馬玉捷 文星星 申童 向瓊昊

摘要：本調(diào)查旨在了解弓形蟲病在校園流浪動物（犬、貓）體內(nèi)的感染情況，于2018.9月～2022.2月期間，在湖南生物機電職業(yè)技術學院采集流浪犬、貓血清樣品及糞便樣品共52份，采用熒光探針法進行犬貓弓形蟲病的流行病學調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，陽性樣品共有17份，陽性率為32.69％，其中犬樣本21份，陽性樣品6份，陽性率為28.57％；貓樣本21份，陽性樣品11份，陽性率為35.48％。

關鍵詞：流浪動物；弓形蟲；檢測；熒光探針法

隨著國內(nèi)寵物行業(yè)的迅猛發(fā)展，社會上的流浪動物數(shù)量也與日俱增。流浪犬貓主要是指散布在城市公園、社區(qū)以及城鄉(xiāng)接合部的無主人的犬和貓。它們主要來源于兩方面：一是由被棄養(yǎng)的伴侶犬貓組成；二是由流浪犬貓自由交配、繁殖產(chǎn)生的后代[1]。流浪犬貓幾乎遍布每個城市。流浪犬貓大多沒有注射疫苗及驅(qū)蟲，容易攜帶諸多病原菌、寄生蟲等，從而造成疾病的傳播。

犬貓弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種人畜共患的原蟲病。弓形蟲幾乎可以感染所有的溫血動物，貓既是弓形蟲的中間宿主又是其終末宿主，而人類和其他動物只是中間宿主[2]。人以及其他哺乳動物通過攝入含有感染期蟲體的食物，包括生肉、蛋制品、奶制品、飲用水而感染。也可經(jīng)破損皮膚、黏膜以及通過胎盤由母體垂直傳播而感染。蒼蠅、蟑螂以及節(jié)肢動物也可以攜帶并傳播弓形蟲卵囊[2]。其可引起妊娠期婦女流產(chǎn)、胎兒發(fā)育不良、死胎等，還可以引起男性不育，弓形蟲是計劃生育、優(yōu)生優(yōu)育的大敵。因此，防止弓形蟲病的傳播已經(jīng)成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。校園寵物隨著學生畢業(yè)等種種原因被遺棄在各大高校內(nèi)形成一定數(shù)量的流浪動物群體。校園流浪犬貓已成為各大高校出現(xiàn)的共同問題。因此對校園流浪犬貓的弓形蟲感染情況進行調(diào)查是對長沙城區(qū)流浪犬貓弓形蟲病的流行病學調(diào)查的重要組成部分。

湖南生物機電職業(yè)技術學院內(nèi)有大量流浪犬貓，由于食物和健康無法保證，其很可能感染攜帶弓形蟲。而校園內(nèi)有大量師生能夠接觸到流浪動物，由此可能產(chǎn)生一系列關系到人身健康的問題。流浪動物隨地排泄，發(fā)情期易攻擊人等情況，使得人與動物的矛盾沖突近年來也在不斷加劇，因此，調(diào)查校園內(nèi)流浪犬貓的重要人畜共患病——弓形蟲攜帶和感染情況顯得尤為重要。為全面掌握校園內(nèi)流浪犬貓弓形蟲的感染情況，采用熒光探針法對動物體內(nèi)弓形蟲特異性基因片段進行檢測。

1 材料與方法

1.1 被檢樣品

對湖南生物機電職業(yè)技術學院校園內(nèi)流浪犬貓進行血液采集或糞便采集。對于可以捕捉的39只犬貓施行捕捉麻醉后采血并做絕育手術。對于不能捕捉的動物收集其糞便進行檢測。2018年9月～2022年2月期間共收集到52份樣本，其中貓血清樣本21，糞便樣本10，犬血清樣本11，糞便樣本10。

1.2 樣品采集

動物麻醉后無菌采集受檢動物的靜脈血1.0～1.5ml，離心析出血清，-20℃冷凍備用。采集動物糞便樣本3～5g/份，采集后立刻放入無菌采便管內(nèi)，

-20℃冷凍備用。按照試劑盒說明書操作，定性測定犬貓樣本中的弓形蟲基因的特異性片段。

1.3 試劑

弓形蟲免核酸提取實時熒光PCR一鍵式試劑盒。卡尤迪生物科技有限公司，批號S2004-07Y。

1.4 儀器

CoyoteBio Mini8 plus實時熒光定量PCR儀，北京尤卡迪生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 擴增試劑準備

