馬彥波,鄧必成,侯余勇,路思晗,郭之樂,王巍杰

(1. 華北理工大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院,河北 唐山 063210;2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津 300308)

碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)是一種催化CO2和HCO3-之間轉(zhuǎn)化的酶,廣泛存在于自然界中的各種生物體內(nèi)[1]。在藻類中,CA起著重要的作用,因?yàn)樗鼈冃枰ㄟ^光合作用來吸收CO2并將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)物質(zhì)[2,3]。α-CA和β-CA是藻類中的主要CA分類成員[4]。α-CA是一種單體酶,具有高度保守性,在不同種藻類中表現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)和功能特征[5]。β-CA是一種大多數(shù)情況下以二聚體形式存在的酶,其基因組分布較為廣泛,具有更多樣化的結(jié)構(gòu)和功能[6]。藻類中CA的活性受到光照、溫度、營養(yǎng)素等環(huán)境因素的調(diào)控,并且與藻類的生長(zhǎng)、代謝以及碳循環(huán)等方面密切相關(guān)[7,8]。因此,對(duì)于藻類中CA的研究不僅有助于加深對(duì)這些生物體代謝和生態(tài)系統(tǒng)功能的理解,還可能為解決海洋碳循環(huán)和氣候變暖等問題提供科學(xué)依據(jù)。

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究綠藻代謝的模式微藻,具有較高的生長(zhǎng)速度,但生物量的積累有限[9]。CO2在水中的溶解度很低,而CA可以將大氣中的CO2轉(zhuǎn)化為HCO3-,是微藻CCM(Carbon Concentrating Mechanism)機(jī)制中的重要組成部分,促進(jìn)無機(jī)碳的吸收利用[10,11]。在藻類系統(tǒng)中,CA的功能是將細(xì)胞外HCO3-轉(zhuǎn)化為1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)的底物[12,13],這也是CCM機(jī)制的共同特征,以增強(qiáng)微藻的碳捕獲能力[14]。因此,對(duì)萊茵衣藻CA的生物信息學(xué)分析有助于為“雙碳”政策下微藻固碳的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 萊茵衣藻CA基因家族成員鑒定

在Ensemble Plant(https://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中下載物種萊茵衣藻的全基因組數(shù)據(jù),包括CDS、Protain sequence和GFF3文件。從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫下載擬南芥已鑒定的α-CA和β-CA蛋白全長(zhǎng)序列,通過本地BLAST搜索萊茵衣藻的全基因組序列(E-value值為1e-5)。將獲得的蛋白序列利用NCBI-BLAST去除重復(fù)序列后,提交到NCBI-Batch-CDD、Pfam和SMART進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)構(gòu)域,獲得萊茵衣藻的α-CA和β-CA基因家族成員[15]。

1.2 理化性質(zhì)分析

利用ExPASyprotparam tool(https://web.expasy.org/protparam/)網(wǎng)站分析萊茵衣藻碳酸酐酶蛋白的理化性質(zhì)[16],利用WOLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)網(wǎng)站對(duì)萊茵衣藻碳酸酐酶蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 同源性分析

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載杜氏鹽藻、雨生紅球藻、微擬球藻、小球藻的全基因組序列,按照1.1所述方法篩選出各物種的碳酸酐酶基因家族成員。利用MEGA11軟件將萊茵衣藻的碳酸酐酶蛋白與杜氏鹽藻、雨生紅球藻、微擬球藻和小球藻的α-CA和β-CA亞家族成員的蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,選擇Neighbor-Joining(鄰接法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap值設(shè)為1 000次,其余選擇默認(rèn)參數(shù)。利用iTOL(https://itol.embl.de/)在線軟件注譯發(fā)育樹。

1.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)互作

利用Swiss-model (https://swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)萊茵衣藻CA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),String(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建萊茵衣藻CA家族蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

