strain KSD17

2.4 拮抗菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯植株生長(zhǎng)的影響

拮抗細(xì)菌對(duì)馬鈴薯形態(tài)指標(biāo)的影響，LB 培養(yǎng)液和CK 空白對(duì)照對(duì)馬鈴薯植株形態(tài)指標(biāo)差異不顯著（P＜0.05）（表2）。但菌株KSD17 處理的株高和匍匐莖較CK 差異顯著，分別增加了9.05%和22.04%。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯的生長(zhǎng)具有促生作用。

表2 菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯形態(tài)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of strain KSD17 on morphological indicators of potato

2.5 拮抗菌株KSD17 的鑒定

2.5.1 拮抗菌株KSD17 的形態(tài)及生理生化特性鑒定

菌株KSD17 在NA 培養(yǎng)基上呈乳白色，菌落表面無(wú)褶皺，邊緣不規(guī)則，挑起菌落時(shí)較為粘稠、無(wú)色素產(chǎn)生（圖4A）。經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌株KSD17 菌體呈桿狀，有芽孢（圖4B）。

圖4 菌株KSD17 的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of strain KSD17

測(cè)定菌株KSD17 的生理生化特性的檢測(cè)結(jié)果（表3）。菌株KSD17 厭氧或兼性厭氧生長(zhǎng)，氧化酶活性反應(yīng)為陽(yáng)性，不產(chǎn)生硫化氫氣體；在高于5% NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受抑制；水解淀粉成陽(yáng)性；菌株能利用葡萄糖、D-果糖、蔗糖、甘露醇且產(chǎn)酸；吲哚反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P 反應(yīng)、MR 反應(yīng)均呈陽(yáng)性；脲酶、檸檬酸鹽反應(yīng)、丙二酸鹽反應(yīng)、精氨酸雙水解酶、明膠反應(yīng)呈陰性。

表3 菌株KSD17 的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain KSD17

通過(guò)菌株KSD17 菌落形態(tài)和生理生化特征與布坎南、東秀珠和劉波等所列出的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）描述一致。

2.5.2 拮抗菌株KSD17 的分子生物學(xué)鑒定

拮抗菌株KSD17 經(jīng)PCR 擴(kuò)增，獲得16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 420 bp（登錄號(hào)MV821402）。經(jīng)BLAST 進(jìn)行同源性比對(duì)，菌株KSD17 與多粘類芽孢桿菌相似度最高達(dá)99.15%，下載與KSD17 相似率高且有代表性的菌株。采用Mega7.0 軟件進(jìn)行遺傳距離分析，KSD17 菌株與多粘類芽孢桿菌聚在一個(gè)分支（圖5）。再結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化指標(biāo)測(cè)定，最終將菌株KSD17 鑒定為多粘類芽孢桿菌。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree

3 討論

研究從馬鈴薯根際土中分離得到多株細(xì)菌，通過(guò)平板對(duì)峙篩選得到菌株KSD17 對(duì)馬鈴薯黑痣病菌拮抗效果最好。菌株可以使立枯絲核菌菌絲膨大、彎曲、表面干癟、皺縮，平板抑制率達(dá)78.91%，盆栽試驗(yàn)表明，KSD17 發(fā)酵液接種量240 mL 時(shí)對(duì)馬鈴薯黑痣病防治效果達(dá)66.17%，并促進(jìn)馬鈴薯植株株高生長(zhǎng)和匍匐莖數(shù)量，較CK 分別增加9.05%和22.04%。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA 鑒定，將菌株KSD17 鑒定為多粘類芽孢桿菌。

生防菌株能夠分泌水解酶類物質(zhì)抑制或消除病原真菌。其中，羧甲基纖維酶和蛋白酶能夠水解病原真菌細(xì)胞壁，而β-1，3-葡聚糖酶能夠水解真菌侵染過(guò)程形成的芽管，芽管最外層的結(jié)構(gòu)胞壁主要成分為葡聚糖[23]。Kim 等[24]從果樹根際土壤中分離得到一株多粘類芽孢桿菌APEC136，對(duì)蘋果炭疽病和白腐病具有很好的防治效果，菌株具有較高的蛋白酶活性，但纖維酶活性較低。Prapagdee[25]研究表明β-1，3-葡聚糖酶通過(guò)水解或抑制膠孢炭疽菌和齊整小核菌細(xì)胞壁β-1，3-葡聚糖的合成，從而抑制其病原菌生長(zhǎng)。研究獲得的多粘類芽孢桿菌KSD17 菌株能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶，這可能是抑制馬鈴薯黑痣病菌機(jī)理之一，其產(chǎn)生羧甲基纖維素酶和蛋白酶的活力均較強(qiáng)，產(chǎn)生β-1，3-葡聚糖酶的活力較低。

關(guān)于多粘類芽孢桿菌的防治土傳病害已有一些報(bào)道。黃藝爍等[26]通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多粘類芽胞桿菌ZF197 可以在發(fā)生白菜莖基腐病的土壤中定值，顯著降低白菜莖腐病病情指數(shù)，其防效達(dá)78.57%。張亮等[27]研究多粘類芽孢桿菌可以在發(fā)生番茄青枯病的土壤中定值，顯著降低青枯病菌（Ralstonia solanacearum）豐富度。在分析菌株KSD17 拮抗效果的基礎(chǔ)上，通過(guò)室外盆栽試驗(yàn)表明，菌株KSD17 處理對(duì)馬鈴薯黑痣病有較好的防效，達(dá)66.17%，推測(cè)多粘類芽胞桿菌KSD17 能在馬鈴薯根際土中定植。菌株KSD17 處理后對(duì)馬鈴薯植株株高和匍匐莖均顯著提高；側(cè)根數(shù)較CK 降低了26.65%。這與孫中華等[28]研究相類似，使用5%～20%枯草芽孢桿菌B67 菌液處理均能黃瓜幼苗莖粗、株高、根長(zhǎng)和根管比均顯著性增加，使用超過(guò)20%菌液濃度使黃瓜幼苗莖粗、株高、根長(zhǎng)和根管比顯著下降。菌株KSD17 的應(yīng)用最適濃度還需要進(jìn)一步探索。多粘類芽孢桿菌KSD17能顯著降低馬鈴薯黑痣病發(fā)生，是一株具有開發(fā)潛力的生防菌，將對(duì)馬鈴薯黑痣病的綠色防控具有重要意義。

4 結(jié)論

從采集馬鈴薯根際土中分離得到一株多粘類芽孢桿菌KSD17，促進(jìn)馬鈴薯植株生長(zhǎng)，有效防治馬鈴薯黑痣病的發(fā)生，是一株具有較強(qiáng)開發(fā)潛力的生防菌。