張鵬翔，吳佳豪，冀云燕，薛霖莉，董亞潔，宮澤恩，郝曉靜，曹校瑞，赫曉燕

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

骨骼肌是動物體重要的組織器官，在人體中占體重的40%。骨骼肌在動物體中行使包括運(yùn)動、發(fā)聲、呼吸、內(nèi)分泌、營養(yǎng)［1］和調(diào)節(jié)體內(nèi)離子平衡等在內(nèi)的多種功能［2］。對于畜牧業(yè)來說，肌肉也是重要的產(chǎn)品，因此骨骼肌對人類生活非常重要。大部分脊椎動物肌纖維的數(shù)目在出生前就已經(jīng)確定，出生后纖維只會產(chǎn)生大小和體積的變化，而不會有肌纖維數(shù)量上的增加［3］。但是在動物體生活過程中，有很多途徑可能導(dǎo)致肌肉損傷，這時就需要肌肉自我修復(fù)。肌肉組織的損傷修復(fù)主要依靠衛(wèi)星細(xì)胞，衛(wèi)星細(xì)胞是胚胎期一部分成肌細(xì)胞附著在肌纖維表面，并且在動物體生長過程中一直保持增殖能力的細(xì)胞［4］。衛(wèi)星細(xì)胞一旦被激活就迅速表達(dá)MyoD，隨后共表達(dá)Pax7，M-cadherin 和Myf5，接著細(xì)胞進(jìn)入分裂期開始表達(dá)PCNA，而MyoG 的表達(dá)標(biāo)志著細(xì)胞進(jìn)入生肌分化階段，最后表達(dá)的是骨骼肌結(jié)構(gòu)基因actin 和MyHC［5］，它們與損傷肌纖維的殘端發(fā)生細(xì)胞膜融合，標(biāo)志著生肌分化進(jìn)入最后時期，細(xì)胞損傷修復(fù)完成。

生長分化因子11（Growth and differentiation factor 11，GDF11），又名骨形態(tài)發(fā)生蛋白11（Bone morphogenetic protein，BMP11）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員之一。GDF11 在動物體各個組織器官中均有表達(dá)，并且在動物體發(fā)育過程中的作用是不可或缺的。在小鼠胚胎發(fā)育期GDF11 能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育［6-7］、肢體正確定位［8］；在成年小鼠中GDF11 則承擔(dān)著抑制成骨細(xì)胞分化［9］、保護(hù)性腺［10］、支持皮膚修復(fù)［11］等多種重要作用。但對于肌肉來說，GDF11 的作用有一些爭議：一方面有研究發(fā)現(xiàn)，GDF11 能夠系統(tǒng)性的調(diào)節(jié)肌肉衰老，且可以逆轉(zhuǎn)與年齡相關(guān)的骨骼肌和干細(xì)胞功能障礙［12］。另一方面，還有一些研究認(rèn)為GDF11 是骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子［13-16］。已有的研究證明，GDF11 能夠作用于TGF-β/SMAD 信號通路，激活SMAD2/3，參與包括心肌細(xì)胞活性調(diào)控、骨形成、胚胎發(fā)育中的軸向定位、肝再生等眾多生理活動［17-20］；在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和3T3-L1 脂肪細(xì)胞中可以激活SMAD1/5/8 表達(dá)［21-22］。對GDF11 激活非SMAD 通路研究顯示，GDF11 能夠在神經(jīng)干細(xì)胞中激活ERK 和AKT 通路［23］、在脂肪細(xì)胞中激活A(yù)KT 信號通路［24］、在間充質(zhì)干細(xì)胞和成肌細(xì)胞中激活ERK 通路［25-26］。但GDF11 在骨骼肌細(xì)胞中能否激活A(yù)KT 通路并未得到有效證明。

為了探究GDF11 是否在骨骼肌中發(fā)揮積極作用，以及是否作用于AKT 通路發(fā)揮作用。本研究以不同發(fā)育階段小鼠和C2C12 細(xì)胞為材料，取不同發(fā)育階段小鼠腓腸??；通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化和衰老，并在細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體和siRNA 載體、AKT 抑制劑；檢測分化和衰老過程中GDF11 的表達(dá)量、分化基因MyoG、以及AKT 通路蛋白表達(dá)量，以探究GDF11 對骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育的影響及其在其中激活的非SMAD 調(diào)控通路，以期為肌肉發(fā)育提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物和細(xì)胞

小鼠為C57BL/6，來源于山西省人民醫(yī)院實驗動物中心；小鼠胚胎肌母細(xì)胞C2C12 細(xì)胞，來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試驗試劑