1.5 蛋白基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

在Ensemble Plant(https://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中下載物種萊茵衣藻的全基因組數(shù)據(jù),利用TBtools軟件提取α-CA和β-CA的基因結(jié)構(gòu)信息并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用在線工具M(jìn)EME Suite 5.4.1(https://meme-suite.org/meme/meme_5.4.1/)對(duì)萊茵衣藻碳酸酐酶蛋白家族的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè),設(shè)置Motif數(shù)量為10,最大寬度50,最小寬度6,進(jìn)一步使用TBtools軟件實(shí)現(xiàn)Motif保守基序的可視化。

1.6 染色體定位和順式作用元件分析

利用TBtools軟件預(yù)測(cè)萊茵衣藻CA蛋白家族各基因的染色體位置,從萊茵衣藻基因組中導(dǎo)出CA基因上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域序列,然后利用Plant CARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)萊茵衣藻CA蛋白啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件。

1.7 添加碳酸氫鹽促進(jìn)萊茵衣藻CA的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)以TAP(Tris Acetate-Phosphate)培養(yǎng)基培養(yǎng)為對(duì)照組,在對(duì)照組中添加5 mmol/L的HCO3-為實(shí)驗(yàn)組,固定時(shí)間間隔進(jìn)行取樣,測(cè)定680 nm處的吸光度值,并對(duì)CA基因進(jìn)行表征。

2結(jié)果與分析

2.1 萊茵衣藻CA家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

按照1.1所述方法檢索萊茵衣藻CA蛋白序列,進(jìn)一步通過CDD、Pfam(α-CA:PF00484; β-CA:PF00194)和SMART蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)工具驗(yàn)證結(jié)構(gòu)域,獲得3個(gè)α-CA和5個(gè)β-CA蛋白,將其分別重新命名為Cr1～3及Cr4～5。利用ExPASyprotparam tool在線軟件分析蛋白理化性質(zhì),WOLF PSORT網(wǎng)站對(duì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果見表1。

表1 萊茵衣藻CA蛋白家族的理化性質(zhì)

由表1可看出,α-CA亞家族的Cr1～3編碼的氨基酸殘基數(shù)量為310～380 個(gè),分子量在33.46～42.17 kDa,理論pI值2個(gè)家族成員小于7.0,另外1個(gè)家族成員Cr3大于7.0,均呈親水性。β-CA亞家族的Cr4～8所編碼的氨基酸數(shù)量為267～399個(gè),分子量在27.67～42.99 kDa,其理論pI值3個(gè)成員大于7.0,另外2個(gè)家族成員均在5～7之間,平均親疏水性2個(gè)成員疏水,另外3個(gè)成員親水。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了分析萊茵衣藻8個(gè)CA家族成員與杜氏鹽藻、雨生紅球藻、微擬球藻和小球藻CA家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,將杜氏鹽藻11個(gè)CA(Ds1～11)的氨基酸序列,雨生紅球藻10個(gè)CA(Hl1～10)的氨基酸序列,微擬球藻14個(gè)CA(Ng～14)的氨基酸序列,及小球藻5個(gè)CA(Cv～5)的氨基酸序列,連同這8個(gè)碳酸酐酶的CA成員一起比對(duì),采用NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。結(jié)果表明,不同藻來源的α-CA成員,均很好地聚為一類,而β-CA亞家族成員被分為2類,說明不同CA亞家族成員在進(jìn)化上具有相對(duì)獨(dú)立性。從整體上看,萊茵衣藻與雨生紅球藻2個(gè)CA亞家族成員之間的親緣關(guān)系更近一些。

