沈冰燕，王敏，方葉楠，代琴，謝琪琦，吳文燦

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)院（生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院），浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325027

外傷性視神經(jīng)病變（traumaticoptic neuropathy, TON）又稱視神經(jīng)損傷，主要是因顱腦及額面部遭受外力撞擊后直接或間接導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷，是一種重要的致盲性眼病，在頭面顱腦復(fù)合傷患者中的發(fā)病率為0.5%～5%[1-2]。因其損傷靶點明確、病程進(jìn)展快等特點常作為視神經(jīng)損傷研究的理想病種，目前尚無有效的治療方法[3]。既往研究[4-6]表明視神經(jīng)損傷后軸突再生修復(fù)困難，視神經(jīng)損傷導(dǎo)致軸突斷裂會引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells, RGCs）的凋亡[7-8]，且RGCs的損傷及丟失存在一定的時間累積效應(yīng)，因此對于視神經(jīng)損傷后不同時間點RGCs和軸突丟失情況的評估有利于治療時間的選擇。在本研究中，通過構(gòu)建小鼠視神經(jīng)鉗夾損傷（optic nerve crush,ONC）模型，探究視神經(jīng)損傷后不同時間的RGCs和軸突數(shù)量的動態(tài)變化，了解視神經(jīng)損傷的病理過程，從而進(jìn)一步尋找視神經(jīng)損傷后治療干預(yù)的適宜時機。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：20只SPF級健康C57BL/6J小鼠，1月齡，體質(zhì)量12～15 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2018-0017。

1.1.2 藥品與主要試劑：鹽酸塞拉嗪注射液 （2 mL/支）購自長春華牧動物保健品有限公司；舒泰?20購自法國維克公司；復(fù)方托吡卡胺滴眼液購自邯鄲康業(yè)制藥有限公司；鹽酸丙美卡因滴眼液購自德國愛爾康公司；氧氟沙星眼膏購自沈陽興齊制藥有限公司；4%多聚甲醛購自北京蘭杰柯科技有限公司；曲拉通X-100（Triton-X100）購自北京索萊寶科技有限公司；山羊血清購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；封閉液配置：Triton-X1000.05 mL， 山羊血清0.5 mL，加9.5 mL 0.01 mol/L PBS；RBPMs抗體、山羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司；2.5%戊二醛電鏡專用固定液購自福州飛凈生物科技有限公司；對苯二胺（PPD）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、丙酮與異丙醇購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器：顯微手術(shù)器械購自上海金鐘金屬制品廠；反向鑷購自瑞士Dumont公司；眼科手術(shù)顯微鏡購自德國徠卡公司；3D玻片掃描儀購自匈牙利3D HISTECH公司；活細(xì)胞轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司；小動物視網(wǎng)膜顯微成像系統(tǒng)購自上海輔光精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：1月齡C57BL/6J小鼠20只，隨機分為4組：一組為正常對照組，其余三組均為視神經(jīng)損傷組，分別為左眼視神經(jīng)損傷后3 d組、損傷后7 d組、損傷后14 d組，每組5只。

1.2.2 小鼠ONC模型的構(gòu)建：損傷組所有小鼠經(jīng)舒泰（175 mg/kg）及鹽酸塞拉嗪注射液（50 mg/kg）肌肉注射麻醉成功后，右側(cè)臥位置于手術(shù)顯微鏡的操作臺上。左眼為手術(shù)眼，10%碘伏常規(guī)消毒眼表與結(jié)膜囊，滴入鹽酸丙美卡因滴眼液行結(jié)膜角膜表面麻醉，鋪無菌洞巾，在顳側(cè)角鞏膜緣后約1.5 mm處用眼科剪剪開球結(jié)膜及下方筋膜組織，向后鈍性分離筋膜及肌肉，充分暴露后方的白色視神經(jīng)。由同一位手術(shù)操作者使用反向鑷于球后1 mm鉗夾視神經(jīng)10 s，眼表以及結(jié)膜囊內(nèi)涂氧氟沙星眼膏，注意造模過程中避免損傷血管。手術(shù)操作后的動物一般狀況良好，眼部無感染，眼底照相以及視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層（optical coherence tomography, OCT）成像見視網(wǎng)膜正?；蛴休p微水腫表現(xiàn)，無白內(nèi)障，無眼底出血者可視為造模成功，納入后續(xù)實驗。

