張翔宇 柴宇明 齊珂心 溫 泉

（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，合肥 230027）

動(dòng)物在面對(duì)持續(xù)無(wú)法擺脫的厭惡刺激，或者多次嘗試趨近某種偏好刺激而失敗時(shí)，會(huì)放棄當(dāng)前的行為，表現(xiàn)為行為頻率減少和持續(xù)時(shí)間縮短。多數(shù)情況下放棄是一種精明的行為，它可以幫助動(dòng)物調(diào)整行為方式，保存體力，保護(hù)動(dòng)物短時(shí)間內(nèi)安全，讓其有更多精力做更有價(jià)值的事情。研究者目前主要從習(xí)得性無(wú)助的角度來(lái)研究動(dòng)物的放棄行為，這可以追溯到1967 年［1］。研究者將狗囚禁在無(wú)法逃脫的籠子里，通過(guò)鈴聲響起給狗施加無(wú)法逃避的電擊，經(jīng)過(guò)訓(xùn)練，當(dāng)只有鈴聲時(shí)，狗的表現(xiàn)也如同受到了電擊，即使打開(kāi)籠子，狗也不會(huì)逃跑。這種即使出現(xiàn)擺脫厭惡環(huán)境的機(jī)會(huì)，動(dòng)物也仍然選擇放棄擺脫該環(huán)境的心理和行為被稱為習(xí)得性無(wú)助。其他關(guān)于習(xí)得性無(wú)助的研究還可以通過(guò)電擊［2-4］、穿梭箱實(shí)驗(yàn)［5］、熱箱實(shí)驗(yàn)［6-7］等方式在斑馬魚(yú)、小鼠、果蠅、蜜蜂等動(dòng)物上展開(kāi)。習(xí)得性無(wú)助的動(dòng)物表現(xiàn)出逃避行為/攻擊性減少、焦慮和恐懼增加等現(xiàn)象［8］。但是習(xí)得性無(wú)助實(shí)驗(yàn)中，引發(fā)動(dòng)物行為的刺激往往是厭惡刺激或者中性刺激，動(dòng)物面對(duì)可能獲得獎(jiǎng)勵(lì)的積極刺激也會(huì)產(chǎn)生放棄［9］，但是相關(guān)研究較少。

斑馬魚(yú)作為常見(jiàn)模式動(dòng)物，單次產(chǎn)卵能達(dá)到三四百顆，編碼蛋白質(zhì)的基因有69%和人類同源［10］，而且腦體積較小，便于進(jìn)行全腦水平的研究［11］。捕食行為開(kāi)始于斑馬魚(yú)受精后的第5 天（5 days post fertilization，5 dpf），用于代替卵黃，為機(jī)體供能［12］。這一行為包含追蹤、吞食兩個(gè)階段，斑馬魚(yú)通過(guò)游動(dòng)和轉(zhuǎn)向調(diào)整身體，快速靠近食物并將其吞食［13］。其中追蹤階段伴隨著雙眼匯聚角度的增大和以J-turn 為代表的小幅擺尾行為的發(fā)生。2011年Bianco等［14］通過(guò)投射在虛擬屏幕上的小光點(diǎn)，引起了斑馬魚(yú)的捕食行為，這種可控的食物刺激對(duì)斑馬魚(yú)捕食行為的研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)范式，為后來(lái)者從事斑馬魚(yú)捕食行為相關(guān)研究提供了指導(dǎo)［15-17］。虛擬食物刺激對(duì)于斑馬魚(yú)是一個(gè)積極刺激，能夠引起斑馬魚(yú)的趨近行為，卻不能提供真實(shí)食物獎(jiǎng)勵(lì)，通過(guò)虛擬刺激引起的捕食行為能否使斑馬魚(yú)產(chǎn)生放棄，目前尚未可知。本研究通過(guò)虛擬食物刺激引起斑馬魚(yú)捕食行為，比較了不同日齡斑馬魚(yú)在接受刺激不同時(shí)期的捕食行為表現(xiàn)，探究了獎(jiǎng)勵(lì)缺失的虛擬食物刺激對(duì)斑馬魚(yú)捕食行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用的斑馬魚(yú)品系為Nacre 品系，為AB 品系斑馬魚(yú)（受贈(zèng)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡兵教授實(shí)驗(yàn)室）和Casper品系斑馬魚(yú)（購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心（China Zebrafish Resource Center）），經(jīng)過(guò)雜交傳代，并依據(jù)眼球鞏膜和體表色素的有無(wú)等表觀特征篩選得到，在保證幼魚(yú)成活率的同時(shí)減少了體表黑色素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)用水pH 6.8~7.4，電導(dǎo)率500~550 μS/cm，飼養(yǎng)環(huán)境溫度常年控制在26~28℃，光周期為14 h光照/10 h 黑暗環(huán)境，幼年斑馬魚(yú)用E2 胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)，幼魚(yú)從5 dpf 開(kāi)始投喂草履蟲(chóng)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中廢棄的斑馬魚(yú)統(tǒng)一用冰浴法處理。本研究中動(dòng)物的飼養(yǎng)和行為訓(xùn)練均經(jīng)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 倫 理 委 員 會(huì) 批 準(zhǔn) （ 許 可 證 號(hào) ：USTCACUC1103013）。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

