張崢,孫雨晨,范闊海,孫娜,孫盼盼,孫耀貴,李宏全,尹偉*
(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院 中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室,山西 晉中 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學 實驗動物管理中心,山西 晉中 030801)
豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種以呼吸道癥狀和高死亡率為特征的動物病毒性傳染病,對世界范圍的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。山西省2016 年9 月-2019 年1 月流行病學調(diào)查顯示已免疫PRRS 滅活疫苗的8 個規(guī)?;B(yǎng)豬場的6518份血清的PRRSV 抗體檢測結果中,陽性率為82.62%,說明山西省PRRS 總體免疫效果并不理想,存在PRRSV 的反復感染[2]。PRRSV 疫苗無法對高遺傳多樣性的毒株提供完全的保護,PRRS 仍是持續(xù)威脅我省乃至全國養(yǎng)豬業(yè)的重要豬病毒性疾病之一[3-6]。
豬感染PRRSV 后以出現(xiàn)免疫抑制為特點,常與其他豬病混合感染或者繼發(fā)感染,給養(yǎng)殖戶造成較大經(jīng)濟損失的同時也給豬病的治療增加了難度。疫苗免疫仍是預防PRRS 的最重要措施之一。用于預防PRRS 的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗,滅活疫苗的主要劣勢是免疫效果差,而弱毒疫苗免疫效果雖然優(yōu)于滅活疫苗,但其安全性差,存在散毒的風險[7-8]。此外,由于PRRSV 變異快、易發(fā)生基因重組等原因,傳統(tǒng)的疫苗仍不能有效控制PRRSV的感染[9]。PRRSV 感染初期也會誘發(fā)機體很強的體液免疫反應,一般于感染后7~9 d 可檢測到特異性抗體,但這些抗體對PRRSV 都沒有中和能力甚至能加強感染,而有效的中和抗體一般出現(xiàn)于28 d以后[10]。Yoon 等[11]學者研究發(fā)現(xiàn)PRRSV 感染早期產(chǎn)生的抗體不僅不能有效阻止病毒感染,反而導致PRRSV 在宿主細胞內(nèi)復制增強,即PRRSV 的抗體依賴性增強(Antibody-dependent enhancement,ADE)現(xiàn)象。進一步研究發(fā)現(xiàn),低中和抗PRRSV 血清與病毒形成PRRSV-抗體復合物,該復合物進一步與借助宿主細胞PAMs 表面的Fc 受體(Fc receptor, FcR)與PAMs 結合,從而促進病毒更容易進入細胞,進行有效復制并引起感染,病毒抗體在亞中和滴度水平增強了病毒感染[12]。
補體受體廣泛分布于紅細胞、巨噬細胞等表面,能夠與補體中的活性成分發(fā)生結合,是機體重要的先天免疫功能分子[13],其中研究較多的是I 型補體受體,其可以結合補體C3 活化產(chǎn)生的片段C3b。外源性病原進入血液后,血清補體被活化產(chǎn)生多種活性片段。其中,C3b 能夠結合在病原體表面使病原致敏,補體受體通過結合C3b 將致敏病原或其抗原抗體復合物發(fā)生免疫粘附,并進一步促進病毒[14-16]、細菌[17-18]和寄生蟲[19-20]的清除。但是,某些病原體也能利用補體受體來逃避識別和清除。Cardosa 等[21]研究證實補體受體-3(Complement receptor 3, CR3)可以介導小鼠巨噬細胞中西尼羅河病毒(West nile virus, WNV)的補體依賴性感染增強。人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)也被證實能夠通過補體受體進行補體介導的抗體依賴性感染增強[22]。研究發(fā)現(xiàn),利什曼原蟲(Leishmania spp.)同樣能夠以CR3 介導的方式進入宿主巨噬細胞并生存下來,并且由CR3 介導的信號可以降低巨噬細胞中白細胞介素12(Interleukin-12, IL-12)的產(chǎn)生[23]。