劉幗芬，張曉莉，牟亞豪，代 嬌，谷仕艷

1.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南 大理 671000；2.曲靖醫(yī)學高等?？茖W校，云南 曲靖 655000

萬壽菊為一年生草本植物，花色呈橘黃色，具有較高的觀賞價值，同時萬壽菊花瓣含有豐富的葉黃素，并含有黃酮和多酚等多種活性物質，而兼具良好的藥用價值。經研究證實，萬壽菊花提取物可用于對抗白內障、防止老年視黃斑退化、降低患癌率和防治冠心病等，在保健食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)領域應用較為普遍［1-3］。此外，也有研究證實萬壽菊花水提物可在一定程度上恢復腎組織抗氧化酶活性，降低抗腫瘤藥物對腎臟的氧化損傷［4］，且有研究顯示，萬壽菊花提取物具有一定的抗氧化活性［5-6］。然而，萬壽菊花水提物的具體抗氧化功能及機制還缺乏深入的探討，這在一定程度上限制了它的使用和推廣。

砷（As）是自然界中廣泛存在的有毒類金元素，主要通過消化道、呼吸道和皮膚接觸進入機體，引起皮膚癌、肺癌、糖尿病以及神經退行性等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。氧化應激是多種疾病的分子病理機制，同時也被認為是砷發(fā)揮毒性作用最主要的機制之一。當無機砷進入細胞內，可引起抗氧化物質谷胱甘肽的快速耗竭并使谷胱甘肽合成酶失活，這使得細胞內大量活性氧（ROS）得不到有效清除而蓄積，蛋白質、核酸和脂質等生物大分子被氧化修飾而失去基本功能，引起細胞功能的紊亂，最終表現為細胞的死亡［8］。目前未見萬壽菊花水提物能否拮抗或恢復砷引起的氧化損傷的報道。本研究以胰島β 細胞NIT-1 細胞為模型，首先評估萬壽菊花水提物本身的細胞毒性作用，接著探討萬壽菊花水提物對砷所致細胞毒性的影響，明確萬壽菊花水提物能否拮抗砷誘導的毒性損傷，為將萬壽菊更好地用于疾病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；真空冷凍干燥機（Scientz-ND，寧波新芝生物）；多功能熒光酶標儀（SP-Max3500F，上海閃譜生物司）；旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器）；As2O3（北京壇墨質檢科技有限公司）；1640 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（上海索萊寶）；CCK8 檢測試劑盒（南京凱基生物）；ROS 活性氧檢測試劑盒（北京雷根）；細胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒（上海碧云天）；實驗所需其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 萬壽菊花水提物提取 萬壽菊干花放入中藥粉碎機中進行粉碎，粉碎時間為1 min，將得到的萬壽菊花粉末過0.25 mm（60目）標準網孔篩獲得萬壽菊60目粉。稱取萬壽菊60 目粉10 g，加入20 倍量（200 mL）蒸餾水，水浴100 ℃2 h 提取3 次，合并三次濾液，將濾液在45 ℃減壓條件下旋蒸，至旋蒸瓶中約有1 mL 左右的旋蒸液為止（旋蒸瓶壁上如有粉末貼壁，用55KHz超聲震蕩處理），用吸管將液體移至培養(yǎng)皿中，用保鮮膜包裹，并用針頭扎孔放入冰箱-20 ℃冷凍7 h 以上，后迅速放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥12 h，得到萬壽菊水溶性成分的凍干粉末，4 ℃保存?zhèn)溆?，在臨用時以1640培養(yǎng)基配成50 mg/mL的儲備液。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 小鼠胰島素瘤β 細胞（NIT-1，廣州吉妮歐生物）在飽和濕度、5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液，細胞生長覆蓋培養(yǎng)瓶壁達到80%～90% 時，進行傳代處理。

1.2.3 CCK-8 檢測細胞存活率 按1×104 個/100μL 將細胞接種于96 孔板，貼壁后分別用As2O3（0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L）和萬壽菊水提物（0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28mg/mL）單獨處理細胞，根據處理后的細胞存活率，設置As2O3 和萬壽菊水提物的共處理組（As2O3和萬壽菊水體物混合處理）和后處理組（As2O3處理結束后再給予萬壽菊水提物處理），處理結束后棄液，每孔加90 μL 培養(yǎng)液和10 μL CCK-8 試劑，在細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，以熒光酶標儀在450 nm 的波長下測吸光度值（A450），根據公式：細胞存活率（%）=處理組A450/對照組A450×100%計算細胞存活率。

