李巖 李成明 張明童 李冬華 馬瀟

【摘 要】 目的：建立同時(shí)測(cè)定宣肺止嗽合劑中4種生物堿含量的高效液相色譜分析方法。方法：色譜柱為安捷倫SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙睛-0.1%磷酸溶液（3∶97）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果：?jiǎn)岱?、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿4種生物堿成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.9960，平均回收率分別為97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，對(duì)應(yīng)的 RSD 分別為 1.2%、1.2%、1.6%、1.4%（n=9）。10批宣肺止嗽合劑樣品中嗎啡的含量為0.078～0.160 mg·mL-1、磷酸可待因的含量為0.008～0.025 mg·mL-1、蒂巴因的含量為0.0002～0.0013 mg·mL-1、鹽酸罌粟堿的含量為0.010～0.025 mg·mL-1。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于宣肺止嗽合劑的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 宣肺止嗽合劑；嗎啡；磷酸可待因；蒂巴因；鹽酸罌粟堿；含量測(cè)定；高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）01-0043-05

Determination of Four Alkaloids in Xuanfei Zhisuo Mixture

LI Yan1 LI Chengming2 ZHANG Mingtong3* LI Donghua3 MA Xiao3

1. Audit and inspection center of Gansu Drug Administration， Lanzhou 730050， China

Technology Engineering Laboratory， National Medical Products Administration Key Laboratory of

Quality Control of Chinese Medicinal Materials and Decoction Pieces）， Lanzhou 730070， China;

2. Department of Pharmacy， Gansu Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China;

3.Gansu Provincial Institute of Drug Inspection （Gansu Provincial Chinese and Zang Medicine Inspection and Testing

Abstract：Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of four alkaloids in Xuanfei Zhisuo mixture. Methods Chromatographic column： Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;mobile phase： ethylene-0.1% phosphoric acid solution （3∶97）， detection wavelength： 210 nm;Flow rate： 1.0 mL·min-1;column temperature：30 ℃;injection volume：10 μL. Results The linearity of morphine， codeine phosphate， tibaine and papaverine hydrochloride in the range of their respective mass concentrations was good with correlation coefficient r ≥0.9960. The average recoveries were 97.8%， 96.9%， 97.4% and 97.5%， respectively.The corresponding RSD were 1.2%， 1.2%， 1.6%， 1.4% （n=9）.The contents of morphine， codeine phosphate， dibaine and papaverine hydrochloride in 10 batches of Xuanfei Zhishou mixture were 0.078-0.160 mg·mL-1， 0.008-0.025 mg·mL-1， 0.0002-0.0013 mg·mL-1 and 0.010-0.025 mg·mL-1.Conclusion The method is simple and accurate， which can be used for the quality control of Xuanfei Zhisuo mixture and provide reference for the improvement of its quality standard.

Keywords：Xuanfei Zhisuo Mixture; Morphine;Codeine Phosphate;Tibaine;Papaverine Hydrochloride;Content Determination;HPLC

宣肺止嗽合劑收錄于2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中，由蜜罌粟殼、荊芥、前胡、桔梗等10味中藥組成，具有疏風(fēng)宣肺、止咳化痰之功，用于治療風(fēng)邪犯肺證咳嗽，癥見咳嗽、咽癢、鼻塞流涕、惡寒發(fā)熱、咯痰［1］。該制劑中含有蜜罌粟殼，其主要成分為嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿等多種生物堿成分。嗎啡具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳和抑制呼吸等藥理作用［2-4］，磷酸可待因、蒂巴因和鹽酸罌粟堿也具有顯著的止咳、鎮(zhèn)痛作用［5］，說明罌粟殼是通過多種成分發(fā)揮作用。但是，嗎啡及其其他生物堿成分連續(xù)服用易產(chǎn)生依賴性、癮癖，超劑量使用會(huì)出現(xiàn)呃逆、呼吸困難、昏迷等中毒癥狀。因此，為了確保制劑的安全性及有效性，需要確定可供質(zhì)量控制的特征成分，制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。2020年版《中國(guó)藥典》（一部）對(duì)宣肺止嗽合劑含量測(cè)定項(xiàng)中，采用高效液相色譜（HPLC）法控制蜜罌粟殼中的嗎啡含量，且前處理過程繁瑣、費(fèi)時(shí)，并易造成樣品中生物堿的損失，同時(shí)由于樣品中嗎啡含量較低，其他成分對(duì)其影響較大。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定宣肺止嗽合劑中4種生物堿（嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿）含量，以完善、提升宣肺止嗽合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；ME24-102型萬分之一電子天平、XS205DU十萬分之一型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 嗎啡對(duì)照品（批號(hào)：171201-201324，含量≥93.9%）、磷酸可待因（批號(hào)：171203-200303，含量≥96.9%）、蒂巴因（批號(hào)：171216-200403，含量100.0%）、鹽酸罌粟堿（批號(hào)：171214-200404，含量≥99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，甲醇為分析純，水為超純水。宣肺止嗽合劑10批（甘肅普安制藥有限公司提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取嗎啡0.01130 g、磷酸可待因0.01047 g，蒂巴因0.01660 g、鹽酸罌粟堿0.01088 g，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲使其溶解，并定容至刻度，搖勻，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。再各取適量置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得含嗎啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、蒂巴因0.3220 μg·mL-1、鹽酸罌粟堿0.5217 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密量取宣肺止嗽合劑樣品1 mL，用氨試液10 mL調(diào)節(jié)pH值至10～11，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，搖勻，即得。同時(shí)制得空白對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：安捷倫SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙睛-0.1%磷酸溶液（3∶97）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖如圖1所示。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇溶液配制成嗎啡含量為0.849 μg·mL-1、1.698 μg·mL-1、3.395 μg·mL-1、8.489 μg·mL-1、16.977 μg·mL-1、84.886 μg·mL-1，磷酸可待因含量為0.203 μg·mL-1、0.406 μg·mL-1、0.812 μg·mL-1、2.029 μg·mL-1、4.059 μg·mL-1、20.293? μg·mL-1，蒂巴因含量為0.033 μg·mL-1、0.066 μg·mL-1、0.133 μg·mL-1、0.332 μg·mL-1、0.664 μg·mL-1、3.320 μg·mL-1，鹽酸罌粟堿含量為0.052 μg·mL-1、0.104 μg·mL-1、0.209 μg·mL-1、0.522 μg·mL-1、1.043 μg·mL-1、5.217 μg·mL-16個(gè)梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，分別進(jìn)樣10 μL。按外標(biāo)兩點(diǎn)法，以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg·mL-1）為縱坐標(biāo)，得出4種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)r2及線性范圍，結(jié)果表明，各成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見表1。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為嗎啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、帝巴因0.3320 μg·mL-1、鹽酸罌粟堿0.5217 μg·mL-1混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值的RSD在0.22%～0.45%，表明儀器精密度良好。見表2。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)1的供試品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，分別測(cè)定并計(jì)算各成分的含量。測(cè)定結(jié)果RSD在1.35%～2.11%，表明方法重復(fù)性良好。見表2。