1.2.1 硬件裝置

斑馬魚(yú)自由行為平臺(tái)主要分為斑馬魚(yú)活動(dòng)場(chǎng)、相機(jī)、光源、電腦4個(gè)部分（圖1a）。4個(gè)部分被統(tǒng)一安裝在小型暗室中（圖1b），暗室以鋁合金面包板為底座，以工業(yè)鋁型材為框架，四周和頂部覆蓋有黑色不透明亞克力板。

a. 斑馬魚(yú)活動(dòng)場(chǎng)：在70 mm×50 mm×1.5 mm的碳纖維板中間挖出直徑20 mm 的圓形孔洞，上下方用蓋玻片封住形成空腔，填充斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液，形成活動(dòng)場(chǎng)。

b. 工業(yè)相機(jī)（Basler acA2000-165 um NIR）位于活動(dòng)場(chǎng)下方，搭配長(zhǎng)焦鏡頭（尼康，50 mm，1∶1.8，2/3）。

c. 光源：在虛擬刺激實(shí)驗(yàn)中，活動(dòng)場(chǎng)上方覆蓋一個(gè)像素密度為428 像素每英寸（pixel per inch，ppi）的手機(jī)屏幕，以提供虛擬視覺(jué)刺激，并減少屏幕發(fā)熱對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。在真實(shí)草履蟲(chóng)刺激實(shí)驗(yàn)中，使用峰值波長(zhǎng)940 nm 的紅外LED 燈提供照明。

Fig. 1 Virtual reality and behavioral system

Fig. 2 Behavioral paradigm for virtual paramecium presentation

Fig. 3 Behavioral analysis of larval zebrafish

Fig. 4 Predatory behavior of zebrafish in the presence of virtual stimuli

Table 1 Predatory probability of zebrafish under eye convergence condition

Fig. 5 Changes in the number of convergence and average convergence duration with fish ages during training and test periods

Fig. 6 Changes in the number of hunting behaviors and the corresponding average convergence duration with zebrafish ages during training and test periods

Fig. 7 Zebrafish predatory-like behavior in an environment illuminated by white light

Fig. 8 Statistics of hunting-like behaviors in an environment without virtual paramecium

Fig. 9 Statistics of prey capture behaviors in response to virtual paramecium

Fig. 10 Statistics of zebrafish locomotion with ages during training and test periods

1.2.2 軟件裝置

斑馬魚(yú)虛擬刺激程序：自主編寫(xiě)的C++程序。相機(jī)曝光時(shí)間1 500 μs，幀率為100幀/s（frame per second，fps），根據(jù)實(shí)驗(yàn)范式給予視覺(jué)刺激的同時(shí)記錄圖像。程序可以在https://github.com/Wenlab/virtual-visual-stimulus獲得。

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)一經(jīng)過(guò)饑餓處理：在實(shí)驗(yàn)前一天傍晚，挑出大約20 條身體發(fā)育正常，且運(yùn)動(dòng)活躍的斑馬魚(yú)，轉(zhuǎn)移到干凈的斑馬魚(yú)培養(yǎng)液中，不進(jìn)行任何投喂，放在28℃培養(yǎng)箱中待用。

每次實(shí)驗(yàn)前，用巴氏吸管吸取一條運(yùn)動(dòng)活躍的斑馬魚(yú)，放在斑馬魚(yú)活動(dòng)場(chǎng)中，加入新鮮的實(shí)驗(yàn)用水，排出活動(dòng)場(chǎng)中的空氣，確保相機(jī)可以記錄到完整的斑馬魚(yú)自由行為圖像。

