王 磊 王艷紅 武京治 李孟委

（1）中北大學(xué)信息與通信工程學(xué)院，太原 030051；2）中北大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，太原 030051；3）中北大學(xué)前沿交叉科學(xué)技術(shù)研究院，太原 030051）

蛋白質(zhì)是參與每一個生理相關(guān)的生物化學(xué)或生物物理過程的重要生物分子。實現(xiàn)蛋白質(zhì)天然構(gòu)象排列的內(nèi)源性折疊途徑與其生物活性密切相關(guān)，在阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）中，β淀粉樣蛋白（Aβ）在大腦中的積累是誘發(fā)神經(jīng)元變性的主要早期事件，其特征是大腦中存在細(xì)胞外神經(jīng)炎斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，老年斑是最顯著的病理特征之一［1-5］。老年斑是由Aβ 蛋白組成，這種蛋白質(zhì)是通過β 分泌酶和γ 分泌酶切割淀粉樣前體糖蛋白（APP）而產(chǎn)生許多氨基酸數(shù)量在39~43之間變化的同種異體，其中Aβ1-40是最豐富的，Aβ1-42是最有毒和最容易聚集的［6-9］。作為一種天然無序蛋白質(zhì)，Aβ 蛋白構(gòu)象處于無序和部分折疊狀態(tài)之間的動態(tài)平衡，Aβ 蛋白構(gòu)象主要取決于環(huán)境。在膜環(huán)境中，Aβ 蛋白傾向于形成α 螺旋構(gòu)象，而在水溶液中，Aβ 蛋白構(gòu)象成分主要有無規(guī)則卷曲和少量α螺旋或β折疊［10-11］。

計算生物物理學(xué)在原子水平上研究生物分子的結(jié)構(gòu)和相互作用，計算模擬提供了對蛋白質(zhì)行為的原子水平的描述，成為了揭示分子生物學(xué)內(nèi)在機(jī)制的有力手段之一［12-15］。分子動力學(xué)模擬可以在原子尺度上探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，是對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動力學(xué)研究的一種手段。本文基于分子動力學(xué)仿真計算，模擬計算了Aβ 蛋白在水溶液環(huán)境條件下，不同間距的納米金屬狹縫結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)金屬吸附狀況，分析不同狹縫條件下蛋白質(zhì)構(gòu)象動力學(xué)特性。本文的結(jié)果可為研究微納結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子的動力學(xué)特性、生物傳感器設(shè)計以及疾病診斷等提供參考。

1 分子動力學(xué)計算方法與結(jié)構(gòu)模型

1.1 分子動力學(xué)模擬

所用分子動力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬均采用GROMACS 5.0軟件進(jìn)行，計算資源選擇北京超級云計算中心，使用內(nèi)存256 G、CPU 64核并行計算，在模擬中水分子采用SPC 模型，蛋白質(zhì)Aβ1-42 的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB ID：5OQV）獲得［16］。如圖1 所示，該蛋白質(zhì)由42 個氨基酸組成，在圖中用氨基酸英文縮寫進(jìn)行標(biāo)注。本研究選取了該晶體結(jié)構(gòu)中的單個Aβ蛋白單體作為初始模擬結(jié)構(gòu)，采用Au（111）作為金原子層，使用GolP-CHARMM 力場研究金屬界面的蛋白質(zhì)吸附以及蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變，該力場使用實驗和第一性原理數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)化，可以和生物有機(jī)力場CHARMM相兼容，該力場包含金原子的動態(tài)極化、化學(xué)吸附以及sp2雜化碳原子與金原子之間的相互作用力［17-20］。在水溶液環(huán)境模擬中，首先將Aβ1-42 蛋白置于一個邊長為7.5 nm 的立方體盒子中心，并使蛋白質(zhì)的每個原子與盒子邊界之間的距離均大于1.0 nm。向盒子中填充水分子。在狹縫結(jié)構(gòu)溶液模擬中，首先將Aβ 蛋白置于7.5 nm×7.5 nm×n的長方體盒子中心（其中n在不同的模擬中為變量），并在盒子z軸兩側(cè)分別插入兩層金原子層以形成狹縫結(jié)構(gòu)，向盒子中填充水分子，并用3 個鈉離子替代水分子以中和體系電荷。采用CHARMM力場處理原子間的相互作用，使用蛙跳算法求解粒子的運動方程，模擬過程中采用周期性邊界條件，模擬系綜為恒溫恒壓系綜，使用Nose-Hoover熱浴控制系統(tǒng)溫度保持在300 K，溫度弛豫時間為0.2 ps，使用Parrine-Rahman 壓力耦合器控制系統(tǒng)壓強在100 kPa，使用Particle-Mesh-Ewald方法處理靜電相互作用，靜電和范德瓦爾斯力的截斷半徑為1 nm，MD 模擬時長為30 ns，時間步長為2 fs。其中最后1 ns 的軌跡數(shù)據(jù)用于分析蛋白質(zhì)構(gòu)象和動力學(xué)特性。

