瑪伊拜爾·普拉提 熊榮康 霍 菁 溫 泉1，2，3）

（1）中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，合肥 230026；2）中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)大數(shù)據(jù)學(xué)院，合肥 230026；3）中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)集成影像中心，合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心，合肥 230026；4）濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濰坊 261054）

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）因其運動行為簡單，基因組和神經(jīng)連接組清楚，且基因可操作性強，成為研究神經(jīng)遞質(zhì)運動調(diào)控機制的理想模式動物［16-21］。秀麗線蟲背腹側(cè)肌肉交替收縮舒張產(chǎn)生可沿縱向體軸傳播的背腹側(cè)身體彎曲，由此驅(qū)動其正弦波運動［22-23］。在受到外界危險刺激時，秀麗線蟲會產(chǎn)生后退運動躲避危險，之后根據(jù)刺激的危險程度選擇繼續(xù)前進或者轉(zhuǎn)換方向［24］。

乙酰膽堿是秀麗線蟲神經(jīng)系統(tǒng)中運用最廣泛的神經(jīng)遞質(zhì)，目前已知秀麗線蟲體內(nèi)至少表達(dá)乙酰膽堿的30 種煙堿型受體、4種毒蕈堿型受體和至少4種氯離子通道受體［25］。已發(fā)現(xiàn)的4 種乙酰膽堿門控氯離子通道亞基（acetylcholine-gated chloride channel，ACC） 分別是ACC-1、ACC-2、ACC-3和ACC-4。其中ACC-1和ACC-2會形成同型通道，并且二者和ACC-3、ACC-4 會相互作用［26］。ACC受體4種亞基在多種感覺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元和中間神經(jīng)元均有表達(dá)［25］，但是由于對這些氯離子通道受體的體內(nèi)研究很少，對它們的具體功能仍然不清楚。有一項研究發(fā)現(xiàn)，ACC-2能夠介導(dǎo)中間神經(jīng)元AIY對其下游中間神經(jīng)元AIZ的抑制作用，從而參與調(diào)控秀麗線蟲運動方向的轉(zhuǎn)換［27］。ACC 受體在運動和其他生理過程中的功能尚待更多研究。

本文通過綜合運用行為追蹤、分子遺傳學(xué)和光遺傳學(xué)手段，分析了乙酰膽堿門控氯離子通道亞基（acc-1、acc-2、acc-3、acc-4）突變線蟲的自由運動。研究發(fā)現(xiàn)，這4種突變體的運動行為在不同時間尺度上的運動學(xué)特征都會發(fā)生變化，并且ACC受體可能參與介導(dǎo)中間神經(jīng)元RIB對后退運動的抑制性調(diào)控。通過本文的研究，希望能夠為乙酰膽堿門控抑制性受體對運動行為的調(diào)控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒制備

通過PCR 法從野生型秀麗線蟲品系N2 中擴增得到在RIB神經(jīng)元中特異表達(dá)的啟動子Psto-3和用于標(biāo)記線蟲尾部的啟動子Plin-44，通過DNA 重組法得到質(zhì)粒Psto-3::Chrimson::wCherry、Plin-44::GFP。

1.2 秀麗線蟲的培養(yǎng)與品系制備

野生型、轉(zhuǎn)基因、基因突變秀麗線蟲品系均在16~22℃黑暗環(huán)境下用線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth media，NGM）進行培養(yǎng)。乙酰膽堿門控氯離子通道亞基突變線蟲品系acc-1(tm3268)、acc-2(tm3219)、acc-3(tm3174)和acc-3(tm7453) 購 自 NBRP （National BioResource Project），acc-2(ok2216)和acc-4(ok2371)購自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）。表達(dá)光敏感蛋白Chrimson 的線蟲品系均是通過在線蟲性腺內(nèi)顯微注射相關(guān)質(zhì)粒得到，挑取第三代表達(dá)目標(biāo)蛋白的線蟲用于實驗。制備的轉(zhuǎn)基因線蟲品系如表1所示。