本課題組前期試驗結果證實豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages, PAMs)膜表面存在豬I 型補體受體(Porcine complement receptor 1-like, CR1-like)基因,在FcR、CR1-like 共同介導下,PAMs能夠移除豬紅細胞免疫粘附的免疫復合物[24-25]。且豬紅細胞類Ⅰ型補體受體(Erythrocyte complement receptor type 1-like, ECR1-like)通過其免疫粘附功能促進了PAMs 對致敏基因工程菌(GFP-Escherichia coli,GFP-E. coli)的捕獲[26]。然而,機體針對PRRSV的免疫應答中,PAMs 免疫粘附受體CR1-like 的功能尚不明確。因此,本研究通過對PAMs 捕獲病毒的拷貝數(shù)進行分析,深入探究豬新鮮血清和CR1-like對PRRSV 感染PAMs的影響,以期為CR1-like在PRRSV 免疫應答中的生物學功能研究提供理論數(shù)據(jù)。
30 日齡臨床健康斷奶長白仔豬(PRRSV 抗體檢測為陰性),購自太谷區(qū)吳家堡養(yǎng)豬場;TCID50為10-5.55的PRRSV 分離株(JS-1 株,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院饋贈),本實驗室凍存。鼠抗豬CR1-like 單克隆 抗 體 由 本 實 驗 室 自 制 ,專 利 號 :ZL201410308534.0,CD16、CD64、CD32 單克隆抗體均購自賽默飛有限公司,TRIzol 和Primer-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 購自寶日醫(yī)生物技術有限公司,RPMI-1640 培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司,PRRSV 抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司,2×SYBR Green Low ROX qRT-PCR Master Mix 購自上海Bimake 有限公司,豬補體片段3b(C3b)、豬補體片段4b(C4b)ELISA 試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司,豬血清總補體(CH50)ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。
本研究中的實驗動物及涉及的試驗方法已獲得山西農(nóng)業(yè)大學實驗動物倫理委員會的批準(批準號:SXAU-ASVM-16019)。
1.2.1 抗PRRSV 血清制備及中和抗體效價檢測
(1) 豬新鮮血清和抗PRRSV 血清的制備
豬新鮮血清制備:長白仔豬前腔靜脈采血2000 r·min-1離心5 min,收集血清,備用??筆RRSV 血清制備:于豬耳后部肌肉注射1 mL 高致病性藍耳病弱毒活疫苗,接種后20~28 d 前腔靜脈采血,2000 r·min-1離心5 min,取上清備用。
(2) 抗PRRSV 血清中和抗體效價的測定
PAMs的分離與原代培養(yǎng)等操作參照課題組前期的試驗方法進行,采用固定病毒稀釋血清法測定中和抗體效價[27-28]??筆RRSV 血清800 μL 于56 ℃水浴中作用30 min,3000 r·min-1離心5 min 離心去除雜質(zhì),倍比稀釋抗PRRSV 血清,稀釋度依次為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。取各稀釋度抗PRRSV 血清與病毒混合懸液100 μL,37 ℃水浴1 h,作為待檢血清組,依次接種于96 孔板中。取濃度為200 TCID50/100 μL 的PRRSV 懸液接種孔板中,作為病毒對照組。取抗PRRSV 血清400 μL,以400 μL 培養(yǎng)基進行1∶2 稀釋。將1∶2 稀釋的抗PRRSV 血清接種孔板中,作為抗PRRSV 血清毒性對照組。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,顯微鏡下觀察病變,根據(jù)Reed-Muench 公式進行計算。
1.2.2 抗PRRSV 血清影響PRRSV 感染PAMs的檢測