1.3.1 虛擬視覺(jué)刺激的生成

隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的虛擬草履蟲(chóng)由一段MATLAB code生成的20 000 幀的視頻提供。初始化一張2 000 像素×2 000像素的白色圖像作為背景，并添加隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的黑色圓點(diǎn)作為刺激。通過(guò)觀察真實(shí)草履蟲(chóng)在水中的運(yùn)動(dòng)情況，擬定虛擬草履蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)參數(shù)。虛擬運(yùn)動(dòng)由隨機(jī)布朗運(yùn)動(dòng)和隨機(jī)方向的運(yùn)動(dòng)相加得到。對(duì)于一個(gè)虛擬的草履蟲(chóng)，首先隨機(jī)初始化它在圖像中所處的位置、運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度，并逐幀生成虛擬草履蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)軌跡。在這條運(yùn)動(dòng)軌跡上添加一些隨機(jī)性，如速度的隨機(jī)變化和運(yùn)動(dòng)方向的隨機(jī)偏轉(zhuǎn)等，再疊加一個(gè)布朗運(yùn)動(dòng)，即為一個(gè)虛擬草履蟲(chóng)的最終運(yùn)動(dòng)軌跡。實(shí)驗(yàn)中，虛擬草履蟲(chóng)數(shù)量為240條，通過(guò)對(duì)比真實(shí)草履蟲(chóng)在相機(jī)中的尺寸，將虛擬草履蟲(chóng)直徑設(shè)置為2 pixel。

1.3.2 虛擬刺激下斑馬魚(yú)捕食實(shí)驗(yàn)

在活動(dòng)場(chǎng)上方，放置手機(jī)屏幕，通過(guò)spacedesk 軟件，將電腦屏幕內(nèi)容復(fù)制到手機(jī)的高分辨率屏幕上，調(diào)節(jié)視覺(jué)刺激窗口位置，使之正好覆蓋住斑馬魚(yú)活動(dòng)場(chǎng)，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白期I （Blank I）、訓(xùn)練期（Training）、空白期II（Blank II）、測(cè)試期（Test）4個(gè)階段（圖2）。

a. 空白期I：提供無(wú)虛擬草履蟲(chóng)的空白背景，讓斑馬魚(yú)熟悉環(huán)境并進(jìn)行自由探索，持續(xù)時(shí)間1 min。

b. 訓(xùn)練期（Training）：通過(guò)屏幕提供虛擬草履蟲(chóng)圖像刺激，持續(xù)時(shí)間25 min。

c. 空白期II：同空白期I，讓斑馬魚(yú)能夠休息，為Test期做準(zhǔn)備，持續(xù)時(shí)間5 min。

d. 測(cè)試期（Test）：給予斑馬魚(yú)和Training期相同的視覺(jué)刺激，持續(xù)時(shí)間10 min。

1.3.3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組刺激條件和實(shí)驗(yàn)組類似，只將Training時(shí)期的虛擬草履蟲(chóng)刺激改為空白背景。

1.3.4 斑馬魚(yú)捕食真實(shí)草履蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)

將虛擬刺激實(shí)驗(yàn)的屏幕移除，使用紅外LED燈照明。首先將斑馬魚(yú)置于黑暗環(huán)境中20 min，同時(shí)添加真實(shí)草履蟲(chóng)，檢驗(yàn)在黑暗環(huán)境中斑馬魚(yú)對(duì)于草履蟲(chóng)的捕食情況。然后使用白光將環(huán)境照亮，使得斑馬魚(yú)可以看見(jiàn)草履蟲(chóng)，檢驗(yàn)這種情況下斑馬魚(yú)對(duì)于草履蟲(chóng)的捕食情況。

1.4 斑馬魚(yú)行為分析

1.4.1 頭部信息提取

為了分析斑馬魚(yú)雙眼匯聚角度和運(yùn)動(dòng)距離變化，首先需要提取斑馬魚(yú)頭部關(guān)鍵位置信息。頭部信息由自主編寫(xiě)的C++程序提取。主要分為背景建模、幼魚(yú)檢測(cè)、頭部和眼部關(guān)鍵點(diǎn)識(shí)別3部分。

a. 背景建模：圖像中幼魚(yú)所占的面積較小，且幼魚(yú)可活動(dòng)區(qū)域很大，背景變化不明顯，故采用平均背景建模。取視頻前3 000幀的平均圖像作為背景，并隨分析的進(jìn)行，每10 幀更新一次背景。如果幼魚(yú)長(zhǎng)時(shí)間不動(dòng)，則不更新背景，防止幼魚(yú)被背景減除減掉。

b. 幼魚(yú)檢測(cè)：將減背景之后的圖像二值化處理后，提取所有區(qū)域的輪廓，將所有輪廓中最長(zhǎng)輪廓判定為幼魚(yú)。若最長(zhǎng)輪廓長(zhǎng)度與該日齡段幼魚(yú)的平均輪廓長(zhǎng)度差距過(guò)大，則認(rèn)為該幀檢測(cè)失敗，采用上一幀的輪廓作為幼魚(yú)，輪廓的重心為幼魚(yú)在圖像中的位置。