Table 1 Transgenetic C. elegans strains used in this study

Table 2 Acetylcholine-gated chloride channel subunits expression in C. elegans

1.3 秀麗線蟲自由行為追蹤記錄與分析

本文在Leifer 等［28］研發(fā)的CoLBeRT（control locomotion and behavior in real time）系統(tǒng)基礎(chǔ)上搭建了運動行為自動追蹤系統(tǒng)，記錄了秀麗線蟲的自由運動行為。在暗場紅外照明下，紅外相機（acA2000-165um NIR，三寶興業(yè)視覺技術(shù)有限公司，中國北京） 可識別雙軸高速位移臺（P-721.CDQ，愛普納米位移技術(shù)有限公司，中國上海）上的線蟲，CoLBeRT 系統(tǒng)得到線蟲位置信息，同時通過控制位移臺實時追蹤線蟲并使蟲身保持在倒置顯微鏡（Ti-U，尼康公司，日本）視野中央。在實驗開始前，為了去除蟲體上沾有的OP50（尿嘧啶缺陷型大腸桿菌品系，用于培養(yǎng)線蟲），將線蟲放在空白的NGM平板上爬行約1 min。之后將其放在0.8%的瓊脂糖平板上使其自由爬行，每只線蟲運動過程的記錄時間約為5 min。

在對秀麗線蟲自由運動分析時，將線蟲身體沿縱軸中線等分為100段，運動速度計算為某一段運動過程中線蟲的平均質(zhì)心速度。用Shen等［29］使用的方法對線蟲身體彎曲幅度進行了量化：將某一段運動過程中線蟲身體特定區(qū)段的曲率均一化為K·L，其中K為線蟲身體曲率，L為線蟲身體長度，計算得到K·L的標(biāo)準(zhǔn)差即為線蟲身體彎曲幅度。在計算頭部彎曲幅度時選取了線蟲身體前15%~24%區(qū)段，計算軀體中部彎曲幅度時選取了線蟲身體前45%~54%區(qū)段。

在計算秀麗線蟲轉(zhuǎn)向時間時，將線蟲停止后退并且頭部開始出現(xiàn)彎曲的時刻定義為轉(zhuǎn)向的開始；將線蟲運動方向轉(zhuǎn)換完成，不再改變運動方向，身體展開，準(zhǔn)備向前做正弦波運動的時刻定義為轉(zhuǎn)向的結(jié)束。

不過究其實質(zhì)，稱謂雖然不同，但它們針對的內(nèi)容對象卻并無截然的不同，它們所論述和傳授的方法并無二致，都是為了使所要研究的社會現(xiàn)實狀況明朗化，都是獲取社會信息數(shù)據(jù)的手段或操作過程。甚至還有一些名稱看似相去甚遠(yuǎn)，但其論述的內(nèi)容仍然是調(diào)查方法或曰研究方法。比如，菲利普·邁耶是一位精確新聞學(xué)家，他所著的《精確新聞報道》副標(biāo)題卻是“記者應(yīng)掌握的社會科學(xué)研究方法”，論述的主要內(nèi)容也還是抽樣、調(diào)查、統(tǒng)計分析等，是將社會調(diào)查研究方法尤其是量化研究方法運用到新聞報道中去罷了。

1.4 光遺傳激活實驗

本文通過CoLBeRT 系統(tǒng)對秀麗線蟲進行自由行為下的光遺傳實驗。實驗前，將線蟲在含有視黃醛的NGM固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。待線蟲發(fā)育至年輕成蟲期（young adult），將其放在0.8%的瓊脂糖平板上，開始追蹤記錄線蟲運動。實驗中光照區(qū)域設(shè)置為線蟲身體前30%的區(qū)域，熱刺激的時間為1 s，光遺傳刺激時間為7 s，光強為1.00 mW/mm2。每只蟲子的試驗次數(shù)為6~7次，每次刺激間隔時間在45 s以上。

1.5 統(tǒng)計分析

本文中的行為學(xué)數(shù)據(jù)均用MATLAB（MathWorks，Natick，美國）軟件進行處理和統(tǒng)計分析。用Mann-Whitney U test檢驗兩組樣本之間的差異，用Two-sample Kolmogorov-Smirnov test比較兩組樣本的概率分布，用Bonferroni法對多重比較進行矯正。當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 運用運動行為自動追蹤系統(tǒng)記錄秀麗線蟲的三種運動模式