1.2.4 細胞凋亡測定 按5×105個/孔接種細胞，貼壁后分別給予3.2 mg/L As2O3、0.08 mg/mL 萬壽菊水提物以及3.2 mg/L As2O3和0.08 mg/mL 的萬壽菊花后處理24 h，棄液后每孔加入500 μL Hoechst 固定液，10 min 后去除，加入1 mL PBS 清洗2 次，最后避光加入500 μL 染色液孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察和拍照，正常細胞的細胞核為均一藍色，凋亡細胞則細胞核皺縮且顏色變白發(fā)亮。按公式計算細胞凋亡率：細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/200×100%。

1.2.5 細胞ROS 活性測定 細胞經As2O3和萬壽菊水提物處理后，每孔加入含有DCFH-DA 探針濃度為10 μM 的培養(yǎng)基1 mL，37℃孵育20 min后，在熒光顯微鏡下觀察和拍照，圖片用Image J 軟件進行定量分析。ROS 平均熒光強度=光密度總和/待測細胞面積，以對照組的平均熒光強度進行校正。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 進行數據分析。所有實驗均獨立重復3次，結果以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用最小顯著法（LSD-t），方差不齊的數據采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗（H）檢驗。兩兩比較用完全隨機設計多個樣本間的秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 萬壽菊水提物活性成分提取率及對細胞存活率的影響

萬壽菊水提物凍干產物呈棕黃色并具有一定的黏性，三次提取物質量分別為3.69 g、3.74 g 和3.75 g，平均浸提率為37.27%。NIT-1 細胞經0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg/mL 萬壽菊水提物作用24 h 后，細胞存活率依次是100.00%、104.05%、109.43%、92.47%、77.36%、49.44%、22.08%。0.08 mg/L 組的存活率高于“0”組，0.16、0.32、0.64、1.28 mg/mL 組的存活率低于“0”組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），0.4 mg/mL 組與“0”組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.243）；隨著萬壽菊水提物濃度升高，NIT-1 細胞的存活率呈現先上升后下降的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（F=190.206，P＜0.05），見圖1。

圖1 萬壽菊水提物對NIT-1細胞存活率的影響

2.2 As2O3對細胞存活率的影響

NIT-1 細胞經0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L As2O3作用24 h 后，細胞存活率分別為100.00%、96.11%、93.79%、74.92%、63.02%、52.75%、42.22%，As2O3處理組與“0”組相比，除0.4 mg/L 組外，細胞存活率均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 As2O3對NIT-1細胞存活率的影響

2.3 萬壽菊與As2O3共處理對細胞存活率的影響

0.08 mg/L 萬壽菊水提物處理細胞24 h 后的細胞存活率為105.93%，1.6 mg/L As2O3和3.2 mg/L As2O3細胞存活率分別為76.28%和59.40%，而0.08 mg/L 萬壽菊和1.6 mg/L As2O3共處理細胞存活率為39.44%，0.08 mg/L 萬壽菊和3.2 mg/L As2O3共處理細胞存活率為34.64%，共處理組細胞存活率均低于砷單染和萬壽菊單染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 萬壽菊與As2O3共處理對NIT-1細胞存活率影響情況

2.4 萬壽菊后處理對As2O3降低細胞存活率的影響

萬壽菊水提物細胞存活率為107.00%，1.6 mg/L As2O3和3.2 mg/L As2O3細胞存活率分別為76.32%和56.54%，1.6 mg/L As2O3處理結束再給予0.08 mg/L 萬壽菊水提物處理組中，細胞存活率為62.14%，與1.6 mg/L As2O3處理組相比，細胞存活率下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；3.2 mg/L As2O3處理結束再給予0.08 mg/L 萬壽菊水提物處理，細胞存活率為66.53%，與3.2 mg/L As2O3處理組相比，細胞存活率上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 萬壽菊后處理對As2O3降低NIT-1細胞存活率影響情況

2.5 萬壽菊水提物對As2O3引起細胞凋亡的影響

“0”組細胞貼壁良好，細胞形態(tài)正常，細胞核藍色均一，凋亡細胞較少；萬壽菊水提物處理組細胞狀態(tài)與“0”組相近，而As2O3組細胞貼壁不良，細胞核呈碎片狀，且呈致密濃染，顏色發(fā)白，呈現典型凋亡狀態(tài)；萬壽菊水提物后處理組與As2O3組比較，凋亡細胞少于As2O3組。經觀察和計數，0 組、萬壽菊組、As2O3組和聯(lián)合處理組的細胞凋亡率依次是8.67%、5.5%、21.33%、17.17%，聯(lián)合處理組細胞凋亡率高于“0”組和萬壽菊水提物組，但低于As2O3組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 萬壽菊后處理對砷所致NIT-1細胞凋亡的影響