c.頭部關(guān)鍵點(diǎn)提?。菏褂没诰矸e神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵點(diǎn)檢測(cè)工具DeepLabCut［18-19］訓(xùn)練了一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為關(guān)鍵點(diǎn)檢測(cè)器。由于整個(gè)圖像較大（896 pixel×896 pixel），檢測(cè)到幼魚(yú)重心位置后，以該點(diǎn)為中心，取140 pixel×140 pixel 大小的感興趣區(qū)域（ROI）作為網(wǎng)絡(luò)輸入，以降低處理所需時(shí)間。網(wǎng)絡(luò)輸出為頭部（head）和尾部（tail）的坐標(biāo)和對(duì)應(yīng)的置信度，如果置信度低于0.95，即認(rèn)為這一幀檢測(cè)失敗，使用上一幀檢測(cè)的結(jié)果（圖3a）。

d. 眼部關(guān)鍵點(diǎn)提?。阂灶^部坐標(biāo)為中心取50 pixel×50 pixel的ROI，為提高檢測(cè)精度，將圖像放 大 至 750 pixel×750 pixel， 作 為 第 2 個(gè)DeepLabCut神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。網(wǎng)絡(luò)輸出為4個(gè)眼部關(guān)鍵點(diǎn)，左眼最前方（left eye anterior，lea）、左眼最后方（left eye posterior，lep）、右眼最前方（right eye anterior，rea）、右眼最后方（right eye posterior，rep）（圖3a）。

上述檢測(cè)信息儲(chǔ)存在.yaml 文件中用于后續(xù)分析。斑馬魚(yú)頭部信息提取程序可以在https://github.com/Wenlab/virtual-visual-stimulus獲得。

1.4.2 雙眼匯聚界定

根據(jù)Bianco等［14］的研究成果，斑馬魚(yú)在進(jìn)行捕食時(shí)雙眼匯聚角度會(huì)從20°提高到57°，還會(huì)發(fā)生J-turn 或者類似的小幅擺尾，擺尾幅度在10°~20°之間，因此將捕食行為判定為：在雙眼匯聚的前提下，發(fā)生J-turn或者小幅擺尾行為。本研究將斑馬魚(yú)左、右眼睛前后端連線記為視線方向，分別為連接左眼最前端和最后端的左視線（left line，LL）和連接右眼最前端和最后端的右視線（right line，RL），兩線夾角為匯聚角（convergence angle，CA），匯聚角超過(guò)40°判定為匯聚，匯聚時(shí)長(zhǎng)為匯聚角在40°及以上的時(shí)間（圖3b）。

1.4.3 疲勞性檢驗(yàn)

通過(guò)比較斑馬魚(yú)Training 時(shí)期和Test 時(shí)期，單位時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離判斷斑馬魚(yú)疲勞與否。由于已經(jīng)通過(guò)頭部信息提取，得到斑馬魚(yú)頭部位置坐標(biāo)（hp），因此可以通過(guò)頭部位置坐標(biāo)的變化軌跡得到斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)距離。若Test時(shí)期，運(yùn)動(dòng)距離顯著變短，則認(rèn)為斑馬魚(yú)后期疲勞，否則認(rèn)為斑馬魚(yú)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間沒(méi)有疲勞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.5.1 雙眼匯聚顯著性檢驗(yàn)

在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，首先使用MATLAB 軟件的rmoutliers 函數(shù)做異常值判斷，并將離群值定義為超過(guò)3倍經(jīng)過(guò)換算的中位數(shù)絕對(duì)偏差（median absolute deviation，MAD）的值，排除異常數(shù)據(jù)，然后通過(guò)秩和檢驗(yàn)計(jì)算顯著性和標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.5.2 捕食行為顯著性檢驗(yàn)

按照之前描述的對(duì)捕食行為界定的標(biāo)準(zhǔn)，從已經(jīng)檢測(cè)出雙眼匯聚的視頻中，篩選出發(fā)生捕食行為的游泳回合，統(tǒng)計(jì)捕食次數(shù)、所在游泳回合雙眼匯聚時(shí)長(zhǎng)的顯著性差異，及其隨日齡的變化情況，通過(guò)秩和檢驗(yàn)計(jì)算顯著性和標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié) 果

2.1 虛擬視覺(jué)刺激可以引起斑馬魚(yú)捕食行為

通過(guò)對(duì)比斑馬魚(yú)對(duì)真實(shí)草履蟲(chóng)的捕食行為，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)面對(duì)虛擬刺激時(shí)可以表現(xiàn)出相同的雙眼變化和擺尾行為，虛擬刺激可以引起斑馬魚(yú)捕食行為。草履蟲(chóng)和斑馬魚(yú)的相對(duì)位置的不同，捕食行為也有差異：當(dāng)草履蟲(chóng)距離斑馬魚(yú)較近，位置更靠近鼻側(cè)，斑馬魚(yú)的擺尾幅度更小，反之則擺尾幅度更大。圖4展示了斑馬魚(yú)受到虛擬刺激時(shí)產(chǎn)生的捕食行為。通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同日齡斑馬魚(yú)在發(fā)生雙眼匯聚時(shí)進(jìn)行捕食的概率，發(fā)現(xiàn)虛擬刺激誘發(fā)的斑馬魚(yú)捕食概率為22%~36%（表1）。