Fig. 1 Amino acid composition of Aβ protein

Fig. 2 Protein molecular conformation in nanoslits with different distances

Fig. 3 RMSD of protein molecules in 4 systems

Fig. 4 RMSF values of alpha-C atoms of protein molecules in four systems

Fig. 5 Secondary structural changes in protein

Fig. 6 Protein conformations at 3 characteristic time points

Fig. 7 Time evolution of radius of gyration Rg of the protein

Fig. 8 Solvent accessible surface area analysis

1.2 均方根偏差（RMSD）

均方根偏差（root mean square deviation，RMSD） 是表征蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的重要工具，RMSD是通過計算蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對于對照組的偏差的算術(shù)值得到：

式中N為原子數(shù)，rfinal(i)和rinitial(i)分別是原子i的最終坐標(biāo)和初始坐標(biāo)。

1.3 均方根波動（RMSF）

均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）為原子位置變化對于時間的平均，可以表征蛋白質(zhì)氨基酸在整個模擬過程中的柔性和運動劇烈程度。

1.4 回旋半徑（Rg）

回旋半徑（radius of gyration，Rg）反映了原子根據(jù)質(zhì)心的分布，可以用來是衡量蛋白質(zhì)分子鏈的形狀和整體大小的變化，Rg的計算公式如下：

其中N為蛋白質(zhì)原子數(shù)，r(i)和rcenter分別為原子i和質(zhì)心的坐標(biāo)。

1.5 溶劑可及表面積（SASA）

蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)在很大程度上取決于其表面特性，二級結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)起著重要的功能，因此二級結(jié)構(gòu)的改變會引起蛋白質(zhì)表面性質(zhì)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。溶劑可及表面積（solvent accessible surface area，SASA）可定義為溶劑和其他分子相互作用的表面積。溶劑可及表面積可以表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對溶劑接觸面積的影響。溶劑可及表面積計算公式如下：

Zi是界面i到中心的垂直距離，Li是圓弧到界面i的距離。

2 結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)象分析

圖2 所示為Aβ1-42 經(jīng)MD 模擬30 ns 后最終時刻分子的結(jié)構(gòu)。由圖2b 可見，在5.0 nm 狹縫寬度下，蛋白質(zhì)分子鏈兩端分別被兩側(cè)金原子層吸附。在5.5 nm狹縫寬度下，蛋白質(zhì)分子全鏈被一側(cè)金原子層完全吸附（圖2c）。與水溶液環(huán)境相比（圖2a），在5.0 nm 和5.5 nm 狹縫內(nèi)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生顯著變化。在進(jìn)一步擴(kuò)展狹縫寬度后，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象逐漸向水溶液狀態(tài)中自由活動過渡。圖2d 所示為在8.5 nm 狹縫寬度下，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象與水溶液環(huán)境下相似，蛋白質(zhì)分子與金屬層相互作用較小。

2.2 均方根偏差分析

Aβ1-42 在水溶液環(huán)境與不同狹縫寬度下均方根偏差的時間演化如圖3 所示，結(jié)果表明，在30 ns的模擬過程中，Aβ蛋白達(dá)到了平衡狀態(tài)，與在溶液環(huán)境相比（RMSD=3 nm），在寬度為5.0、5.5、8.5 nm 的狹縫內(nèi)時，RMSD值分別減小到0.2、0.15、0.25 nm。由于金原子層對蛋白質(zhì)分子的強相互作用，在5.0 nm 與5.5 nm 狹縫內(nèi)，蛋白質(zhì)分子分別被吸附在金屬一側(cè)和兩側(cè)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象迅速穩(wěn)定下來。而在8.5 nm 狹縫時，金屬層距離蛋白質(zhì)分子較遠(yuǎn)，兩者之間相互作用顯著減弱，使該狀態(tài)下蛋白質(zhì)分子與水溶液環(huán)境下蛋白質(zhì)分子比較相似。

2.3 均方根波動分析

RMSF是相比于平均構(gòu)象，蛋白質(zhì)中每一個氨基酸殘基的相對位置變化，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中殘基的均方根波動分析表明了MD 模擬過程中殘基的a-C原子的波動性和靈活性，蛋白質(zhì)殘基的波動情況在一定程度上反映了蛋白質(zhì)在不同條件下的變性程度。由圖4 可知，水溶液環(huán)境與8.5 nm 狹縫條件下，蛋白質(zhì)構(gòu)象RMSF值波動程度相似，說明在8.5 nm金屬狹縫條件下蛋白質(zhì)構(gòu)象受金屬層影響較小，水分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響是主要成分。而在5.0 nm狹縫條件下，蛋白質(zhì)鏈兩端RMSF值波動程度較小，而蛋白質(zhì)鏈中部區(qū)域RMSF值波動程度明顯增大，說明在金原子層的相互作用下，靠近兩側(cè)金屬的蛋白質(zhì)鏈兩端被金屬層吸附，殘基波動較小，而遠(yuǎn)離金屬層的蛋白質(zhì)鏈中部區(qū)域殘基波動較大。在5.5 nm狹縫條件下，蛋白質(zhì)鏈完全貼附在一側(cè)金原子層上，其蛋白質(zhì)鏈?zhǔn)艿浇鹪訉拥膹娤嗷プ饔?，蛋白質(zhì)構(gòu)象RMSF值波動程度明顯減小。