根據(jù)上述測定的中和效價結果,將抗PRRSV血清稀釋為1∶2、1∶5.37、1∶10、1∶20、1∶40 等5 個梯度。將PAMs 接種于6 孔板中,培養(yǎng)12 h,PRRSV懸液1000 倍稀釋后進行接種,每孔50 μL。感染9 h后,將5 個稀釋度的抗血清依次加入,于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),分別于12、24、36 和48 h 收集細胞樣品。使用TRIzol 法提取細胞總RNA,以合成的cDNA 為模板,制備標準曲線并測定各組PRRSVN基因拷貝數(shù)。引物由北京擎科生物技術有限公司合成,序列見表1。
表1 引物序列及PCR 產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences and the size of PCR products
1.2.3 豬新鮮血清影響PRRSV 感染 PAMs的檢測
(1) 豬新鮮血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 總活性ELISA 測定
采集豬新鮮血清置于金屬浴56 ℃,30 min 作滅活處理。將PAMs 復蘇至6 孔板中,每孔加入PRRSV 懸液50 μL 感染9 h。各孔加入1∶20 稀釋抗血清220 μL 和豬新鮮血清128.7 μL,分別于0、1、3、
5、36、72 h 收集各孔培養(yǎng)上清40 μL,檢測不同時間點培養(yǎng)上清中各指標活性。
主要步驟如下:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品加樣50 μL,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL,再加待測樣品10μL。每孔加入酶標試劑100 μL,空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育1 h。靜置30 s 棄去,洗滌液洗5 次,拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL,混勻,37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL,終止反應。以空白孔調(diào)零,450 nm 波長依序測量各孔的吸光度。
(2) qRT-PCR 檢測PRRSV N 基因拷貝數(shù)
試驗分為6 組,分別記為A、B、C、D、E、F 組,各組處理如下:
A 組,PAMs 接種6 孔板中,PRRSV 懸液50 μL感染9 h 后,加入1∶20 稀釋抗血清220 μL 和豬新鮮血清128.7 μL,豬新鮮血清初濃度為5%[23],間隔3 h重復加入豬新鮮血清128.7 μL;B 組中以PBS 代替1∶20 稀釋抗血清,C 組中以滅活血清代替豬新鮮血清,D 組中以PBS 代替豬新鮮血清,E 組中僅加入1∶20 稀釋抗血清,F(xiàn) 組中僅加入PBS,B~F 組其余操作同A 組,各組處理見表2所示。
表2 試驗分組及處理Table 2 Experimental groups and treatments
本試驗中以加入抗PRRSV 血清和豬新鮮血清3 h 后開始計算時間,分別于0、12、24、36、48、60、72 h 后收集各組細胞樣品與細胞培養(yǎng)上清,分別提取胞內(nèi)和上清中的RNA,以qRT-PCR 檢測胞內(nèi)與上清中PRRSV 的拷貝數(shù)。
1.2.4 CR1-like 影響PRRSV 感染PAMs 的檢測
試驗分為6 組,分別記為a、b、c、d、e、f 組,各組處理見表3。
表3 試驗設計及組別Table 3 Experimental design and groups
其中,CD16、CD32、CD64 單抗(終濃度均為1∶1000),CR1-like 單抗(終濃度1∶50)處理需37 ℃孵育2 h,接種PRRSV 懸液,添加各類血清操作方法同1.2.3 中(2)。以加入抗PRRSV 血清和豬新鮮血清3 h 后開始計算時間,分別于0、12、24、36、48、60、72 h 后收集a 組~f 組細胞樣品,提取樣品中RNA,qRT-PCR 檢測PAMs中病毒的拷貝數(shù)。
1.2.5 數(shù)據(jù)分析