圖1 萊茵衣藻與杜氏鹽藻、雨生紅球藻、微擬球藻、小球藻CA家族成員的進(jìn)化關(guān)系

2.3 CA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和互作網(wǎng)絡(luò)分析

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(見圖2)顯示,Cr4、Cr5與Cr7為等位于同一進(jìn)化樹分支的成員,三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似,Cr6與Cr8在結(jié)構(gòu)上完全相同且位于同一亞族的相同分支上。但Cr1、Cr2與Cr3比較特殊,雖然位于同一分支上,但三級(jí)結(jié)構(gòu)有著明顯差異,推測(cè)某些非同源的部分基因決定了其蛋白結(jié)構(gòu),后續(xù)蛋白特征結(jié)構(gòu)與基因結(jié)構(gòu)分析也說明了這一點(diǎn)。

圖2 萊茵衣藻CA家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

為了更好地了解萊茵衣藻CA基因家族功能,將8個(gè)萊茵衣藻CA蛋白上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫中,以擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為參考進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建出萊茵衣藻CA蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)(見圖3所示),對(duì)萊茵衣藻CA蛋白互作信息進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示,Cr4沒有與其他蛋白存在互作關(guān)系,Cr2分別與Cr1和Cr3之間存在直接的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。通過分析蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)Cr2的互作蛋白最多,有6個(gè);其他蛋白之間的互作均在3～4個(gè)之間。

圖3 萊茵衣藻CA家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

2.4 蛋白基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

為了進(jìn)一步了解CA蛋白特征區(qū)域,通過MEME在線網(wǎng)站選用10個(gè)Motif對(duì)CA家族蛋白進(jìn)行分析(見圖4)。每個(gè)Motif中氨基酸殘基字符越大,其氨基酸位點(diǎn)保守性越好;基序的氨基酸殘基大字符越多,該基序越保守穩(wěn)定。

根據(jù)保守基序分析結(jié)果(如圖5所示)可知,萊茵衣藻所有α-CA家族成員均含有Motif2和Motif10,而在β-CA亞家族中Motif1、Motif5和Motif6穩(wěn)定存在,說明Motif1、Motif5和Motif6是β-CA主要功能結(jié)構(gòu)域,但Motif5在Cr7中沒有顯現(xiàn)出來,其基序空缺可能導(dǎo)致其蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化,推測(cè)其具有功能差異性。

圖4 Motif1-10的多級(jí)共有序列

圖5 萊茵衣藻CA家族保守結(jié)構(gòu)域與基因結(jié)構(gòu)圖

圖5基因結(jié)構(gòu)分析顯示,萊茵衣藻α-CA亞家族各成員外顯子個(gè)數(shù)在6～11之間,而β-CA成員則在6～9之間,α-CA亞家族成員的外顯子數(shù)目要多于β-CA亞家族,推測(cè)α-CA亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)較β-CA亞家族復(fù)雜。

2.5 染色體定位和順式作用元件分析

在染色體定位分布圖(如圖6所示)中,每個(gè)CA基因的位置可以用坐標(biāo)度來確定,8個(gè)CA基因定位于萊茵衣藻的5條染色體上。其中4號(hào)、5號(hào)和9號(hào)染色體上分布最多,各有2個(gè)CA基因;12、13號(hào)染色體上各有1個(gè)CA基因。萊茵衣藻CA各成員在染色體的位置都相距較遠(yuǎn),推測(cè)沒有發(fā)生串聯(lián)互換,說明CA家族基因的保守性。

圖6 萊茵衣藻CA家族染色體定位圖

通過PlantCARE工具對(duì)萊茵衣藻8個(gè)CA基因的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析(見圖7所示)。