2.2 斑馬魚(yú)雙眼匯聚次數(shù)和時(shí)長(zhǎng)隨時(shí)間下降

為了探究25 min 虛擬視覺(jué)刺激對(duì)于斑馬魚(yú)捕食行為的影響，對(duì)斑馬魚(yú)眼部關(guān)鍵點(diǎn)位置坐標(biāo)進(jìn)行提取，得到左右眼視線方向并計(jì)算雙眼匯聚角度，將雙眼匯聚角度超過(guò)40°判定為發(fā)生雙眼匯聚，統(tǒng)計(jì)了不同日齡斑馬魚(yú)在Training 時(shí)期和Test 時(shí)期平均10 min 的雙眼匯聚次數(shù)和平均匯聚時(shí)長(zhǎng)（圖5）。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，從10 dpf 開(kāi)始，斑馬魚(yú)在Test時(shí)期的匯聚次數(shù)相比Training時(shí)期顯著下降，而平均匯聚時(shí)長(zhǎng)的顯著性下降早在8 dpf 就開(kāi)始顯現(xiàn)，顯著性都不隨著斑馬魚(yú)日齡的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)。

因此，在給予25 min 的移動(dòng)光點(diǎn)虛擬視覺(jué)刺激之后，幼年斑馬魚(yú)確實(shí)可以表現(xiàn)出對(duì)于這種刺激的響應(yīng)減弱，匯聚次數(shù)的減少落后平均匯聚時(shí)長(zhǎng)的縮短2 d。

2.3 斑馬魚(yú)捕食次數(shù)和平均匯聚時(shí)長(zhǎng)隨時(shí)間下降

雙眼匯聚是進(jìn)行捕食的前提條件，但并不意味著捕食行為的發(fā)生。因此為了比較斑馬魚(yú)捕食行為的差異，需要將捕食行為從匯聚行為中篩選出來(lái)。本文進(jìn)行了兩種嘗試，首先參照已有的研究成果，對(duì)斑馬魚(yú)的游泳回合進(jìn)行分類，找到捕食相關(guān)的游泳回合［20］，然而該方法在本研究中并未達(dá)到文獻(xiàn)中描述的效果，因此決定將斑馬魚(yú)發(fā)生雙眼匯聚的時(shí)段從視頻中篩選出來(lái)，通過(guò)人工對(duì)比斑馬魚(yú)捕食真實(shí)和虛擬草履蟲(chóng)行為相似性，篩選出發(fā)生捕食行為的游泳回合，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖6反映的是不同日齡斑馬魚(yú)在不同時(shí)期的捕食次數(shù)和平均匯聚時(shí)長(zhǎng)的變化情況?？梢钥闯?，斑馬魚(yú)從8 dpf開(kāi)始，相比Training時(shí)期，Test期的捕食次數(shù)和平均匯聚時(shí)長(zhǎng)出現(xiàn)顯著性下降，捕食次數(shù)比匯聚次數(shù)提前兩天表現(xiàn)出顯著性下降。而正是從此時(shí)開(kāi)始，斑馬魚(yú)捕食次數(shù)和平均雙眼匯聚時(shí)長(zhǎng)變化時(shí)間一致。由此可知，隨著日齡的增長(zhǎng)，斑馬魚(yú)在經(jīng)歷過(guò)25 min 虛擬視覺(jué)刺激之后，更少的可能會(huì)進(jìn)行捕食。

2.4 斑馬魚(yú)捕食行為減少由虛擬刺激引起

斑馬魚(yú)自由行為結(jié)果顯示，捕食行為不僅僅發(fā)生在面對(duì)虛擬刺激時(shí)。當(dāng)斑馬魚(yú)面前有雜質(zhì)、氣泡或者甚至在空白背景下，也會(huì)出現(xiàn)捕食行為。