DMEM 購自以色列BI；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自中國賽默飛；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、胎牛血清等均購自中國碧云天；特級馬血清、DMSO 等購自中國索萊寶。

C2C12完全培養(yǎng)基：DMEM+10%胎牛血清+1%青鏈霉素。C2C12 分化培養(yǎng)基：DMEM+2%特級馬血清+1%青鏈霉素。C2C12 細(xì)胞凍存液：完全培養(yǎng)基+5%DMSO，現(xiàn)配現(xiàn)用。

一 抗 ：GAPDH（60004-1-AP）、β -actin（20536-1-AP）購自美國proteintech 公司；GDF11（48224）、AKT（14252）、MyoG（54416）購自中國SAB；p-AKT（4060）購自美國cell signaling technology。二抗：山羊抗兔（abs2002）、山羊抗鼠（abs2001）購自中國優(yōu)寧維。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)和取材

從山西省人民醫(yī)院實驗動物中心購入2 周齡和6 周齡C57BL/6 小鼠，給予充分飲食和飲水，光照時長為每日12 h。對于2 周齡小鼠，直接斷頸處死，取腓腸肌，液氮冷凍備用。對于6 周齡小鼠，將其隨機(jī)分為3 組，每組6 只，飼養(yǎng)至相應(yīng)發(fā)育階段（7 周齡、10 周齡和15 月齡）后斷頸處死，取腓腸肌，液氮冷凍備用，用于蛋白印跡試驗。

1.2.2 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)及分化

凍存的C2C12 細(xì)胞復(fù)蘇后，用完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到95% 時，傳代到6 孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時，更換為分化培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞分化。在分化后的1、3、5、7 d 分別收取3 孔細(xì)胞蛋白樣品，用蛋白免疫印跡法檢測GDF11 在不同分化時間的表達(dá)。

1.2.3 C2C12 細(xì)胞衰老誘導(dǎo)及檢測

在分化培養(yǎng)基中添加D-半乳糖，使其中D-半乳糖終濃度分別為0、5、10、20 和40 mg·mL-1，配置衰老誘導(dǎo)培養(yǎng)基。首先誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化7 d，使其分化出明顯肌管；然后更換為衰老誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分為5 組，每組3 孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)、使用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒對細(xì)胞衰老誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行分析，同時蛋白免疫印跡法分析不同衰老時間GDF11 的表達(dá)。

1.2.4 C2C12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)6 孔板中細(xì)胞密度達(dá)到80%時，更換為不含雙抗的完全培養(yǎng)基。用DMEM 稀釋過表達(dá)GDF11 載體、siRNA 載體和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑；將轉(zhuǎn)染試劑和載體混合后靜置一段時間，滴加轉(zhuǎn)染混合液輕輕搖晃使其混勻。培養(yǎng)6 h 后更換為分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞分化情況。

1.2.5 細(xì)胞通路阻斷試驗

將AKT 通路抑制劑LY294002 用DMSO 溶解，在分化培養(yǎng)基中按照0.01%的比例添加抑制劑，4 ℃?zhèn)溆?。將?xì)胞分為7 組，每組3 孔。對照組：分化培養(yǎng)；空載組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后分化培養(yǎng)；空載+DMSO 組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后用添加了DMSO 的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)；過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后分化培養(yǎng)；過表達(dá)+DMSO 組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后用添加了DMSO 的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)；LY294002 組：用含LY294002 的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)；過表達(dá)+LY294002 組：轉(zhuǎn)染了過表達(dá)質(zhì)粒后用含LY294002 的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。6 h 后收取細(xì)胞蛋白樣品，蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞分化狀態(tài)。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測

樣品為提取的小鼠腓腸肌蛋白和C2C12 細(xì)胞蛋白。取適量樣品加蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白樣品變性。隨后進(jìn)行SDS-PAGE 膠凝膠電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%封閉液室溫?fù)u床封閉1 h。洗去封閉液后加入一抗孵育液，4 ℃搖床孵育12～16 h；洗去一抗孵育液，加入二抗孵育液37 ℃搖床孵育1 h；洗去二抗孵育液。用ECL 發(fā)光液曝光，用Image J 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。根據(jù)條帶灰度值和面積，分析蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDF11在不同發(fā)育階段小鼠腓腸肌中的表達(dá)

如圖1 所示，與幼齡期（2 周齡）小鼠相比，性成熟（7 周齡）和體成熟期（10 周齡）小鼠腓腸肌內(nèi)GDF11 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），并且性成熟期和體成熟期之間無差異，老齡期（15 月齡）小鼠腓腸肌GDF11 表達(dá)量顯著增多（P＜0.05）。

