謝慧臣,冉云,張?jiān)?歐陽(yáng)瑜,唐浪,吳廣陽(yáng)

(1.湖北民族大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.恩施德元升中醫(yī)醫(yī)院 中醫(yī)科,湖北 恩施 445000)

麩炒法是中藥傳統(tǒng)炮制工藝,又稱麥麩炒或麩皮炒,其炮制方法是將切制或凈制后的中藥加相應(yīng)比例的麥麩拌炒至藥材表面呈金黃色時(shí)取出,篩去麩皮,放涼備用。目前麩炒法的作用機(jī)理研究使人們對(duì)其影響中藥療效的機(jī)理有了一定的認(rèn)識(shí)［1］。蒼術(shù)是應(yīng)用麩炒法的典型常用中藥,具有健脾、燥濕、祛風(fēng)、散寒、解郁、辟穢等功效。麩炒蒼術(shù)與生蒼術(shù)功效有所差異,其原因是麩炒后蒼術(shù)化學(xué)成分及含量發(fā)生了較大變化［2］。盡管蒼術(shù)臨床應(yīng)用廣泛,目前對(duì)蒼術(shù)的研究主要集中在不同的炮制方法下其活性成分種類及化學(xué)成分的變化方面,而對(duì)蒼術(shù)藥理作用的實(shí)驗(yàn)研究還較為欠缺,尤其缺乏細(xì)胞與分子層面的研究,且對(duì)其單體有效成分的藥理研究尚屬空白［3］。本研究以脾虛證大鼠為模型,從結(jié)腸組織通透性及CAM-MLCK信號(hào)通路入手進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以期從結(jié)腸黏膜屏障的損傷與修復(fù)過程途徑闡明蒼術(shù)麩炒后改善脾虛證候的藥理作用機(jī)制,為后續(xù)麩炒蒼術(shù)單體成分的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠60只,3～4月齡,體質(zhì)量為(150±20)g,購(gòu)自武漢子科恒生物科技有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)20190116,使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2020-0203］。本研究已通過湖北民族大學(xué)倫理委員會(huì)審批(審批號(hào):2019054)。常規(guī)喂養(yǎng),自由進(jìn)食水。

1.1.2 藥物與試劑

中藥購(gòu)自湖北省恒信醫(yī)藥有限公司?？嗪茪夥剿幰号渲品椒?厚樸、枳實(shí)、大黃的用藥質(zhì)量比為5∶3∶4,常規(guī)煎煮2次;麩炒蒼術(shù)藥液配制方法:蒼術(shù)飲片洗凈干燥,先后加入10倍體積和8倍體積蒸餾水煎煮2次,45 min/次,濾液合并濃縮?？嗪茪夥綕饪s液生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL,麩炒蒼術(shù)生藥質(zhì)量濃度1 g/mL,低溫保存,使用時(shí)加入蒸餾水稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度。復(fù)方谷氨酰胺腸溶膠囊(批號(hào):200104)購(gòu)自地奧集團(tuán)成都藥業(yè)股份有限公司。

閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1,批號(hào):B3305)、密封蛋白-1(Claudin-1,批號(hào):B2021)、密封蛋白-2(Claudin-2,批號(hào):B2022)、閉合蛋白(Occludin)ELISA試劑盒(批號(hào):B2040)購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司;磷酸化絲裂原細(xì)胞外激酶1/2(phosphorylated mitogen extracellular kinase1/2,p-MEK1/2)一抗(批號(hào):G3125)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase1/2,p-ERK1/2)一抗(批號(hào):G2014)、熒光二抗(批號(hào):GB25021)、磷酸化蛋白酶抑制劑(批號(hào):G2301)、肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK,批號(hào):G3412)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CAM)兔抗鼠免疫球蛋白(IgG)多克隆抗體(批號(hào):G2361)、免疫熒光染色試劑盒(批號(hào):F2021)、DAB顯色劑(批號(hào):G32415)購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司;RNA提取液(批號(hào):J312546)購(gòu)自Servicebio;HyPureTMMolecular Biology Grade Water(批號(hào):J413261)購(gòu)自HyClone;Trizol(批號(hào):J402134)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(批號(hào):J265143)引物購(gòu)自Thermo。引物序列見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.1.3 儀器