為了排除斑馬魚(yú)自發(fā)行為對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，做了黑暗環(huán)境下捕食真實(shí)草履蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前期，活動(dòng)場(chǎng)中只通過(guò)紅外光進(jìn)行照明，斑馬魚(yú)不具有紅外視覺(jué)，相當(dāng)于處在黑暗環(huán)境中，無(wú)法觀察到草履蟲(chóng)，而斑馬魚(yú)和草履蟲(chóng)可以同時(shí)被相機(jī)記錄下來(lái)，捕食行為可以被實(shí)驗(yàn)人員直接觀察到。實(shí)驗(yàn)后期，通過(guò)在活動(dòng)場(chǎng)中提供額外的白光照明，草履蟲(chóng)對(duì)于斑馬魚(yú)清晰可見(jiàn)，斑馬魚(yú)可以進(jìn)行正常捕食行為。結(jié)果顯示，無(wú)白光照明的黑暗環(huán)境中，斑馬魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)捕食行為，在有白光照明的環(huán)境中，斑馬魚(yú)發(fā)生捕食草履蟲(chóng)的行為（圖7），由此證明虛擬刺激實(shí)驗(yàn)中，空白背景下斑馬魚(yú)的捕食行為不是自發(fā)行為，而是斑馬魚(yú)對(duì)未被相機(jī)記錄的雜質(zhì)產(chǎn)生了捕食行為。

為了分析空白背景下斑馬魚(yú)捕食行為對(duì)結(jié)果的影響，設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將Training時(shí)期提供的虛擬草履蟲(chóng)改為空白背景進(jìn)行訓(xùn)練，再比較測(cè)試期斑馬魚(yú)對(duì)虛擬刺激的響應(yīng)情況。結(jié)果如圖8 所示，25 min空白背景沒(méi)有使斑馬魚(yú)表現(xiàn)出捕食行為的下降，部分日齡的斑馬魚(yú)表現(xiàn)出捕食行為的顯著上升。

在排除了這些背景因素下發(fā)生的捕食行為之后，虛擬刺激引起的斑馬魚(yú)捕食行為結(jié)果如圖9所示。可以看出，虛擬刺激引起的斑馬魚(yú)的捕食次數(shù)和平均捕食時(shí)長(zhǎng)都從8 dpf 開(kāi)始出現(xiàn)顯著性下降。因此，斑馬魚(yú)捕食行為減少是虛擬刺激引起的。

2.5 斑馬魚(yú)捕食次數(shù)下降不是受疲勞的影響

為了排除疲勞對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，統(tǒng)計(jì)了不同時(shí)期斑馬魚(yú)的頭部運(yùn)動(dòng)距離，比較了相同時(shí)間內(nèi)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)距離差異。結(jié)果如圖10 所示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（區(qū)別在于Training時(shí)期提供虛擬草履蟲(chóng)還是空白背景），Training時(shí)期和Test時(shí)期斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)距離沒(méi)有顯著性差異，因此斑馬魚(yú)捕食行為減少與疲勞無(wú)關(guān)。

3 討 論

隨著虛擬視覺(jué)刺激在斑馬魚(yú)行為及其神經(jīng)機(jī)制研究中的應(yīng)用，該方法已經(jīng)逐漸成為研究斑馬魚(yú)視覺(jué)相關(guān)行為的重要方式。本研究通過(guò)虛擬食物刺激，引起斑馬魚(yú)的捕食行為。對(duì)于一個(gè)持續(xù)時(shí)間25 min，且沒(méi)有獎(jiǎng)勵(lì)反饋的虛擬食物，斑馬魚(yú)會(huì)減少對(duì)其捕食，這種現(xiàn)象最早在斑馬魚(yú)8 dpf 的時(shí)候開(kāi)始顯現(xiàn)，且捕食行為的減少和疲勞因素?zé)o關(guān)，是一種獎(jiǎng)勵(lì)缺失引起的放棄。

3.1 虛擬食物刺激可以引起斑馬魚(yú)捕食行為的減少

在本實(shí)驗(yàn)中，提供虛擬刺激的是一塊428 ppi的手機(jī)屏幕。由于屏幕緊貼著斑馬魚(yú)活動(dòng)場(chǎng)，不得不考慮發(fā)熱問(wèn)題。相比于其他屏幕，這種手機(jī)屏幕的發(fā)熱之小是其他商業(yè)屏幕無(wú)法比擬的。相比于投影儀，這塊屏幕提供的虛擬草履蟲(chóng)分辨率更高，草履蟲(chóng)圖像更加清晰，形態(tài)大小和真實(shí)草履蟲(chóng)更加接近。結(jié)合Bianco等［14］在虛擬食物刺激實(shí)驗(yàn)中的判定標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)參考斑馬魚(yú)對(duì)真實(shí)草履蟲(chóng)的捕食行為，實(shí)驗(yàn)中對(duì)于斑馬魚(yú)捕食行為的判定更加準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)排除了斑馬魚(yú)在空白背景和面對(duì)雜質(zhì)、氣泡等產(chǎn)生的捕食行為，確保了所有被統(tǒng)計(jì)的捕食行為都是虛擬刺激引起的。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也探討了斑馬魚(yú)的捕食行為是否是自發(fā)行為，以及非虛擬刺激下的捕食行為對(duì)于本實(shí)驗(yàn)結(jié)論可能造成的影響。結(jié)果驗(yàn)證了一開(kāi)始的猜想，即在空白背景下斑馬魚(yú)發(fā)生的捕食行為，是由于斑馬魚(yú)看到了一些相機(jī)無(wú)法記錄下來(lái)的物質(zhì)。而這種空白背景因素并不影響準(zhǔn)確結(jié)果的得出，虛擬視覺(jué)刺激引起的捕食行為使斑馬魚(yú)產(chǎn)生放棄。