圖7 萊茵衣藻CA家族順式作用元件分布圖

結(jié)果表明,在這些基因的啟動(dòng)子中主要含有激素應(yīng)答順式作用元件,例如,參與Me JA響應(yīng)的CGTCA-motif和TGACG-motif;參與ABA響應(yīng)的ABRE元件;參與水楊酸反應(yīng)的TCA-element;參與生長(zhǎng)素響應(yīng)的TGA-element;參與胚乳表達(dá)的調(diào)節(jié)元件GCN4-motif;參與赤霉素響應(yīng)的P-box元件;與缺氧調(diào)控相關(guān)的GC-motif元件;與厭氧誘導(dǎo)調(diào)控相關(guān)的ARE元件;與分生組織表達(dá)相關(guān)的CAT-box元件。除此外,還含有多個(gè)參與光響應(yīng)、非生物脅迫等相關(guān)的順式作用元件及多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。如控制光反應(yīng)的相關(guān)元件TCT-motif、ACE、TCCC-motif、CAG-motif、AE-box;參與低溫響應(yīng)的LTR元件,以及MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件G-box和C-box。結(jié)果表明,萊茵衣藻的碳酸酐酶基因有可能響應(yīng)了逆境及激素信號(hào)從而參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程。

2.6 添加碳酸氫鹽生理實(shí)驗(yàn)和相對(duì)表分析

為了進(jìn)一步對(duì)萊茵衣藻CA家族基因功能進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,添加碳酸氫鹽促使萊茵衣藻生物量的積累,在萊茵衣藻生長(zhǎng)的前期,以無機(jī)碳源(HCO3-)為主要碳源進(jìn)行代謝生長(zhǎng),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中萊茵衣藻的生物量的積累顯著高于對(duì)照組,在第24 h,實(shí)驗(yàn)組生物量是對(duì)照組生物量的2倍(見圖8所示)。筆者曾經(jīng)發(fā)表的文章結(jié)果表明[17],CA家族基因在萊茵衣藻的代謝生長(zhǎng)方面有著重要意義,尤其是在CO2和HCO3-的相互轉(zhuǎn)化和利用;基因表征的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,CAH2(Cr1)和CAH3(Cr3)在萊茵衣藻吸收利用無機(jī)碳有著重要的作用,萊茵衣藻生長(zhǎng)的初期CAH2和CAH3就有著不同程度上的上調(diào)表達(dá),其他無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子(CCP1/CCP2/LCIA/LCIB/LCIC等)的協(xié)同作用下,促進(jìn)了萊茵衣藻對(duì)無機(jī)碳源的利用和對(duì)生物量的積累。總之,對(duì)萊茵衣藻CA蛋白家族的生物信息學(xué)研究,可以為萊茵衣藻生物固碳和提升生物量的研究提供更多的理論基礎(chǔ)。

圖8 萊茵衣藻生長(zhǎng)曲線

3結(jié)論

(1)采用生物信息學(xué)分析方法分析萊茵衣藻CA基因家族的8個(gè)CA家族成員,結(jié)果表明萊茵衣藻CA基因家族的蛋白序列長(zhǎng)度最小為264 aa,最大為399 aa,分子量大小和理論pI分別介于33.46～42.17 kDa和5.7～9.05之間,其中只有Cr4和Cr5具有疏水性,其余的均為親水性。

(2)系統(tǒng)進(jìn)化分析表明杜氏鹽藻、雨生紅球藻、微擬球藻和小球藻CA家族的α-CA成員聚為一類,β-CA分成2類;蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)表明,CA蛋白家族成員中,Cr4、Cr5和Cr7三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似,Cr6和Cr8三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似,而在蛋白質(zhì)互作中,Cr4沒有參與之間的互作關(guān)系,Cr6與Cr8在結(jié)構(gòu)上完全相同且位于同一亞族的系統(tǒng)進(jìn)化樹相同分支上,在互作關(guān)系中,Cr2的互作蛋白最多,這也與筆者曾經(jīng)發(fā)表論文中基因表征結(jié)果一致[17]。

(3)萊茵衣藻的8個(gè)CA基因均含有特定保守基序;染色體定位發(fā)現(xiàn)基因Cr1和Cr2在4號(hào)染色體,Cr4和Cr5在5號(hào)染色體,Cr3和Cr6在9號(hào)染色體,Cr7和Cr8分別在12和13號(hào)染色體上;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CA在萊茵衣藻吸收、轉(zhuǎn)化和利用HCO3-方面發(fā)揮著重要作用[17]。