Stepone plus GC-1500 型熒光定量PCR儀(ABI)、D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(DragonLab)、Rt2100c酶標(biāo)檢測(cè)儀(Rayto)、alphaEaseFC灰度分析軟件(Alpha Innotech)、Adobe PhotoShop圖像分析軟件(Adobe)、NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo)、NE600光學(xué)顯微鏡、XK-S2000D熒光顯微鏡購(gòu)自西尼科光學(xué)儀器有限公司;AutoLumo A2000Plus化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,所有大鼠隨機(jī)分為6組:正常組(CON)、脾虛證模型組(MOD)、麩炒蒼術(shù)高、中、低劑量組(BRA-H、BRA-M、BRA-L)、復(fù)方谷氨酰胺組(CG),10只/組。除CON組外,其余大鼠均以慢性束縛、苦寒破氣加饑飽失常法建立脾虛證大鼠模型［4-5］。每kg大鼠每日以生藥20 g灌服苦寒破氣方1次,束縛架捆綁束縛3 h,后喂飼料(常規(guī)量的一半,隔日1次),持續(xù)21 d。造模結(jié)束后的第2天開始灌胃治療。根據(jù)體表面積公式換算,BRA-L、BRA-M、BRA-H組每kg大鼠每日中藥灌胃量分別為5、10、20 g,CG組為9 mg復(fù)方谷氨酰胺配制成的溶液2 mL;CON和MOD組予等體積生理鹽水進(jìn)行灌胃,持續(xù)14 d。

1.2.2 觀察結(jié)腸組織病理改變

治療結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水24 h,腹腔注射麻醉后,剖開胸腹腔,心臟采血6 mL,離心,取上清液,-80 ℃保存;切取部分結(jié)腸組織,液氮保存;再取部分使用4%多聚甲醛固定液固定,經(jīng)脫水和石蠟包埋后切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。另取部分使用透射電鏡觀察細(xì)胞超微病理學(xué)變化,步驟如下:戊二醛前固定→漂洗→脫水→包埋→超薄切片→鈾、鉛染色→電鏡觀察。

1.2.3 Elisa法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

低溫下取結(jié)腸組織一塊,冰生理鹽水洗凈濾干,9倍體積生理鹽水勻漿,低溫高速離心(4 ℃ 3 500 r/min)10 min,收集細(xì)胞上清液,使用Elisa法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織細(xì)胞p-MEK1/2、p-ERK1的蛋白分布及表達(dá)

取冷凍結(jié)腸組織一塊,切片(厚度約200 μm),37 ℃烘烤過夜,脫蠟,檸檬酸緩沖液修復(fù),PBS緩沖液沖洗2次,加一抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶200;Vp-ERK1∶VPBS=1∶200)孵育過夜;PBS緩沖液沖洗2次,二抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶400;Vp-ERK1∶VPBS=1∶400)孵育30 min;PBS緩沖液沖洗2次,加染液染色,CO2孵箱孵育30 min;PBS緩沖液沖洗3次,封片,熒光標(biāo)記后使用熒光顯微鏡連續(xù)攝取圖片采集圖像,Adobe PhotoShop圖像分析系統(tǒng)測(cè)定并分析熒光強(qiáng)度。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織細(xì)胞MLCK、CAM的蛋白表達(dá)

取結(jié)腸組織一塊,4%多聚甲醛溶液固定,包埋,按照免疫組織化學(xué)SABC法步驟操作,切片放入3%H2O2溶液10 min,蒸餾水沖洗3次,PBS緩沖液行微波修復(fù),滴加5%BSA封閉液,37 ℃反應(yīng)30 min,滴加MLCK、CAM一抗(VMLCK∶VPBS=1∶200;VCAM∶VPBS=1∶200),4 ℃反應(yīng)過夜,PBS緩沖液沖洗3次,滴加二抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶400;Vp-ERK1∶VPBS=1∶400),37 ℃反應(yīng)30 min,PBS緩沖液沖洗3次,滴加SABC,PBS沖洗3次,DAB顯色,蘇木素復(fù)染后蒸餾水洗滌,37 ℃恒溫過夜,封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞MLCK、CAM蛋白表達(dá)。運(yùn)用Image-ProPlus軟件采集圖像并定量分析免疫組化結(jié)果,以平均光密度值表達(dá),MLCK、CAM陽(yáng)性染色為棕色或棕黃色。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸組織細(xì)胞的MLCK、CAMmRNA表達(dá)