所有數(shù)據(jù)均以Mean±SD 表示,運用Graph-Pad PrismTM 8 軟件對數(shù)據(jù)進行One-way ANOVA、Two-way ANOVA 統(tǒng)計分析。P<0.05 表示有顯著差異性,P<0.01表示有極顯著差異性。
將倍比稀釋的抗PRRSV 血清與PRRSV 的混合液作用于PAMs 48 h 后每組細胞病變情況記錄如表4所示,按公式計算得出抗PRRSV 血清中和抗體效價為1∶5.37。
表4 抗PRRSV 血清中和抗體效價檢測結果Table 4 Detection results of neutralizing antibody titer in anti-PRRSV serum
分別于12、24、36、48 h 時間點收集單獨PRRSV 組、1∶2 稀釋度抗血清組、1∶5.37 稀釋抗血清組、1∶10 稀釋度抗血清組、1∶20 稀釋度抗血清組和1∶40 稀釋度抗血清組的細胞樣品,經(jīng)qRT-PCR檢測PRRSVN基因拷貝數(shù),檢測結果顯示:各時間點下,不同倍比稀釋的抗PRRSV 血清組分別與單獨PRRSV 組相比,1∶5.37 稀釋度的抗血清組PRRSV 拷貝數(shù)顯著低于PRRSV 組(P<0.01),表明1∶5.37 稀釋度的抗血清能夠明顯抑制病毒復制;12 h 與48 h 時,1∶20 稀釋度的抗血清組與單獨病毒組相比,其基因拷貝數(shù)高于單獨病毒組,差異極顯著(P<0.01);1∶20 稀釋度的抗血清組與1∶2、1∶10、1∶40 稀釋度的抗PRRSV 血清組相比,其病毒拷貝數(shù)高于各組,差異極顯著(P<0.01)。根據(jù)上述結果并結合時間動態(tài)趨勢,1∶20 稀釋度的抗血清對PRRSV 感染PAMs 的促進作用明顯,因此選擇1∶20 稀釋度的抗PRRSV 血清進行后續(xù)試驗(圖1)。
圖1 不同稀釋度抗PRRSV 血清對PRRSV 感染PAMs 的影響Fig.1 Effects of different dilutions of anti-PRRSV serum on PRRSV infection in PAMs
按照方法1.2.3 中(1)將PRRSV 懸液感染PAMs 9 h 后加入豬新鮮血清128.7 μL,由圖2 可見,豬新鮮血清C3b、C4b 和CH50 濃度隨PRRSV感染時間的延長呈降低趨勢。根據(jù)各血清補體活性片段濃度的變化,本試驗確定每3 h 補充豬新鮮血清128.7 μL。
圖2 PRRSV 對豬新鮮血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 總活性的影響Fig.2 Effects of PRRSV on the activity of C3b, C4b, and total CH50 of fresh porcine serum
胞內(nèi)樣品經(jīng)qRT-PCR 檢測PRRSVN基因拷貝數(shù),如圖3A 所示,經(jīng)抗血清、新鮮血清處理后,除PRRSV 感染PAMs 12、24 h 時,A 組和B 組PRRSV 拷貝數(shù)均極顯著高于F 組(P<0.01);C組、D 組和E 組在0、36、48、60、72 h 時,病毒拷貝數(shù)均低于A 組、B 組,差異極顯著(P<0.01),由此表明豬新鮮血清促進了PRRSV 的胞內(nèi)增殖。
圖3 豬新鮮血清對PRRSV 增殖的影響Fig.3 Effects of fresh porcine serum on PRRSV proliferation
上清樣品經(jīng)qRT-PCR 檢測PRRSVN基因拷貝數(shù),結果顯示:在12、48、60 h 時,加有新鮮血清的B 組其病毒拷貝數(shù)均高于F 組,差異性極顯著(P<0.01);24、48 h 時,加有新鮮血清的A 組其病毒拷貝數(shù)均高于F 組,差異極顯著(P<0.01)。12、24、48、60 h 時無新鮮血清的C、D、E 組病毒拷貝數(shù)均低于A、B 組,差異極顯著(P<0.01);結合上述統(tǒng)計結果表明經(jīng)新鮮血清處理后,上清液中PRRSV 拷貝數(shù)水平呈現(xiàn)升高的趨勢(圖3B)。