從試劑盒中取出TOX-PCR反應液，待其充分溶解后，振蕩混勻5s，瞬時離心5s。根據(jù)所要檢測的樣本數(shù)，取相應份數(shù)的反應液，20μl/份，于0.2ml PCR反應管中備用。試劑用畢后立即放入-20℃保存。

1.5.2 樣本處理

糞便樣本處理：挑取固體糞便樣本0.1g（黃豆粒大?。┲?00μl樣本稀釋液中渦旋振蕩1min，13000 rpm離心10 min，取50μl上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，70℃加熱2min，加熱后取20μl加熱處理后的樣本加入2μl糞便樣本裂解液混勻。加入樣本裂解液，混勻處理后應立即加入PCR反應體系中。血樣本處理：血清樣本經(jīng)樣本稀釋液（或生理鹽水）稀釋5倍后，即可直接上樣；

1.5.3 加樣

在分裝有TOX-反應液的PCR反應管中分別加入5μl處理后的待檢樣本、TOX-陽性對照品或TOX-陰性對照品2μl（用3μl樣本稀釋液將總體積補足到25μl）。壓緊管蓋，瞬時離心。

1.5.4 PCR擴增

將加完樣的PCR管按照相對應的位置放置到CoyoteBio Mini8 plus儀器里，等待運行。按照說明書操作儀器軟件。檢測結(jié)束后查看檢測結(jié)果報告。

2 結(jié)果

利用實時熒光PCR（熒光探針）方法對湖南生物機電職業(yè)技術學院校園內(nèi)流浪的21只犬31只貓進行了弓形蟲基因特異性片段的檢測，其中17動物檢測為陽性，感染率為32.69%，有6犬檢測結(jié)果為陽性，感染率為28.57%，有11只貓檢測結(jié)果為陽性，感染率為35.48%。具體感染情況見表。

3 討論

3.1 弓形蟲的分布

弓形蟲為世界性分布，在人群中感染較普遍，全世界有1/4的人口受到威脅，血清陽性率平均為25%～50%，有的高達85%以上[3]。據(jù)我國第二次寄生蟲病調(diào)查顯示，我國一般人群弓形蟲的平均感染率在7.89%[4]，動物飼養(yǎng)員陽性率明顯高于普通人群。獸醫(yī)和屠夫在各職業(yè)中感染率最高，達9.20%和7.70%。2006年青島市調(diào)查表明飼養(yǎng)寵物者弓形蟲感染率為11.86%，未飼養(yǎng)寵物者為7.38%，飼養(yǎng)寵物者弓形蟲感染高于未飼養(yǎng)寵物者[5]。2016年調(diào)查表明寵物犬和鄉(xiāng)村犬弓形蟲抗體陽性率分別為14.5 %和24.6%，流浪貓和寵物貓弓形蟲抗體陽性率分別為24.1%和13.4 %[6]。2011年對長沙城區(qū)504只犬貓弓形蟲的調(diào)查結(jié)果表明長沙地區(qū)犬貓弓形蟲感染率較高已達24.4%[7]；

本次針對湖南生物機電職業(yè)技術學院內(nèi)52只流浪犬貓進行弓形蟲檢測顯示，流浪動物弓形蟲感染率為32.69%，其中流浪犬感染率達28.57%，流浪貓感染率達35.48%。高于長沙城區(qū)家養(yǎng)寵物弓形蟲感染率24.4%，也高于北京鄉(xiāng)村犬抗體陽性率24.6%與流浪貓抗體陽性率24.1%以及國外Harold Salant和Spira Dan T.的調(diào)查結(jié)果16.8%[8]。這可能與本次調(diào)查的樣本數(shù)量、檢測方法有關。由于流浪犬貓在戶外覓食，捕食鼠類、鳥類等弓形蟲中間宿主，易接觸到節(jié)肢動物、蚯蚓這類弓形蟲卵囊攜帶者，其食入弓形蟲包囊和卵囊的機會要比家養(yǎng)犬貓大得多。因此流浪犬貓弓形蟲感染率高于室內(nèi)飼養(yǎng)的犬貓。