2.4 二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分類算法（define secondary structure of protein，DSSP）是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指定領(lǐng)域比較公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，DSSP 是基于氫鍵的制定方法，它利用靜電能量代替氫鍵能量并且通過近似計算得到氫原子坐標(biāo)。蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水環(huán)境的介電常數(shù)和蛋白質(zhì)表面的介電常數(shù)差異很大，DSSP 并沒有考慮殘基所處的環(huán)境而將介電常數(shù)作為一個定值，另外由于氫鍵模式會有交叉重疊，因此DSSP會指出一些在幾何上明顯異常與不規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)。由圖5 可知水溶液環(huán)境中與5.5 nm、8.5 nm 狹縫條件下蛋白質(zhì)構(gòu)象主要由轉(zhuǎn)角（turn）、彎曲（bend）和卷曲（coil）組成。其中8.5 nm狹縫條件下13~17 號殘基呈α 螺旋。而5.5 nm狹縫條件下蛋白質(zhì)構(gòu)象主要由無規(guī)則卷曲組成。在30 ns 模擬的最終階段取3 個特征時間點26 ns、28.5 ns 以及30 ns 對4 種體系下蛋白質(zhì)進(jìn)行繪圖（圖6），在5.0 nm以及5.5 nm狹縫下，蛋白質(zhì)構(gòu)象已經(jīng)趨于穩(wěn)定，其構(gòu)象被單側(cè)或兩側(cè)金屬的強相互作用所固定（附件視頻S1，S2 分別Aβ 蛋白位于金納米狹縫間距5.0 nm和5.5 nm條件下的運動軌跡）。而水環(huán)境體系和8.5 nm狹縫體系下，蛋白質(zhì)整體構(gòu)象穩(wěn)定，但蛋白質(zhì)鏈個別位置仍處于一種動態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)。

2.5 回旋半徑分析

在MD 模擬過程中，計算了Aβ 蛋白的回旋半徑，其值越大表示蛋白質(zhì)構(gòu)象越松散，其值越小則構(gòu)象越致密和穩(wěn)定。圖7 所示為穩(wěn)定狀態(tài)下10 ns內(nèi)，不同間距狹縫中Aβ 蛋白的回旋半徑。在水溶液環(huán)境和8.5 nm 狹縫體系中，Aβ 蛋白單體的的回旋半徑是最低的，分別為1.1 nm 和1.2 nm；而在5.0 nm 狹縫和5.5 nm 狹縫體系下，Aβ 蛋白單體的回旋半徑升高至1.90 nm，該數(shù)據(jù)表明Aβ蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了劇烈的變化，這一結(jié)果與RMSF的分析結(jié)果保持一致。結(jié)果說明，隨著狹縫尺度的急劇縮小，蛋白質(zhì)構(gòu)象由致密變成松散狀態(tài)，在一定狹縫尺度上，蛋白質(zhì)出現(xiàn)不同程度的變性。

2.6 蛋白質(zhì)構(gòu)象的溶劑可及表面積（SASA）分析

SASA是描述蛋白質(zhì)與水溶液接觸的表面積的物理量，由于狹縫結(jié)構(gòu)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行吸附進(jìn)而對其構(gòu)象造成較大的影響，因此計算了不同狹縫體系下Aβ蛋白單體的SASA隨著時間的變化（圖8）。在5.0 nm 狹縫和5.5 nm 狹縫體系下，Aβ 蛋白單體的SASA基本相同，而明顯大于8.5 nm 狹縫和只有水溶液時的情況。因此，狹縫的吸附和拉伸作用將增加蛋白質(zhì)的溶液可及面積。

3 結(jié) 論

金屬狹縫結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的吸附作用會導(dǎo)致不同的蛋白質(zhì)構(gòu)象，研究結(jié)果表明，對于Aβ蛋白分子，當(dāng)狹縫金屬結(jié)構(gòu)間距小于5 nm 時，蛋白質(zhì)分子受到金屬界面的較強吸附作用，與狹縫兩端界面都發(fā)生作用，蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性，構(gòu)象產(chǎn)生明顯的變化。當(dāng)狹縫間距約為5.5 nm 時，蛋白質(zhì)分子只受到一側(cè)金屬界面吸附作用。當(dāng)狹縫金屬間距大于8.5 nm時，兩側(cè)金屬界面距離蛋白質(zhì)分子較遠(yuǎn)，金屬對蛋白質(zhì)構(gòu)象影響程度隨著狹縫間距增大而減小，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象主要由溶劑決定。金屬納米狹縫結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)分子的相互作用導(dǎo)致的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，可為生物分子動力學(xué)、微納傳感器及疾病檢測等應(yīng)用提供參考。

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