1.2.3 視網(wǎng)膜全層與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞復(fù)合體（ganglion cell complex, GCC）層厚度測量：對正常對照組以及損傷后3、7、14 d的小鼠進(jìn)行麻醉，雙眼滴入復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后，采用小動物顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行雙眼眼底照相以及損傷眼的OCT成像，OCT圖像以視乳頭為中心，分別進(jìn)行水平掃描和環(huán)形掃描。利用insight軟件對OCT圖像進(jìn)行半自動分層，分劃出GCC以及視網(wǎng)膜全層，利用軟件直接導(dǎo)出厚度數(shù)據(jù)。

1.2.4 小鼠視神經(jīng)及視網(wǎng)膜取材：對正常對照組以及損傷后3、7、14 d的小鼠進(jìn)行深度麻醉，頸椎脫臼法處死，切斷頭頸部，將頭放置在冰上，完全暴露白色視神經(jīng)及視交叉，用眼科剪從視交叉前腳處離斷視神經(jīng)，分別取出小鼠雙側(cè)眼球和左側(cè)視神經(jīng)。

1.2.5 視網(wǎng)膜鋪片與組織免疫熒光染色：眼球利用1 mL針頭于角鞏膜緣穿孔，浸入4%多聚甲醛中固定12 h，用眼科剪沿著角鞏膜緣剪去角膜，去除晶狀體和玻璃體后，置入4%多聚甲醛中固定1 h，視網(wǎng)膜經(jīng)5%山羊血清封閉液封閉12 h后，浸入以0.01 mol/L PBS按1:400稀釋的RBPMs抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。洗滌后加入1:400稀釋的山羊抗兔二抗，避光室溫孵育2 h，洗滌后將視網(wǎng)膜平均剪成四瓣，并展平置于載玻片上，自然干燥后封片，活細(xì)胞轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡下觀察RGCs的分布與數(shù)量。以視乳頭為中 心，將視網(wǎng)膜從內(nèi)至外區(qū)域分劃三等分（紅色虛線圈）。在“四葉草”狀的視網(wǎng)膜上，每一瓣上的每一區(qū)域選定1 mm2面積區(qū)域（正方形）拍攝并計數(shù)RGCs數(shù)量。同一種顏色的正方形代表其所處于同一區(qū)域（見圖1），使用ImageJ軟件計數(shù)視網(wǎng)膜不同區(qū)域的RGCs數(shù)量。

圖1 小鼠視網(wǎng)膜鋪片區(qū)域分劃模式圖

1.2.6 軸突電鏡與PPD染色：取正常對照組及損傷組小鼠鉗夾損傷后3、7、14 d損傷灶部位的視神經(jīng)，取材步驟同1.2.4，分別切成1.0 mm3大小的組織塊，4 ℃、2.5%戊二醛固定過夜，經(jīng)0.01 mol/L PBS洗滌后，1%鋨酸避光室溫固定2 h，丙酮梯度脫水后，環(huán)氧樹脂包埋劑滲透包埋，制作視神經(jīng)橫截面的超薄切片，每個組織連續(xù)切3～7片，PPD試劑利用等體積比的甲醇和異丙醇進(jìn)行溶解，1% PPD溶液染色35 min，甲醇和異丙醇等體積混合溶液沖洗3 次，干燥后封片，用3D玻片掃描儀捕獲視神經(jīng)橫截面圖像，每張切片選取5個獨立區(qū)域（見圖2A），使用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以獲得每個區(qū)域存活的軸突數(shù)和死亡的軸突數(shù)（見圖2B）。軸突存活率=存活的軸突數(shù)/（存活的軸突數(shù)+死亡的軸突數(shù)）×100%，5個區(qū)域的平均軸突存活率作為每張切片的軸突存活率，同一小鼠所有切片軸突存活率的平均值作為其軸突存活率。