圖1 GDF11 在不同發(fā)育階段小鼠腓腸肌中的表達(dá)Fig. 1 Expression of GDF11 in mouse gastrocnemius muscle at different growth stages

2.2 C2C12 細(xì)胞成肌分化過程中伴隨著GDF11的變化

在7 d 的分化過程中，可以看到細(xì)胞逐漸融合，形成清晰可見的肌管；在分化形成肌管的過程中，成肌細(xì)胞不斷融合、肌管逐漸變粗（圖2A）。隨后對C2C12 細(xì)胞在不同分化時間階段中的GDF11 表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2B 所示，在分化前期GDF11 表達(dá)量逐漸上升但與0 d 相比無顯著差異；3 d 的GDF11 表達(dá)量顯著升高（P＜0.001），隨后開始逐漸下降，7 d 時GDF11 的表達(dá)量與1 d 無顯著差異。

圖2 GDF11 在C2C12 成肌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)Fig. 2 Expression of GDF11 during C2C12 myoblast differentiation

2.3 肌管細(xì)胞衰老過程中伴隨著GDF11 的變化

細(xì)胞形態(tài)觀察和β-半乳糖苷酶染色試驗結(jié)果顯示，D-半乳糖導(dǎo)致C2C12 細(xì)胞衰老呈現(xiàn)劑量依賴性，高濃度的D-半乳糖更能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，并導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少（圖3A～3B）。檢測衰老過程中GDF11 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，隨著D-半乳糖濃度的升高，GDF11 表達(dá)量也逐漸升高，并且在D-半乳糖濃度為40 mg·mL-1時達(dá)到最高（圖3C～3F）。

圖3 GDF11 在C2C12 細(xì)胞衰老過程中的表達(dá)變化Fig. 3 Expression of GDF11 in C2C12 cells during senescence

2.4 轉(zhuǎn)染GDF11 過表達(dá)載體和siRNA 載體對C2C12 細(xì)胞成肌分化的影響

轉(zhuǎn)染了GDF11 過表達(dá)載體和siRNA 載體（Si-GDF11）的細(xì)胞分化形態(tài)顯示，對照組和轉(zhuǎn)染了空載質(zhì)粒的C2C12 細(xì)胞在分化3 d 就展現(xiàn)出分化跡象，并且在分化形成肌管的過程中，不斷融合、形成肌管，并且肌管逐漸變粗；而轉(zhuǎn)染了過表達(dá)載體的C2C12 細(xì)胞，則在9 d 才展現(xiàn)出分化跡象（圖4A）。在轉(zhuǎn)染了Si-GDF11 的細(xì)胞中，觀察到C2C12 細(xì)胞分化進(jìn)程并沒有明顯改變，3 d 內(nèi)表現(xiàn)出與對照組相同的分化狀態(tài)（圖4B）。

圖4 過表達(dá)和沉默GDF11 對C2C12 細(xì)胞分化的影響Fig. 4 Effects of overexpression and silencing of GDF11 on C2C12 cell differentiation

2.5 阻斷AKT 信號通路對GDF11 造成C2C12細(xì)胞成肌分化抑制的影響

在C2C12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染了過表達(dá)GDF11 載體的基礎(chǔ)上，向其中加入了LY294002。結(jié)果顯示，過表達(dá)GDF11 能夠?qū)е翧KT 的磷酸化水平顯著升高，添加抑制劑能夠降低AKT 的磷酸化水平，但并未能恢復(fù)到對照組的同等水平。對MyoG 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，過表達(dá)GDF11 顯著降低了MyoG的表達(dá)，在過表達(dá)GDF11 的基礎(chǔ)上添加LY294002 的能夠提高M(jìn)yoG 基因在C2C12 細(xì)胞中的表達(dá)（圖5A～5B）。

圖5 GDF11 影響C2C12 細(xì)胞分化的通路分析Fig. 5 The pathway of GDF11 affecting C2C12 cell differentiation

3 討論

GDF11 作為廣泛表達(dá)在哺乳動物各組織器官中的一種細(xì)胞因子，在動物體發(fā)育過程中不可或缺。在前人的研究中，對GDF11 與肌肉的關(guān)系有著不同的認(rèn)識，有研究顯示，GDF11 是恢復(fù)老年小鼠肌肉活力的活性因子［12］、對心肌也有保護(hù)作用［27］。但另外的研究顯示，GDF11 則會導(dǎo)致骨骼肌和心肌的體積減小，對骨骼肌的發(fā)育有抑制作用［16］。本試驗結(jié)果顯示，GDF11 表達(dá)量在不同年齡段小鼠中有差異，并且老齡小鼠中GDF11 表達(dá)量更高。這說明骨骼肌內(nèi)GDF11 蛋白豐度與年齡呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。