取勻漿管,加入1 mL Trizol Reagent,置冰上預(yù)冷;取100 mg結(jié)腸組織,加入勻漿管中,勻漿儀充分研磨,離心取上清;加入250 μL三氯甲烷,充分混勻靜置,取上清;加入異丙醇混勻,離心,吸除上清;乙醇洗滌沉淀,離心,吸除上清;加水溶解RNA,孵育5 min;Nanodrop 2 000檢測(cè)RNA濃度及純度,抽提總RNA。取10 μL RNA溶液,加入1 μL oligo(dT)18,4 μL 5× Reaction Buffer,2 μL 10 mmol/L dNTP Mix,1 μL RiboLock RNAase抑制劑(20 U/μL)和1 μL RevertAi M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL),進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取0.2 mL PCR管,配制如下反應(yīng)體系:2× qPCR Mix 12.5μL,7.5 μmol/L基因引物2.0 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL,ddH2O 8.0 μL,定量PCR。預(yù)變性95 ℃,10 min,循環(huán)95 ℃,15 s→60 ℃,60 s(40次),熔解曲線60 ℃→95 ℃,每15 s升溫0.3 ℃,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)結(jié)果進(jìn)行如下處理:采用ΔΔCT法,即2-K計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,K=［CT(待測(cè)樣本,目的基因)-CT(待測(cè)樣本,內(nèi)標(biāo)基因)］-［CT(對(duì)照樣本,目的基因)-CT(對(duì)照樣本,內(nèi)標(biāo)基因)］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 脾虛證大鼠模型構(gòu)建情況

造模期間每天觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、修飾行為及大便性狀等的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CON組大鼠精神狀態(tài)良好,行為活躍,反應(yīng)靈敏,毛發(fā)光澤,大便質(zhì)地正常。造模大鼠第1周開始逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、扎堆懶動(dòng)、大便漸稀等表現(xiàn),第2～3周活動(dòng)進(jìn)一步減少,倦怠蜷臥等表現(xiàn)日益明顯,毛色逐漸泛黃、黯淡稀疏無(wú)光,食量進(jìn)一步下降,體質(zhì)量明顯減輕,唇色逐漸變淡,大便稀溏不成形且肛周污穢,提示脾虛證大鼠模型構(gòu)建成功。

2.2 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

光鏡觀察各組大鼠結(jié)腸組織HE染色后的微觀結(jié)構(gòu)變化。CON組結(jié)腸黏膜上皮及固有層基本完整;MOD組結(jié)腸黏膜上皮水腫、變性、糜爛、壞死,固有膜結(jié)構(gòu)破壞、崩解,毛細(xì)血管充血明顯,潰瘍形成;各治療組結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)不同程度修復(fù),水腫減輕,毛細(xì)血管充血不同程度下降,炎性細(xì)胞分布范圍不同程度縮小,其中BRA-H組修復(fù)效果最為明顯(圖1)。

透射電鏡觀察各組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。CON組結(jié)腸壁細(xì)胞呈橢圓形,胞膜及胞核正常,胞內(nèi)線粒體形態(tài)多數(shù)正常;MOD組結(jié)腸上皮細(xì)胞壞死腫脹,細(xì)胞間隙增寬,胞質(zhì)空泡樣變,胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯下降且結(jié)構(gòu)異常,連接復(fù)合體消失,線粒體固縮伴空泡化,嵴斷裂,分泌小管不完整;各治療組結(jié)腸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)不同程度改善,其中BRA-H組修復(fù)效果最為明顯,與CON組比較無(wú)明顯差別(圖2)。

圖1 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響(HE染色,×200)

圖2 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞超微病理學(xué)的影響(×8 000)

2.3 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的影響

與CON組比較,MOD組結(jié)腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低,Claudin-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高 (P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高,Claudin-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-H組ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高,Claudin-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-H組ZO-1、Claudin-1、Occludin的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高,Claudin-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低,且呈量效對(duì)應(yīng)關(guān)系(P<0.05,P<0.01,表2)。

表2 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 2 Effects of bran-fried Rhizoma Atractylodis on mass fraction of ZO-1,Claudin-1,Claudin-2,and Occludin in colon mucosa of rats with spleen deficiency syndrome

2.4 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸黏膜組織p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達(dá)的影響

與CON組比較,MOD組結(jié)腸黏膜組織p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達(dá)的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng) (P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達(dá)的熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-M、BRA-H組p-MEK1/2、p-ERK1熒光強(qiáng)度顯著降低 (P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-M、BRA-H組p-MEK1/2、p-ERK1熒光強(qiáng)度顯著降低,且呈量效對(duì)應(yīng)關(guān)系(P<0.05,P<0.01,圖3)。

2.5 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞中MLCK、CAM蛋白表達(dá)的影響

與CON組比較,MOD組結(jié)腸組織MLCK蛋白表達(dá)水平顯著升高,CAM蛋白表達(dá)顯著降低 (P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組MLCK蛋白表達(dá)水平顯著降低,CAM蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-M、BRA-H組MLCK蛋白表達(dá)水平顯著降低,CAM蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-M、BRA-H組MLCK蛋白表達(dá)水平顯著降低,CAM蛋白表達(dá)水平顯著升高,且呈量效對(duì)應(yīng)關(guān)系(P<0.05,P<0.01,圖4)。