用CoLBeRT 系統(tǒng)實時自動追蹤并記錄了秀麗線蟲的自由運動行為過程，成像結(jié)果顯示了秀麗線蟲的三種運動模式：前進、后退以及轉(zhuǎn)向。前進過程中，線蟲背腹側(cè)身體彎曲沿縱向體軸從頭端向尾部傳播；后退過程中，背腹側(cè)身體彎曲則從尾部向頭部傳播；后退結(jié)束后線蟲會選擇繼續(xù)前進，或者頭部向后彎曲貼向身體，從而轉(zhuǎn)換運動方向（圖1）。

Fig. 1 Three locomotion patterns in C. elegans

Fig. 2 Locomotion kinematics altered in acetylcholine-gated chloride channel receptor mutants during forward movements

Fig. 3 Mutations in acetylcholine-gated chloride channel receptor genes affect the body bending amplitude of C. elegans during forward movements

Fig. 4 Locomotion kinematics altered in acetylcholine-gated chloride channel receptor mutants during backward movement

Fig. 5 Locomotion kinematics altered in acetylcholine-gated chloride channel receptor mutants during turning behavior

Fig. 6 Activation of RIB interneurons increases the duration of reversal and the probability of turning in acetylcholine-gated chloride channel receptor mutants

2.2 乙酰膽堿門控氯離子通道受體突變影響秀麗線蟲前進運動狀態(tài)

對不同品系秀麗線蟲的前進運動進行量化分析發(fā)現(xiàn)，4種乙酰膽堿門控氯離子通道亞基突變線蟲前進運動時長的累積分布與N2相比均有顯著差異，比N2 有更多短時長的前進（圖2a~d），即這些突變線蟲無法進行長時間的前進運動。統(tǒng)計平均前進頻率發(fā)現(xiàn)，只有acc-3(tm7453) 突變體的頻率明顯增加，其他的突變體則無顯著變化（圖2e）。另外，acc-2(ok2216)、acc-3(tm7453)、acc-4(ok2371)這3種突變體的平均前進時長均顯著減少（圖2f）。進一步分析運動速度發(fā)現(xiàn)，與N2 相比，4 種突變體的前進速度均顯著降低（圖2g）。這些結(jié)果提示，乙酰膽堿門控氯離子通道受體參與對秀麗線蟲前進運動狀態(tài)的調(diào)控。

2.3 乙酰膽堿門控氯離子通道受體突變影響秀麗線蟲前進時的身體彎曲幅度

為探究乙酰膽堿門控氯離子通道受體是否參與對秀麗線蟲身體彎曲的調(diào)控，本文對線蟲前進運動過程中身體彎曲幅度進行了量化（圖3a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與N2 相比，acc-1(tm3268)和acc-4(ok2371)兩種通道受體亞基突變線蟲的全身彎曲幅度顯著降低，acc-2(ok2216) 和acc-3(tm7453) 則無明顯差異（圖3b）。進一步分別分析線蟲頭部和身體中部的彎曲幅度發(fā)現(xiàn)，acc-3(tm7453)突變線蟲的頭部彎曲幅度顯著降低（圖3c），acc-2(ok2216) 和acc-3(tm7453) 的身體中部彎曲幅度顯著降低，而acc-1(tm3268) 則顯著增加（圖3d）。這些結(jié)果提示，乙酰膽堿門控氯離子通道受體參與調(diào)控線蟲前進運動過程中身體彎曲的幅度。

2.4 乙酰膽堿門控氯離子通道受體突變影響秀麗線蟲后退運動狀態(tài)

接著繼續(xù)分析秀麗線蟲自由運動中的后退情況。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，4種乙酰膽堿門控氯離子通道亞基突變線蟲后退運動時長的累積分布與N2 相比均有顯著差異，都比N2 有更多長時間的后退，其中acc-2(ok2216)最長的后退時間達(dá)到了74.3 s（圖4a~d）。4 種亞基突變體后退的平均發(fā)生頻率與N2相比均無顯著變化（圖4e），而4 種突變體的平均后退時長均顯著增長（圖4f）。進一步分析后退運動速度發(fā)現(xiàn)，與N2 相比，4 種突變體的后退速度均顯著降低（圖4g）。由以上結(jié)果可以看出，與對照組相比，這些氯離子通道亞基突變線蟲不能夠及時停止后退，但是可以正常起始后退。