將細胞內(nèi)、培養(yǎng)上清的PRRSVN基因拷貝數(shù)作總和處理,結果顯示:在0、36、48、60 h 時,加有新鮮血清的A、B 組其病毒拷貝數(shù)均高于F 組,差異極顯著(P<0.01);12、72 h 時,B 組病毒拷貝數(shù)高于F組,差異極顯著(P<0.01);24 h時,A 組病毒拷貝數(shù)高于F 組,差異極顯著(P<0.01);經(jīng)抗血清、新鮮血清處理后,除PRRSV 感染PAMs 12 、24 h 時,A組和B 組PRRSV 拷貝數(shù)均極顯著高于F 組(P<0.01);C 組、D 組和E 組在動態(tài)時間點中,平均拷貝數(shù)均極顯著低于A 組、B 組(P<0.01)。結合上述結果,表明經(jīng)豬新鮮血清處理,PRRSV 的增殖水平升高(圖3C)。
胞內(nèi)樣品經(jīng)qRT-PCR 檢測PRRSVN基因拷貝數(shù),結果顯示(圖4):在0、12、36、72 h 時,經(jīng)抗PRRSV 血清處理后的d 組其病毒拷貝數(shù)高于f 組,36 h 差異顯著(P<0.05),其余時間點差異極顯著(P<0.01);在0、12、24、72 h 時,經(jīng)CR1-like 單抗、FcR 單抗處理的e 組其拷貝數(shù)低于d 組,其中12、24 h 差異極顯著(P<0.01),0、72 h 差異顯著(P<0.05);在0、12、60 h 時,e 組拷貝數(shù)低于僅以FcR 單抗處理的a 組,差異極顯著(P<0.01);0、12、48 h時,a 組其病毒拷貝數(shù)高于f 組,差異極顯著(P<0.01),24、36、60、72 h 時,a 組病毒拷貝數(shù)顯著低于f組(P<0.05);0、36、48 h 時,僅以CR1-like 單抗處理的b 組其病毒拷貝數(shù)高于f組,其中36 h 差異顯著(P<0.05),0、48 h差異極顯著(P<0.01)。
圖4 CR1-like 免疫粘附功能對PRRSV 增殖的影響Fig.4 Effects of CR1-like immune adhesion function on PRRSV proliferation
本研究選擇PRRSV 抗體檢測為陰性的30 日健康齡斷奶長白仔豬為試驗對象,通過疫苗免疫獲得抗PRRSV 血清。為了最大程度地模擬臨床PRRSV 感染的實際情況,試驗中先以病毒感染PAMs再加入抗血清的模式設計試驗。試驗首先對所收集的抗血清中和效價進行測定,并通過倍比稀釋試驗確定了亞中和抗體滴度(1∶20 稀釋度抗血清),以保證試驗檢測的科學性。在此基礎上,本試驗將抗PRRSV 血清進行5 個梯度稀釋,分別為1∶2、1∶5、1∶10、1∶20 和1∶40,通過qRT-PCR 檢測12、24、36、48 h 的PRRSVN基因拷貝數(shù)變化分析亞中和抗體滴度對PRRSV-ADE 效應的影響。從結果來看,體外條件下1∶20 稀釋度抗血清組的病毒拷貝數(shù)高于其它組,即該滴度下抗體與PRRSV 形成的抗原抗體復合物明顯促進了PRRSV 胞內(nèi)增殖;此外,除了其它亞中和滴度的抗血清也表現(xiàn)出了PRRSV-ADE 效應,這與已知的FcR 介導PRRSV 感染增強結果相一致[29-30]。上述結果說明本試驗所建立的研究體系表現(xiàn)出了PRRSV-ADE現(xiàn)象,符合后續(xù)試驗研究的要求。
CR1-like 是補體活性成分C3b 的受體,兩者的結合是CR1-like 功能發(fā)揮的分子基礎[31],因此在討論CR1-like 是否為ADE 介導因素時,首先應考慮豬新鮮血清對PRRSV-ADE 效應的影響。本試驗以豬新鮮血清為C3b 來源,但是鑒于體外條件下豬新鮮血清中C3b 消耗對試驗結果的影響,所以首先對豬血清活性的動態(tài)變化進行了檢測,以確定試驗體系中新鮮血清補充的時間點(3 h)及劑量(128.7 μL),以保證試驗的精確性。PRRSV 體內(nèi)感染可以局限于某些組織,易感巨噬細胞沒有以較高的速度死亡,那么感染細胞的數(shù)量就會穩(wěn)步下降,最終免疫反應能夠清除感染。為保證體外感染條件更接近于體內(nèi)感染狀態(tài),本試驗選擇PRRSV 感染PAMs 9 h 后,同時加入1∶20 倍稀釋抗PRRSV 血清和豬新鮮血清進行細胞試驗,qRT-PCR 檢測0、12、36、48、60 和72 h PRRSVN基因拷貝數(shù)變化。從統(tǒng)計結果來看,0~72 h 動態(tài)監(jiān)測期間,加入豬新鮮血清后,PRRSV 增殖表現(xiàn)出升高的趨勢;而加入滅活血清或PBS 后,PRRSV 增殖的促進作用表現(xiàn)得并不明顯。相比同行研究結果,本試驗結果表明豬新鮮血清、1∶20 稀釋度抗PRRSV 血清的存在對PRRSV 的增殖具有協(xié)同促進的作用。