圖2 小鼠視神經(jīng)軸突計數(shù)示意圖

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗；GCC層厚度、RGCs數(shù)量及軸突存活率數(shù)據(jù)三者均符合正態(tài)分布，采用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ONC后的活體觀察小鼠正常眼的視網(wǎng)膜呈淡紅色，視盤呈黃色，視網(wǎng)膜血管呈放射狀走行（見圖3A、圖3E-H）。ONC不同損傷時間點的眼底情況均未發(fā)現(xiàn)眼底出血或缺血情況（見圖3B-D）。

圖3 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點的眼底照相

2.2 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點視網(wǎng)膜與GCC層厚度變化根據(jù)小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點損傷眼的OCT成像，測量并分析視神經(jīng)損傷后不同時間點的視網(wǎng)膜與GCC層厚度變化（見圖4）。研究發(fā)現(xiàn)小鼠視神經(jīng)損傷后3 d組的GCC層厚度與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；視神經(jīng)損傷后7 d組和14 d組的GCC層厚度較正常對照組和損傷后3 d組顯著變薄（P＜0.05）；小鼠正常對照組及視神經(jīng)損傷后3 d組、損傷后7 d組、損傷后 14 d組，各組間的視網(wǎng)膜全層厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點GCC層和視網(wǎng)膜全層厚度比較（每組n=5，±s，μm）

表1 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點GCC層和視網(wǎng)膜全層厚度比較（每組n=5，±s，μm）

與正常對照組比：aP＜0.05；與損傷后3 d組比：bP＜0.05；與損傷后7 d組比：cP＜0.05

組別GCC層厚度視網(wǎng)膜全層厚度水平掃描環(huán)形掃描水平掃描環(huán)形掃描正常對照組69.86±5.0371.75±2.37203.89±39.65249.60± 5.10損傷后3 d組69.02±1.8471.43±4.52216.43±33.19220.96±37.86損傷后7 d組60.92±3.28ab62.98±2.81ab235.68±11.75247.25± 9.39損傷后14 d組54.44±1.77abc55.66±1.88abc232.85± 6.09236.93± 5.31

圖4 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點的視網(wǎng)膜OCT成像

2.3 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點RGCs的丟失

RBPMs陽性細(xì)胞代表視網(wǎng)膜RGCs（見圖5）。與正常對照組相比，損傷后3 d組視網(wǎng)膜不同區(qū)域的RGCs數(shù)量，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，視網(wǎng)膜近視乳頭區(qū)域的RGCs數(shù)量在視神經(jīng)損傷后7 d顯著減少（P＜0.05）；視網(wǎng)膜遠(yuǎn)視乳頭區(qū)域的RGCs數(shù)量，視神經(jīng)損傷后7 d組與正常對照組、損傷后3 d組相比顯著減少（P＜0.05）；損傷后14 d組視網(wǎng)膜不同區(qū)域的RGCs數(shù)量與正常對照組、損傷后3 d組、損傷后7 d組相比均顯著減少（P＜0.05），見表2。

表2 視神經(jīng)損傷后不同時間點視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量比較（每組n=5，±s）

表2 視神經(jīng)損傷后不同時間點視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量比較（每組n=5，±s）

與正常對照組比：aP＜0.05；與損傷后3 d組比：bP＜0.05；與損傷后7 d組比：cP＜0.05

組別近視乳頭區(qū)域中間區(qū)域遠(yuǎn)視乳頭區(qū)域正常對照組239.60± 23.89235.60±46.95208.40±41.94損傷后3 d組285.20±110.17272.60±98.62223.00±73.95損傷后7 d組122.40± 33.10a128.80±27.95100.20±11.50ab損傷后14 d組44.40± 4.04abc44.40± 4.39abc38.40± 2.97abc

圖5 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點及不同區(qū)域的視網(wǎng)膜RGCs的RBPMs免疫熒光染色圖（標(biāo)尺為50 μm）