2.5 乙酰膽堿門控氯離子通道受體突變影響秀麗線蟲轉(zhuǎn)向運動狀態(tài)

本文對線蟲自由運動中的轉(zhuǎn)向過程也進行了量化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與N2相比，acc-1(tm3268)和acc-4(ok2371)突變體轉(zhuǎn)向時長的累積分布與N2相比有顯著差異，二者比N2 有更多長時間的轉(zhuǎn)向發(fā)生，acc-2(ok2216)和acc-3(tm7453)則無顯著變化（圖5a~d）。與N2 相比，4 種受體基因突變線蟲的轉(zhuǎn)向平均頻率均無顯著變化（圖5e），acc-1(tm3268)和acc-4(ok2371)突變體的平均轉(zhuǎn)向時長顯著增加（圖5f）。這些結(jié)果提示，acc-1和acc-4參與對轉(zhuǎn)向運動狀態(tài)的調(diào)控。

2.6 乙酰膽堿門控氯離子通道受體突變影響RIB中間神經(jīng)元對后退運動的抑制性調(diào)控

RIB神經(jīng)元被認(rèn)為是在促進秀麗線蟲的前進和轉(zhuǎn)向運動過程中起了重要作用的中間神經(jīng)元［30］，在后退過程中RIB 的神經(jīng)元活性會顯著下降［27］，推測RIB神經(jīng)元對后退運動可能有抑制作用。由于RIB是乙酰膽堿能神經(jīng)元，本文試圖探究乙酰膽堿門控氯離子通道受體是否參與RIB中間神經(jīng)元對后退運動的調(diào)控。

在秀麗線蟲逃避熱刺激的后退過程中光激活RIB 神經(jīng)元（圖6a），統(tǒng)計光刺激開始至線蟲后退結(jié)束的時長。結(jié)果顯示，與野生型秀麗線蟲N2 相比，所有的乙酰膽堿門控氯離子通道亞基突變體的后退運動均不能及時終止（圖6b）。另外，acc-1(tm3268)、acc-2(tm3219)、acc-3(tm3174)、acc-3(tm7453) 突變體后退結(jié)束后的轉(zhuǎn)向發(fā)生概率顯著增加（圖6c）。這些結(jié)果提示，乙酰膽堿門控氯離子通道受體可能參與了RIB中間神經(jīng)元對后退運動的抑制調(diào)控，并且可能也參與了RIB對線蟲后退結(jié)束之后前進和轉(zhuǎn)向兩種選擇的調(diào)控。

3 討 論

乙酰膽堿作為第一個被鑒定出來的神經(jīng)遞質(zhì)，對它參與的生理功能已經(jīng)有很多認(rèn)識［1］。然而由于受體類型的復(fù)雜性和遺傳模型種類的不足，對乙酰膽堿在許多生理過程中具體調(diào)控機制的理解仍然有限。2005 年，乙酰膽堿門控氯離子通道受體第一次在秀麗線蟲中被鑒定出來［26］，然而對其參與的功能及其調(diào)控機制目前了解甚少。本文發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿門控氯離子通道亞基（acc-1、acc-2、acc-3、acc-4）突變秀麗線蟲在自由運動行為過程中，不同時間尺度的運動學(xué)特征都會發(fā)生改變。本文首次發(fā)現(xiàn)這些受體亞基突變會影響線蟲運動速度和身體彎曲幅度，這兩種運動輸出對線蟲維持和轉(zhuǎn)換運動狀態(tài)至關(guān)重要。另外，光遺傳實驗結(jié)果提示ACC 受體很可能參與介導(dǎo)RIB 中間神經(jīng)元對秀麗線蟲后退運動的抑制性調(diào)控。