3.2 斑馬魚(yú)的捕食行為減少是獎(jiǎng)勵(lì)缺失引起的

之前關(guān)于放棄的研究主要聚焦于厭惡刺激或者中性刺激引起的動(dòng)物行為，如電擊使狗希望擺脫被電擊的環(huán)境，適應(yīng)視動(dòng)反應(yīng)（optomotor responses，OMR）環(huán)境的斑馬魚(yú)由于無(wú)法通過(guò)尾部擺動(dòng)引起環(huán)境變化而放棄。但是放棄行為不僅包括上述現(xiàn)象，多次嘗試獲得獎(jiǎng)勵(lì)而失敗，同樣可以引起斑馬魚(yú)的放棄。相比于前兩種刺激，這種刺激之所以能夠引起斑馬魚(yú)的行為，是斑馬魚(yú)因?yàn)轲囸I而主動(dòng)靠近食物的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中，虛擬的食物既不能根據(jù)斑馬魚(yú)的行為提供運(yùn)動(dòng)反饋，又不能真正讓斑馬魚(yú)獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)。因此，這是一種無(wú)法提供真實(shí)獎(jiǎng)勵(lì)的獎(jiǎng)勵(lì)刺激，即獎(jiǎng)勵(lì)缺失引起的刺激。

本實(shí)驗(yàn)將相同日齡的斑馬魚(yú)作為一個(gè)整體進(jìn)行分析，并沒(méi)有分析單個(gè)斑馬魚(yú)在Training 時(shí)期和Test 時(shí)期的變化情況，在這里就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)問(wèn)題：?jiǎn)蝹€(gè)斑馬魚(yú)是否隨著受到刺激次數(shù)的增加，而表現(xiàn)出更少的捕食行為？行為學(xué)數(shù)據(jù)表明，斑馬魚(yú)對(duì)于虛擬刺激的捕食情況，具有明顯的個(gè)體差異。斑馬魚(yú)可能在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中都不會(huì)發(fā)生捕食行為，也可能在10 min 內(nèi)發(fā)生多達(dá)10 次捕食行為。就發(fā)生捕食行為的時(shí)間序列看，斑馬魚(yú)的捕食行為既可能在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期均勻分布，又可能集中在5 min 之內(nèi)，其他時(shí)間基本不發(fā)生。由于實(shí)驗(yàn)中提供的240個(gè)虛擬食物是隨機(jī)分布在活動(dòng)場(chǎng)中的，平均每2 mm2即有一個(gè)虛擬食物，而斑馬魚(yú)可以注意到自身視野3 mm 范圍以內(nèi)的物體，因此理論上斑馬魚(yú)一直受到食物刺激。為了量化斑馬魚(yú)受刺激情況，比較了不同時(shí)期每10 min斑馬魚(yú)雙眼3 mm半徑內(nèi)沒(méi)有虛擬食物的時(shí)間，都在40~60 s之間且沒(méi)有顯著差異，因此認(rèn)為不同時(shí)期斑馬魚(yú)受刺激情況相同，而是否發(fā)生捕食行為則取決于斑馬魚(yú)的個(gè)體差異。Bianco等［14］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，虛擬視覺(jué)刺激引起的斑馬魚(yú)捕食行為概率為22%，因此將單個(gè)斑馬魚(yú)受到虛擬食物刺激的次數(shù)，作為評(píng)判斑馬魚(yú)是否產(chǎn)生放棄的標(biāo)準(zhǔn)，似乎并不完美。所以本實(shí)驗(yàn)將相同日齡的斑馬魚(yú)作為整體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，而不區(qū)分每條斑馬魚(yú)受到刺激的次數(shù)對(duì)于其放棄的影響。