2.4 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點軸突存活率與正常對照組相比，損傷后不同時間點的軸突存活率均顯著降低（P＜0.01）；且視神經(jīng)損傷時間越長，軸突存活率越低，各不同損傷時間組間軸突存活率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點的軸突存活率

2.5 小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜GCC層厚度、RGCs數(shù)量及軸突存活率之間的相關(guān)性分析同一只小鼠相同損傷時間的GCC層厚度（環(huán)形掃描和水平掃描）、RGCs數(shù)量以及軸突存活率三者之間均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），見圖7。

圖7 小鼠視網(wǎng)膜GCC層厚度、RGCs數(shù)量以及軸突存活率之間的相關(guān)性分析

3 討論

TON可以分為視神經(jīng)原發(fā)性損傷和視神經(jīng)繼發(fā)性損傷，視神經(jīng)原發(fā)性損傷主要包括外傷時瞬間外力造成的改變、出血、視神經(jīng)撕裂周圍結(jié)構(gòu)如骨質(zhì)對視神經(jīng)的壓迫及視神經(jīng)震蕩等，而視神經(jīng)繼發(fā)性損傷的機制較為復(fù)雜，主要包括組織水腫、動脈血管的痙攣、循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)對軸突的損害、RGCs的繼發(fā)性死亡等[9]。常用的用于建立視神經(jīng)損傷的動物模型有小鼠、大鼠、兔和貓等[10-12]。其中，小鼠因價格便宜、易繁殖、視神經(jīng)損傷容易操作、視網(wǎng)膜易分離且取材后完整性好等優(yōu)勢，已廣泛用于視神經(jīng)動物模型，因此在本研究選用小鼠作為實驗對象。

ONC動物模型是利用不同的夾持器械于球后夾持暴露的視神經(jīng)，并注意避免眼動脈的損傷，該模型在視神經(jīng)損傷的實驗研究上應(yīng)用較多，與臨床上視神經(jīng)挫傷較為接近，主要用于進(jìn)行RGCs的存活和軸突再生方面的研究，具有易于操作、視神經(jīng)鞘膜保持完整、損傷明確、無需開顱且創(chuàng)傷較小、術(shù)后動物存活率高等優(yōu)點，但目前對于夾持力度大小、夾持時間并未形成統(tǒng)一的規(guī)范。不同操作者造成的視神經(jīng)損傷程度難以保持一致，損傷程度難以精確定量，無統(tǒng)一的、可控制的標(biāo)準(zhǔn)[13-14]。本研究構(gòu)建了小鼠ONC動物模型，由同一位手術(shù)操作者利用同一型號的反向鑷，在完整暴露視神經(jīng)后，球后視神經(jīng)1 mm處完全閉合夾持10 s，保持一致的夾持力度大小與夾持時間等，使得ONC動物模型的致傷程度相對一致。

RGCs的不可逆性損傷以及選擇性丟失是視神經(jīng)損傷后出現(xiàn)的主要病理改變之一，較高的RGCs存活率有利于視神經(jīng)損傷后軸突的再生修復(fù)[15]。RGCs計數(shù)也是目前公認(rèn)的檢驗視神經(jīng)功能的重要指標(biāo)之一，因此在本研究中，通過視網(wǎng)膜鋪片結(jié)合免疫熒光染色對視神經(jīng)損傷后不同時間點的視網(wǎng)膜RGCs進(jìn)行定量分析，評估視網(wǎng)膜RGCs在ONC術(shù)后不同時間點的丟失情況。ONC后，RGCs的損傷及丟失存在一定的時間累積效應(yīng)，RGC的定量分析是視神經(jīng)損傷后對損傷程度進(jìn)行量化觀察的良好指標(biāo)。梅增輝等[16]通過觀察大鼠ONC后視網(wǎng)膜形態(tài)以及RGCs在不同時間點的計數(shù)變化，研究發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，RGCs損傷的嚴(yán)重程度與損傷時間呈一定相關(guān)性，損傷3 d內(nèi)RGCs數(shù)量幾乎不變，損傷3～7 d內(nèi)為RGCs快速丟失期，7～14 d內(nèi)為中速丟失期，14～28 d為慢速平穩(wěn)減少期。本研究結(jié)果與之前文獻(xiàn)報道相一致，在損傷3 d內(nèi)視網(wǎng)膜不同區(qū)域的RGCs數(shù)目幾乎不變，損傷后7 d和14 d，視網(wǎng)膜不同區(qū)域的RGCs與正常對照組相比顯著減少，說明在小鼠視神經(jīng)損傷早期階段（損傷3 d內(nèi)），視神經(jīng)軸突損傷對視網(wǎng)膜RGCs胞體數(shù)影響作用小，而視神經(jīng)長時間損傷會導(dǎo)致視網(wǎng)膜RGCs的顯著丟失。