2.6 萬壽菊水提物對As2O3升高細胞ROS含量的影響

ROS 檢測結果如圖6A 所示，萬壽菊組綠色熒光信號與“0”組相近，As2O3組綠色熒光信號最強，聯(lián)合處理組綠色熒光信號弱于As2O3組但強于“0”組與萬壽菊水提物處理組。經定量，As2O3組（1.12 倍）和聯(lián)合處理組（1.06倍）的ROS 活性高于“0”組（P＜0.05），聯(lián)合處理組ROS活性低于As2O3組（P＜0.05），詳見圖6B。

圖6 萬壽菊后處理對砷增加NIT-1細胞中ROS含量的影響

3 討論

本研究結果顯示，萬壽菊水提物在較高濃度下會對細胞產生毒性作用，提示我們在實際應用過程中，要關注萬壽菊花提取物的使用濃度。

無機砷作為一種劇毒物質，能以劑量依賴的方式誘導細胞內ROS 的蓄積，進而引發(fā)細胞凋亡或自噬［8-10］，表現出較強的毒性作用，而這種毒性作用可在一定程度上被逆轉，如叔丁基對苯二酚可通過激活Nrf2通路而增強細胞抵御氧化損傷的能力，進而降低無機砷對細胞的毒性；姜黃素可有效拮抗無機砷對大鼠睪丸生殖細胞的凋亡誘導作用；西紅花酸可對無機砷誘導的心肌細胞損傷產生保護作用；玫瑰香葡萄果皮提取物可提高小鼠睪丸組織的抗氧化能力，緩解砷的雄性生殖毒性；葡萄籽提取物白藜蘆醇在低劑量時可拮抗無機砷的毒性作用，促進細胞存活，而在高劑量時則能與無機砷產生協(xié)同作用，共同殺傷腫瘤細胞。以上這些研究表明，無機砷產生的細胞毒性可被抗氧化劑或者含抗氧化物質的提取物在一定程度上逆轉，而這些物質與無機砷的聯(lián)合作用方式有預處理（無機砷給藥前用這些物質處理細胞），共處理（與無機砷同時給藥）和后處理（無機砷處理結束后給予）3 種。本研究為明確萬壽菊提取物對無機砷毒性作用的影響，選擇共處理和后處理兩種方式處理后檢測細胞存活率，結果顯示，在砷和萬壽菊水提物共處理細胞時，細胞存活率低于萬壽菊和砷單獨給藥的存活率，提示萬壽菊的水提物成分可在一定程度上增強砷的細胞毒性，表現出聯(lián)合殺傷作用。在本研究中我們觀察到在砷處理后再給予萬壽菊水提物處理時，萬壽菊水提物可有效恢復As2O3引起的細胞毒性，表現為促進細胞存活，抑制細胞凋亡以及降低ROS的蓄積，表明萬壽菊水提物能在一定程度上恢復無機砷引起的細胞損傷。在共處理時，萬壽菊水提物和As2O3表現出聯(lián)合殺傷作用，可能是由于萬壽菊水提物中的某些成分可增強As2O3的毒性；也有可能是由于水提物成分中含有多糖成分，而萬壽菊多糖成分已被證實在體外有一定的抑瘤活性［8］。當然，萬壽菊水提物對As2O3毒性的增強作用還需要進一步研究，比如更換處理時間、處理濃度，甚至選用不同的細胞株，以更清晰地闡明萬壽菊水提物在共處理的方式下對As2O3毒性的影響。而后處理過程中，排除了As2O3和萬壽菊水提物之間的相互作用，觀察到萬壽菊水提物可有效恢復As2O3引起的細胞損傷，這可能與萬壽菊水提物成分具有抗氧化特性有關［5-6］。

綜上所述，萬壽菊提取物在低濃度下刺激細胞生長，高濃度則使細胞存活率下降，As2O3能以濃度依賴的方式降低細胞存活率，誘導細胞凋亡，萬壽菊后處理可有效逆轉As2O3所致的細胞毒性。本研究可為今后萬壽菊水溶性成分修復細胞損傷的研究提供一定的參考依據，同時為合理利用和開發(fā)萬壽菊屬植物資源，實現萬壽菊的綜合利用提供理論基礎。