秀麗線蟲的體壁肌肉類似于哺乳動物平滑肌，通過nACHR 接收乙酰膽堿的興奮性輸入，導(dǎo)致肌肉收縮；同時秀麗線蟲體壁肌肉也接收GABA 能的抑制性輸入，這兩種興奮性和抑制性輸入之間的良好平衡保證了線蟲正弦波運動的正常進行［31］。乙酰膽堿在此過程中也存在抑制效應(yīng)，比如離子型受體ACR-12在GABA能運動神經(jīng)元中表達(dá)并介導(dǎo)對肌肉細(xì)胞的抑制性輸入，由此協(xié)調(diào)線蟲身體背腹側(cè)肌肉細(xì)胞的興奮和抑制［32］。而本文觀察到乙酰膽堿門控氯離子通道受體亞基突變線蟲在自由運動中的后退延遲終止。在光遺傳實驗中，后退開始后激活RIB中間神經(jīng)元也依舊不能使線蟲及時結(jié)束后退，即ACC 受體很可能參與介導(dǎo)了對秀麗線蟲運動狀態(tài)的抑制性調(diào)控。尚不清楚介導(dǎo)抑制性輸入的nACHR 和這些氯離子通道受體的功能區(qū)別，待進一步研究。

先前有研究表明，acc-2基因突變會導(dǎo)致AIY不能引起后退運動，AIY 通過ACC-2 抑制下游神經(jīng)元AIZ 來抑制后退運動［27］。本文發(fā)現(xiàn)，ACC 受體不僅介導(dǎo)對后退運動的抑制，在前進和轉(zhuǎn)向過程中也都參與了對運動狀態(tài)的調(diào)控。并且這種調(diào)控不只是在長時間尺度，在短時間尺度上，發(fā)現(xiàn)受體亞基突變線蟲仍然能夠彎曲身體，進行前進運動，這表明ACC 受體對于運動的產(chǎn)生不是必需的。但是身體彎曲幅度有小幅度的降低或上升，提示ACC受體參與調(diào)節(jié)線蟲身體彎曲的幅度。

在分析的所有運動學(xué)特征中，受影響最大的可能是線蟲的運動速度，本文發(fā)現(xiàn)4種乙酰膽堿門控氯離子通道亞基突變體在不同運動過程的速度都大幅度降低。而基于受體本身的離子通道特性，ACC 受體介導(dǎo)的是乙酰膽堿的抑制性輸入，因此它對特定運動過程的速度很可能并不是直接的促進作用。

RIB中間神經(jīng)元在運動狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵的作用，先前的研究發(fā)現(xiàn)，RIB同時對前進和轉(zhuǎn)向行為有促進作用［30］。作為中間神經(jīng)元，RIB 不直接與肌肉細(xì)胞形成突觸連接［18-19］，因此其作用的下游氯離子通道受體很可能是表達(dá)在中間神經(jīng)元和運動神經(jīng)元。根據(jù)秀麗線蟲神經(jīng)連接圖譜（圖6d）和先前ACC受體表達(dá)相關(guān)的研究［18-19，33-34］，推測RIB有可能通過ACC 受體作用于AVE、AVA、AIB 中間神經(jīng)元來對后退運動進行抑制性調(diào)控。這3個神經(jīng)元均表達(dá)ACC 受體（表2），并且它們是在后退運動中起重要作用的中間神經(jīng)元，在線蟲前進過程中分別激活三者均能夠促發(fā)后退［35］。另外，DA、DB等運動神經(jīng)元也表達(dá)了ACC受體［33］，RIB可能也通過對這些運動神經(jīng)元的抑制性輸入來調(diào)控線蟲運動的協(xié)調(diào)性。后續(xù)實驗中可運用基因編輯技術(shù)操縱RIB特定下游神經(jīng)元的活動來確定RIB通過ACC受體調(diào)控后退運動的具體環(huán)路機制。

4 結(jié) 論

本文通過運動行為追蹤、分子遺傳學(xué)和光遺傳學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿門控氯離子通道受體亞基突變線蟲自由運動行為中，不同時間尺度上的運動學(xué)特征均會發(fā)生變化，并且ACC 受體可能參與介導(dǎo)了RIB中間神經(jīng)元對后退運動的抑制性調(diào)控。本文結(jié)果提示，ACC 受體在抑制性調(diào)控秀麗線蟲運動狀態(tài)中起著重要的作用。本研究對ACC 受體的體內(nèi)功能研究奠定基礎(chǔ)，對乙酰膽堿門控抑制性受體調(diào)控運動行為的機制提供了新的思路。