3.2 弓形蟲的檢測

犬貓感染弓形蟲后是否發(fā)病取決于蟲株的毒力、感染數(shù)量和途徑以及宿主免疫力等因素。貓對弓形蟲的敏感性差，僅有少數(shù)出現(xiàn)臨床癥狀。人和動物感染弓形蟲多呈無癥狀的隱性感染，因此只能通過醫(yī)學檢測來確定是否感染。弓形蟲病的檢查分為免疫學檢查和病原體檢查。目前臨床上主要應用是免疫學方法，包括血清特異性抗體的診斷以及血清中弓形蟲循環(huán)抗原的檢測[9]。已有多種血清學方法用于弓形蟲病的診斷，包括間接血凝試驗（IHA）、間接熒光抗體實驗、補體結(jié)合試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等方法。常見弓形蟲的檢查指標包括（1）特異性IgM抗體：該抗體常出現(xiàn)在感染早期，提示近期內(nèi)存在弓形蟲感染，是急性期感染的標志。IgM滴度達到高峰后很快降到低水平；（2）特異性IgG抗體：感染后IgG抗體在血液中出現(xiàn)較晚，但達到高峰后會基本穩(wěn)定在一個較高的滴度，且持續(xù)時間較長，是既往感染的標志。因此健康帶蟲者可長期存在IgG抗體，曾感染弓形蟲而現(xiàn)已治愈者IgG抗體仍可持續(xù)較長時間。（3）循環(huán)抗原CAg：早期或現(xiàn)癥感染的指標。抗原檢測的靈敏性和特異性都較高，可作為確診依據(jù)。弓形蟲的病原體檢測一般有三種：第一種，直接涂片法，在涂片中的細胞漿內(nèi)尋找弓形蟲。第二種，動物接種。第三種，細胞培養(yǎng)。但病原體檢查操作復雜，檢出率較低，動物接種和細胞培養(yǎng)時間較長，目前在臨床應用較少，意義不大。

3.3 弓形蟲的傳播

動物是弓形蟲的重要傳染源，弓形蟲在它的生活史中，除配子體外，包括滋養(yǎng)體、包囊和卵囊都是均具有感染性的。蟲體在宿主內(nèi)的形式多樣，包括感染力較強的速殖子、生長緩慢感染力較差的緩殖子及卵囊等。在自然界感染最多的是貓科動物，貓既是弓形蟲的中間宿主又是其終末宿主，而人類和其他動物只是中間宿主。弓形蟲僅在貓體內(nèi)進行有性繁殖形成卵囊，并隨其糞便排出體外。校園內(nèi)流浪犬貓因撿拾垃圾，捕食鼠類、鳥類等感染弓形蟲。感染的貓排出弓形蟲卵囊，進入環(huán)境中的卵囊經(jīng)過2～4d發(fā)育成具有感染性的成熟卵囊。這些卵囊可以長期存在于外界環(huán)境中[10]。當其他動物或家養(yǎng)寵物接觸被卵囊污染的土壤、水后易感染弓形蟲。

3.4 流浪動物對弓形蟲的影響

流浪犬貓的繁殖力驚人，一只流浪母貓一年產(chǎn)仔2胎，每胎產(chǎn)仔4～10只[1]。流浪犬貓大多未進行絕育手術，其大量無序繁殖導致城市流浪動物數(shù)量急劇增多。因此帶來的公共衛(wèi)生問題和社會問題都日益尖銳。目前，流浪犬貓問題已成為世界性的熱點問題，各國對于流浪犬貓如何處理的問題也在不斷探索。對于校園流浪動物的管理，一方面應借助專業(yè)學科力量為其進行絕育手術以控制數(shù)量。另一方面應定期對校園環(huán)境中的犬貓排泄物進行清理、消毒。校園內(nèi)家養(yǎng)犬應使用引導繩牽引外出，避免犬在外撿食或接觸流浪貓排泄物。家養(yǎng)貓應完全室內(nèi)飼養(yǎng)，避免其捕食老鼠、蚯蚓等中間宿主。飼喂寵物商品糧，不應飼喂生肉或半熟肉。避免寵物感染弓形蟲病。

犬貓作為與人類關系密切的動物，在弓形蟲的傳播過程中起著非常重要的作用，充分了解校園內(nèi)流浪犬貓的弓形蟲感染狀況對該病的防控以及公共衛(wèi)生具有重要的指導意義。校園流浪犬貓已成為各大高校出現(xiàn)的共同問題。因此對校園流浪犬貓的弓形蟲感染情況進行調(diào)查是對城區(qū)流浪犬貓弓形蟲感染情況調(diào)查的重要組成部分。同時對于校園內(nèi)可抓捕的流浪動物進行絕育手術在很大程度上控制了流浪動物的數(shù)量以及人畜共患病的傳播。

參考文獻

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