視網(wǎng)膜及神經(jīng)纖維層厚度的變化對于視神經(jīng)損傷診療具有重要意義，研究[17]表明，神經(jīng)纖維層變薄是視神經(jīng)損害的敏感指標(biāo)之一，甚至早于視野損害和視盤損害的發(fā)生。RGCs主要存在于視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層以及內(nèi)叢狀層中，這3層結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為GCC層。本研究中，因小動物視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)的局限性，無法對神經(jīng)纖維層單獨分層，因此通過對視網(wǎng)膜及GCC層厚度的測量進(jìn)一步評估視神經(jīng)損傷程度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，視神經(jīng)損傷后3 d組的GCC層厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，損傷后7 d、14 d 組的GCC層厚度顯著變薄，且與RGCs數(shù)目丟失情況一致。但視神經(jīng)損傷后不同時間點的視網(wǎng)膜全層厚度，各組視網(wǎng)膜厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，我們認(rèn)為GCC層的厚度改變可以作為評價視神經(jīng)損傷的敏感指標(biāo)之一，而視網(wǎng)膜全層厚度不能作為視神經(jīng)損傷程度評價的有效指標(biāo)。

因神經(jīng)元的細(xì)胞體與軸突是一個整體，胞體和軸突之間常進(jìn)行物質(zhì)運輸和交換，視神經(jīng)損傷后軸突中斷，軸漿雙向流動被阻斷，則視神經(jīng)斷端近側(cè)和遠(yuǎn)端及RGCs胞體都會受到影響[18]。且軸突作為ONC的直接對象，因此在本研究中，軸突的存活率也被作為評價視神經(jīng)損傷程度的一個指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，損傷早期視神經(jīng)軸突存活率高，小鼠視神經(jīng)損傷后3 d組的軸突存活率約為59.25 %，但隨著損傷時間越長軸突存活率越低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，軸突存活率與GCC層厚度、RGCs數(shù)目的動態(tài)變化具有一致性，因此我們進(jìn)一步對符合正態(tài)分布的GCC層厚度、RGCs數(shù)量與軸突存活率進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明GCC層厚度、RGCs數(shù)量與軸突存活率兩兩之間均呈顯著正相關(guān)。

綜上所述，小鼠ONC模型可以作為視神經(jīng)損傷研究的動物模型，GCC層厚度、RGCs數(shù)量以及軸突存活率均可以作為評價視神經(jīng)損傷程度的敏感指標(biāo)。在小鼠視神經(jīng)損傷早期階段（損傷3 d內(nèi)），RGCs胞體以及軸突存活率高，因此早期及時干預(yù)治療有望預(yù)防視覺功能的進(jìn)一步損害。而在視神經(jīng)損傷中晚期（損傷后7 d至14 d），隨著損傷時間延長，RGCs胞體及其軸突存活數(shù)量逐漸減少，這可能是長時間視神經(jīng)損傷的患者診療效果不佳的原因之一。但本研究僅為動物實驗，小鼠外傷性視神經(jīng)的病理過程與人類自然疾病過程存在一定區(qū)別，因此有關(guān)視神經(jīng)損傷患者其不同損傷時間點視神經(jīng)損傷程度的評估，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。