2.3.4 穩(wěn)定性考試驗(yàn) 取編號(hào)1的供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得各成分的含量RSD在0.56%～0.65%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知4種生物堿含量的宣肺止嗽合劑（編號(hào)1）樣品9份，分3組，取樣量各為1 mL，精密加入低、中、高（0.5倍、1倍、1.5倍）3個(gè)濃度的混合對(duì)照品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。詳見表3。嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿的平均加樣回收率分別為97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，RSD分別為1.2%、1.2%、1.6%、1.4%。

2.4 樣品的測(cè)定 取10批次宣肺止嗽合劑，分別精密量取2 mL，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿的含量。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件的優(yōu)化 本方法采用加濃氨試液，在堿性條件下將生物堿鹽轉(zhuǎn)變成游離生物堿，用水飽和的正丁醇提取，去除脂溶性雜質(zhì)，再用含5%磷酸的20%甲醇溶液提取。為了優(yōu)化提取的條件，以A（供試品溶液取樣量）、B（氨試液使用量）和C（水飽和正丁醇提取量）為3個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。各因素的3水平分別為：A（1 mL、2 mL、3 mL）;B（5 mL、10 mL、15 mL）;C（15 mL、25 mL、35 mL）。樣品液的制備：精密量取宣肺止嗽合劑樣品A取樣量，用氨試液提取量B調(diào)節(jié) pH 值至10～11，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次使用量C，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，搖勻，即得。經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液進(jìn)行測(cè)定分析。極差（R）結(jié)果表明，3個(gè)因素中樣品量對(duì)提取率影響最大，其次是氨試液提取量，影響最小的是樣品水飽和正丁醇提取量。試驗(yàn)表明，以宣肺止咳合劑取樣量為1 mL，加入氨試液10 mL后用25 mL水飽和正丁醇提取量條件最佳，提取率最高，故確定為供試品制備方法 。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 通過DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（200～400 nm），考察了4個(gè)組分的最大紫外吸收波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因都在210 nm波長(zhǎng)處有最大吸收、鹽酸罌粟堿250 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收，考慮可待因與蒂巴因含量較低，為獲得更大靈敏度，最終確定210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，四種生物堿均有良好的響應(yīng)，靈敏度較高。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)化 中國(guó)藥典選用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液-0.005 moL/L庚烷磺酸鈉溶液-乙腈（5∶5∶2）作為流動(dòng)相，考慮到庚烷磺酸鈉對(duì)色譜系統(tǒng)污染較大，并且樣品對(duì)色譜柱的要求較高。因此通過優(yōu)化方法降低了對(duì)色譜系統(tǒng)的污染。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料［6-10］，本實(shí)驗(yàn)主要考察了甲醇-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸的0.01 moL·L-1磷酸二氫鉀緩沖液、乙腈-0.1%甲酸的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液4種流動(dòng)相，結(jié)果表明，乙睛-0.1%磷酸溶液樣品中，雖然嗎啡和鹽酸罌粟堿的色譜峰出峰時(shí)間較為接近，但各色譜峰的分離度均大于1.5，且各色譜峰的峰形較好，故以此流動(dòng)相比例進(jìn)行測(cè)定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。

3.4 結(jié)果分析 10批宣肺止嗽合劑測(cè)定結(jié)果顯示，嗎啡的含量為0.078～0.160 mg·mL-1、磷酸可待因的含量為0.008～0.025 mg·mL-1、蒂巴因的含量為0.0002～0.0013 mg·mL-1、鹽酸罌粟堿的含量為0.010～0.025 mg·mL-1，且4種成分間存在一定的變化趨勢(shì)：即嗎啡含量高，其他3個(gè)成分的含量也隨之增加；可見《中國(guó)藥典》以嗎啡的含量測(cè)定對(duì)宣肺止嗽合劑質(zhì)量進(jìn)行控制，具有一定的意義，但不夠用全面。本研究建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定宣肺止嗽合劑中4種成分的含量測(cè)定方法，具有前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高的特點(diǎn)，為較為全面的控制宣肺止嗽合劑質(zhì)量，提供了數(shù)據(jù)支持，同時(shí)對(duì)修訂完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證藥品有效性和安全性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-05-09 編輯：陶希睿）