4 展 望

目前關(guān)于動(dòng)物放棄行為的研究，主要從習(xí)得性無(wú)助入手，通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究并構(gòu)建相關(guān)理論，揭示背后的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制。預(yù)先物理?yè)p毀杏仁核的中縫背核（dorsal raphe nucleus，DRN）腦區(qū)的動(dòng)物，在經(jīng)歷過(guò)電擊后無(wú)法出現(xiàn)逃避缺陷（逃避次數(shù)減少或反應(yīng)時(shí)間增加）［21-23］。習(xí)得性無(wú)助的動(dòng)物，DRN腦區(qū)五羥色胺能神經(jīng)元基因表達(dá)水平比正常動(dòng)物更高［24-26］，其無(wú)法通過(guò)激活腹內(nèi)側(cè)前額葉到DRN 腦區(qū)的谷氨酸能神經(jīng)元調(diào)節(jié)逃避行為［27］。因此最新理論認(rèn)為，學(xué)習(xí)行為激活腹內(nèi)側(cè)前額葉中的谷氨酸能神經(jīng)元，下行投射到杏仁核的DRN 腦區(qū)，抑制該區(qū)域五羥色胺能神經(jīng)元的活動(dòng)，使動(dòng)物在習(xí)得性無(wú)助實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出正常的逃避行為［28］。

以往主要通過(guò)厭惡刺激誘發(fā)的習(xí)得性無(wú)助研究動(dòng)物放棄行為，集中在對(duì)于五羥色胺能神經(jīng)元的研究［23］，而多巴胺能神經(jīng)元對(duì)于厭惡刺激敏感度較低［29］，因此對(duì)于多巴胺能神經(jīng)元在獎(jiǎng)勵(lì)刺激相關(guān)放棄行為中作用的研究較少。獎(jiǎng)賞預(yù)測(cè)錯(cuò)誤（reward prediction error）理論認(rèn)為，多巴胺能神經(jīng)元編碼動(dòng)物對(duì)于獎(jiǎng)勵(lì)的預(yù)期［30-32］。如果獎(jiǎng)勵(lì)高于預(yù)期，則多巴胺能神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)，反之，則多巴胺能神經(jīng)元活動(dòng)被抑制。面對(duì)需要被動(dòng)應(yīng)對(duì)的厭惡刺激和需要主動(dòng)應(yīng)對(duì)的偏好刺激，伏隔核的多巴胺釋放也存在差異［33］。相信隨著虛擬食物刺激引起的捕食行為下降在斑馬魚(yú)中被發(fā)現(xiàn)，多巴胺系統(tǒng)在動(dòng)物面對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)缺失引起放棄行為中的功能也將被更加全面地揭示，這將對(duì)全面理解動(dòng)物放棄行為提供借鑒。

關(guān)于習(xí)得性無(wú)助的研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)視動(dòng)反應(yīng)引起的斑馬魚(yú)習(xí)得性無(wú)助行為，涉及內(nèi)側(cè)縱向束到后腦運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的去甲腎上腺素能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用［34］。最新的自由行為斑馬魚(yú)全腦成像平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)斑馬魚(yú)實(shí)時(shí)行為追蹤和全腦鈣活動(dòng)成像［35］。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建特定神經(jīng)元表達(dá)品系，借助該平臺(tái)研究斑馬魚(yú)在經(jīng)歷25 min虛擬食物刺激前后的全腦神經(jīng)活動(dòng)，可以揭示獎(jiǎng)勵(lì)缺失引起的斑馬魚(yú)放棄行為中，不同類型神經(jīng)元的作用，從而構(gòu)建起對(duì)于不同類型神經(jīng)元在動(dòng)物放棄行為中功能的全面理解。

5 結(jié) 論

本研究通過(guò)搭建自由行為斑馬魚(yú)虛擬食物刺激平臺(tái)，對(duì)斑馬魚(yú)響應(yīng)虛擬刺激的行為進(jìn)行了分析。首先驗(yàn)證了本平臺(tái)可以引起斑馬魚(yú)的捕食行為。接著通過(guò)比較刺激前后斑馬魚(yú)對(duì)于虛擬食物的捕食行為變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)刺激處理的斑馬魚(yú)會(huì)表現(xiàn)出對(duì)虛擬食物匯聚次數(shù)減少、匯聚時(shí)長(zhǎng)縮短以及捕食次數(shù)減少、捕食時(shí)長(zhǎng)縮短的行為。接著通過(guò)黑暗環(huán)境下對(duì)真實(shí)草履蟲(chóng)的捕食行為成像和空白背景對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了斑馬魚(yú)的捕食行為不是自發(fā)行為，而且空白背景對(duì)斑馬魚(yú)的捕食行為的下降并不產(chǎn)生影響，從而證明了斑馬魚(yú)捕食行為的下降確實(shí)是虛擬食物刺激導(dǎo)致的。本研究構(gòu)建了獎(jiǎng)勵(lì)缺失下斑馬魚(yú)放棄行為的研究范式，對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)缺失條件下斑馬魚(yú)放棄行為的深入研究提供了一種研究方式和思路。