在確定豬新鮮血清能夠促進PRRSV 增殖的基礎上,圍繞“CR1-like 活性對PRRSV-ADE 效應的影響”這一問題進行試驗。通過CR1-like McAb、FcR McAb(CD64、CD32、CD16)分別實現(xiàn)PAMs表面CR1-like、FcR 阻斷以及兩者的共阻斷,經(jīng)qRT-PCR 檢測PAMs 胞內(nèi)PRRSVN基因拷貝數(shù)的變化來定量分析PAMs 表面免疫粘附受體CR1-like 對PRRSV 感染的影響。從統(tǒng)計結果來看,PAMs 表面CR1-like、FcR 未被單抗阻斷時(d 組),PRRSV 胞內(nèi)增殖水平顯著高于單獨病毒感染對照組,且PRRSVN基因拷貝高峰出現(xiàn)時間早于對照組(f組),與前文結果趨勢一致;同時阻斷CR1-like、FcR 兩類受體的活性后(e 組),PRRSV 胞內(nèi)增殖水平降低,由此可推測FcR 活性、CR1-like 活性均與PRRSV 胞內(nèi)增殖有關。前期已有試驗表明PRRSV 通過FcR 途徑促進病毒復制導致感染增強[32],這與本試驗結果一致。有研究表明,HIV、WNV、埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)、登革熱病毒(Dengue virus, DENV)等病毒的相關研究發(fā)現(xiàn)亦具有ADE 特點,且病毒ADE 介導途徑除了FcR介導外,還能通過補體受體途徑介導[33-34]。然而PRRSV 能否通過補體受體途徑促進病毒增殖未有報道。為此,本試驗先將FcR 阻斷,檢測發(fā)現(xiàn)封閉FcR 且保留CR1-like 活性時,PRRSVN基因增殖水平呈現(xiàn)出下降的趨勢。然后再將CR1-like 以單抗封閉僅保留FcR 活性時,PRRSVN基因增殖水平也呈現(xiàn)出下降的趨勢,即CR1-like、FcR 的活性均與PRRSV-ADE 效應具有相關性。本研究認為,體系中加入抗PRRSV 血清后與PRRSV 形成抗原抗體復合物,豬新鮮血清在抗原抗體復合物的刺激下活化產(chǎn)生C3b 片段[35],體系中抗原抗體復合物被C3b 致敏,PAMs 表面的CR1-like 通過C3b 與PRRSV 抗原抗體復合物結合,從而促進了PRRSV-ADE 效應的產(chǎn)生;當豬新鮮血清被滅活或PAMs 表面的CR1-like 被阻斷后,PRRSV 抗原抗體復合物無法與PAMs 表面的CR1-like 結合,從而降低了PRRSV-ADE 效應,PRRSV 胞內(nèi)拷貝數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢。
此外,一方面由于試驗材料抗PRRSV 血清量的有限性,因此本試驗尚不能確定抗血清與豬新鮮血清對PRRSV 增殖的作用兩者之間的差別;第二,目前由于尚無商品化的豬補體成分缺省血清,因此具體是哪一類補體成分影響PRRSV 的增殖尚未鑒定;第三,補體活化過程是正向不可逆,試驗體系中需要不斷加入豬新鮮血清以補充C3b,由此導致培養(yǎng)板需要反復移動以及后期培養(yǎng)基體積過多,細胞生長狀態(tài)存在不穩(wěn)定性,對試驗結果也可能造成影響。更重要的是,雖然本研究發(fā)現(xiàn)PAMs 表面的CR1-like 具有協(xié)同促進PRRSV-ADE 效應的生理作用,但是其具體的分子機理尚未明確,仍需進一步試驗。
綜上所述,本研究結果表明在體外條件下,亞中和水平的抗PRRSV 血清能與PRRSV 形成抗原抗體復合物。該復合物經(jīng)豬新鮮血清致敏,可與PAMs 膜表面的CR1-like 分子相互結合。在CR1-like 的介導下,PRRSV 抗原抗體復合物進入PAMs胞內(nèi)并出現(xiàn)PRRSV 的增殖,表現(xiàn)出PRRSV-ADE效應。本研究為進一步闡明CR1-like在PRRSV 感染免疫應答中的生物學功能提供了科學數(shù)據(jù),拓展了對PRRSV-ADE 效應機理的認識,為臨床上PRRSV 持續(xù)性感染的有效防治提供了新的靶點策略。