A:各組大鼠結(jié)腸黏膜組織p-MEK1/2蛋白熒光染色結(jié)果(×400);B:各組大鼠結(jié)腸黏膜組織p-ERK1蛋白熒光染色結(jié)果(×400);C:各組大鼠結(jié)腸黏膜組織p-MEK1/2蛋白熒光強(qiáng)度水平各組大鼠結(jié)腸黏膜組織p-ERK1蛋白熒光強(qiáng)度水平與CON組比較,P<0.01;2)與MOD組比較,P<0.05;3)與MOD組比較,P<0.01

2.6 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸組織中MLCK、CAM mRNA表達(dá)的影響

與CON組比較,MOD組結(jié)腸組織中MLCKmRNA表達(dá)顯著升高,CAMmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01);與MOD組比較,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG組MLCKmRNA表達(dá)顯著降低,CAMmRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01);與CG組比較,BRA-H組MLCKmRNA表達(dá)顯著降低,CAMmRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01);與BRA-L組比較,BRA-M、BRA-H組MLCKmRNA表達(dá)顯著降低,CAMmRNA表達(dá)顯著升高,且呈量效對(duì)應(yīng)關(guān)系(P<0.05,P<0.01,表3)。

A:各組大鼠結(jié)腸組織CAM免疫組化染色結(jié)果(×400);B:各組大鼠結(jié)腸組織MLCK免疫組化染色結(jié)果(×400);C:各組大鼠結(jié)腸組織CAM蛋白平均光密度值各組大鼠結(jié)腸組織MLCK蛋白平均光密度值與CON組比較,P<0.01;2)與MOD組比較,P<0.05;3)與MOD組比較,P<0.01

表3 麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛證大鼠結(jié)腸組織中MLCK、CAM mRNA表達(dá)的影響Table 3 The effects of bran-fried Rhizoma Atractylodis on MLCK and CAM mRNA expression in colon tissue of rats with spleen deficiency syndrome

3 討論

脾虛證為臨床常見中醫(yī)證候,常表現(xiàn)出全身性病理狀態(tài),其動(dòng)物模型制備一直備受關(guān)注,目前一般認(rèn)為多因素復(fù)合造模方法更接近臨床實(shí)際情況［6］。中醫(yī)認(rèn)為,苦寒傷中、情志失調(diào)和飲食失節(jié)易致脾虛［7］。本研究采用慢性束縛、苦寒破氣加饑飽失常復(fù)合造模方法構(gòu)建脾虛證大鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脾虛證模型大鼠結(jié)腸病理情況明顯異常,光鏡下黏膜上皮水腫、變性、糜爛、壞死;透射電鏡下上皮細(xì)胞壞死腫脹、細(xì)胞間隙增寬,與正常大鼠比較差異明顯,說(shuō)明了上述脾虛證造模方法的科學(xué)性。

蒼術(shù)為菊科植物北或茅蒼術(shù)的干燥根莖,味甘、苦,性溫,歸脾、腎、肝經(jīng),具燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目之功效。從炮制作用看,生品辛溫苦燥,麩炒可緩和燥性使其氣變芳香,增加健脾燥濕作用［8］。研究表明,蒼術(shù)具有健胃的作用,其丙酮提取物、β-桉葉醇和茅蒼術(shù)醇對(duì)豚鼠回腸卡巴膽堿收縮呈明顯的對(duì)抗作用［9］。此外,蒼術(shù)的正丁醇萃取物對(duì)醋酸型、酒精型、幽門結(jié)扎型及吲哚美辛型胃潰瘍均有明顯的抑制作用,其作用機(jī)理可能與增多胃內(nèi)PGE2含量,促進(jìn)DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成和改善潰瘍病灶血循環(huán)相關(guān)［10］。亦有研究表明,麩炒蒼術(shù)增效的機(jī)理可能與蒼術(shù)麩炒后對(duì)腸道菌群和機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)及白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量增加有關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示,光鏡下,各治療組結(jié)腸黏膜上皮被破壞的結(jié)構(gòu)有不同程度修復(fù),透射電鏡下,各治療組結(jié)腸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)不同程度改善,其中尤以麩炒蒼術(shù)高劑量組改善最為顯著,表明麩炒蒼術(shù)可較好地修復(fù)脾虛證大鼠受損的腸黏膜。