在前人的研究中，探究過GDF11 與C2C12 細(xì)胞胰島素抵抗之間的關(guān)系［28］、GDF11 與成骨細(xì)胞分化的關(guān)系［29］。本試驗使用馬血清構(gòu)建體外骨骼肌分化模型，探究GDF11 對C2C12 細(xì)胞成肌分化的影響；結(jié)果顯示，在C2C12 細(xì)胞分化的過程中，GDF11 在分化前期表達(dá)量升高，隨后減少并在7 d恢復(fù)最初的水平。根據(jù)前人研究［30］，使用D-半乳糖構(gòu)建體外骨骼肌衰老模型，在處理過程中觀察到C2C12 細(xì)胞的衰老與D-半乳糖呈現(xiàn)劑量依賴性；對GDF11 的檢測結(jié)果顯示，衰老的C2C12 細(xì)胞GDF11 的表達(dá)量更高；這個結(jié)果顯示了C2C12細(xì)胞的衰老過程中伴隨著GDF11 的表達(dá)，與體內(nèi)試驗相一致。為了進(jìn)一步探究GDF11 對骨骼肌細(xì)胞分化的影響，本試驗向C2C12 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了GDF11 過表達(dá)載體和Si-GDF11，再對細(xì)胞進(jìn)行分化；這一試驗結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了GDF11 過表達(dá)載體的C2C12 細(xì)胞中，細(xì)胞分化時間推遲了數(shù)天；轉(zhuǎn)染了Si-GDF11 的C2C12 細(xì)胞，細(xì)胞分化狀態(tài)與對照組并無不同。同時，在對MyoG 的檢測中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GDF11 會導(dǎo)致MyoG 基因表達(dá)量顯著降低。這個結(jié)果顯示，GDF11 能夠抑制C2C12 細(xì)胞分化。

Hammers 等［16］在研究中表明，GDF11 結(jié)合ActRⅡB 激活SMAD2/3 從而誘導(dǎo)骨骼肌萎縮；Wang 等［20］發(fā)現(xiàn)GDF11 在神經(jīng)干細(xì)胞中激活MAPK 信號通路；Lu 等［24］發(fā)現(xiàn)GDF11 在脂肪組織中激活A(yù)KT 和AMPK 信號通路從而促進(jìn)脂肪棕色化；Masuzawa 等［25］發(fā)現(xiàn)GDF11 能夠激活ERK信號通路從而引起骨骼肌細(xì)胞分化抑制或肌肉萎縮。本試驗運(yùn)用AKT 通路阻斷劑LY294002 探究GDF11 能否在成肌細(xì)胞中激活A(yù)KT 信號通路。在過程中用LY294002 處理3 天C2C12 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種處理條件下細(xì)胞不僅在處理期間不分化，而且在處理結(jié)束后依然不分化，這可能是由于LY294002 誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。 因此本試驗將LY294002 的處理時間減為了6 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理結(jié)束后C2C12 細(xì)胞能夠正常分化。隨后對過表達(dá)GDF11 的細(xì)胞中添加LY294002 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GDF11 會導(dǎo)致AKT 磷酸化水平上升和MyoG水平下降，而添加LY294002 會顯著降低AKT 的磷酸化水平并提高M(jìn)yoG 表達(dá)水平，但均未能恢復(fù)到對照組的同等水平。這一結(jié)果表明，GDF11在C2C12 成肌細(xì)胞中能夠抑制骨骼肌細(xì)胞分化和激活A(yù)KT 信號通路，阻斷AKT 信號通路能夠逆轉(zhuǎn)GDF11 抑制骨骼肌細(xì)胞分化的情況。

綜上，本研究從C2C12 成肌細(xì)胞層面探究了GDF11 對骨骼肌細(xì)胞分化和生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)GDF11 能夠通過AKT 信號通路抑制了骨骼肌發(fā)育，這為進(jìn)一步探究GDF11 的生理功能提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究對GDF11 在骨骼肌細(xì)胞分化和衰老過程中發(fā)揮的作用和激活通路進(jìn)行分析，結(jié)果表明，GDF11 的表達(dá)量與骨骼肌細(xì)胞衰老程度呈正相關(guān)，并且GDF11 能夠抑制骨骼肌細(xì)胞分化，是骨骼肌生長和發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，可以通過激活A(yù)KT通路發(fā)揮作用，為揭示GDF11 影響骨骼肌生長發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供理論支持。