腸黏膜屏障由機(jī)械、化學(xué)、免疫、生物等屏障構(gòu)成,其中腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白是腸黏膜機(jī)械屏障的主要結(jié)構(gòu),其組成包括Occludin、Claudins、JAM-A等跨膜蛋白和MAGI1、ZO-1等支架蛋白［12-13］。Claudins作為主要骨架蛋白支撐緊密連接形成致密的復(fù)合體,保持腸黏膜防御屏障的完整性［14-15］。Claudin-1屬于閉鎖蛋白,可防止腸黏膜液體流失及大分子彌散,保持腸上皮穩(wěn)態(tài)［16］。Occludin也屬于跨膜閉合骨架蛋白,對(duì)腸黏膜緊密連接有一定影響［17］。ZO-1是緊密連接的支架蛋白,具有橋梁蛋白的作用,與Occludin、Claudin-1結(jié)合,可使后兩者與腸黏膜細(xì)胞的骨架緊密結(jié)合［18］。Claudin-2在漏孔上皮中高表達(dá),是一種孔道形成蛋白,可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮及上皮細(xì)胞的通透機(jī)制達(dá)到調(diào)節(jié)腸屏障功能的作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn),脾虛證模型大鼠結(jié)腸組織中Claudin-1、ZO-1、Occludin表達(dá)水平明顯下降,Claudin-2表達(dá)水平明顯升高;麩炒蒼術(shù)干預(yù)后,ZO-1、Claudin-1、Occludin表達(dá)水平上調(diào),同時(shí)Claudin-2表達(dá)水平下降,其中尤以麩炒蒼術(shù)高劑量組變化最為明顯,表明麩炒蒼術(shù)可通過上調(diào)結(jié)腸緊密連接相關(guān)蛋白,下調(diào)Claudin-2的表達(dá)水平,雙相有機(jī)調(diào)節(jié)腸道間緊密連接相關(guān)蛋白,降低結(jié)腸細(xì)胞通透性,修復(fù)受損腸黏膜。

MEK是分裂原活化抑制劑,其主要作用是抑制MAP激酶［20］。ERK為蛋白激酶,是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵,磷酸化激活的ERKl/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi),進(jìn)而介導(dǎo)NF-κB、Ap-1、c-fos等的轉(zhuǎn)錄活化,參與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞惡變等多種生物學(xué)反應(yīng)［21］。CAM-MLCK通路對(duì)平滑肌細(xì)胞收縮具有調(diào)節(jié)作用,可調(diào)節(jié)結(jié)腸平滑肌的信號(hào)傳導(dǎo),許多細(xì)胞內(nèi)生理過程都有CAM的參與［22］。MLCK是一種蛋白激酶,與腸黏膜屏障的損傷和修復(fù)均有密切關(guān)系,研究已表明下調(diào)MLCK磷酸化可修復(fù)受損的腸黏膜［23］。MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)通路對(duì)MLCK的磷酸化具有調(diào)控作用,可通過激活MLCK,收縮內(nèi)皮細(xì)胞,增大細(xì)胞間隙促進(jìn)受損腸黏膜的修復(fù)［24］。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組比較,脾虛證模型大鼠結(jié)腸組織CAM蛋白和基因表達(dá)下降,MEK/ERK/MLCK信號(hào)通路被激活;p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表達(dá)、MLCK蛋白和基因表達(dá)明顯升高。研究結(jié)果提示,麩炒蒼術(shù)可通過上調(diào)CAM蛋白和基因表達(dá),降低內(nèi)臟高敏感性,抑制腸道平滑肌細(xì)胞收縮,調(diào)節(jié)正常胃腸激素分泌,促進(jìn)胃腸平滑肌蠕動(dòng),并調(diào)控相關(guān)胃腸激素及抑炎或促炎因子分泌。此外,麩炒蒼術(shù)還可抑制MEK/ERK/MLCK信號(hào)通路活化并進(jìn)一步提升細(xì)胞修復(fù)能力,增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞屏障,降低脾虛證大鼠結(jié)腸黏膜炎癥水平,保護(hù)結(jié)腸上皮,改善脾虛證模型大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞的病理狀態(tài),進(jìn)而調(diào)控相關(guān)胃腸激素及抑炎或促炎因子分泌。

作者貢獻(xiàn)聲明

謝慧臣:提出研究思路和框架,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),實(shí)施動(dòng)物實(shí)驗(yàn),撰寫及修改論文;冉云:提出研究思路和框架,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù);張?jiān)?、歐陽(yáng)瑜:提供研究方向與論文修改建議;唐浪、吳廣陽(yáng):參與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。