祝世軍 ，高卓瑤，蔣玲波 ，郭海波 ，羅海軍 ，吳益春 *

1. 舟山市食品藥品檢驗檢測研究院（舟山 316012）；2. 國家海洋食品質(zhì)量檢驗檢測中心（舟山 316000）；3. 浙江海洋大學食品與藥學學院（舟山 316000）

合成著色劑是指以甲醛、苯等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過鹵化、偶氮化等一系列化學反應制得的有機色素，能起到改善食品色澤的作用。相較于天然著色劑，合成著色劑因其色澤鮮艷、著色力強、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低等特點，在食品工業(yè)中被廣泛應用[1]。水產(chǎn)品營養(yǎng)價值高，市場需求量大，受經(jīng)濟利益驅(qū)使，催生生產(chǎn)者違規(guī)添加合成著色劑的現(xiàn)象。若長時間食用合成著色劑過量的水產(chǎn)品，會對肝臟造成不可逆的傷害[2]。此外，在GB 2760——2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》明確規(guī)定，水產(chǎn)品中不允許使用合成著色劑[3]。因此，有必要針對市場上常見的11種水溶性合成著色劑建立一種高效、準確的檢測方法。

針對著色劑的前處理方法主要有固相萃取法[4-7]、聚酰胺吸附法[8-9]、QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）[10-11]和溶劑超聲提取法[12-14]。檢測方法主要有高效液相色譜法[15-18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-24]和毛細管電泳法[25-27]。查閱現(xiàn)有文獻和國標法可知高效液相色譜法最為常用[28-30]，其所述方法的檢測對象主要為飲料、配制酒、硬糖、蜜餞等簡單基質(zhì)，并不適用于高脂肪、高蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品基質(zhì)。雖然高效液相法普及率高，但靈敏度較低，易受基質(zhì)干擾。因此，試驗采用靈敏度更高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

試驗利用萃取緩沖液提取水產(chǎn)品中的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、紅2G等11種水溶性合成著色劑，采用乙醇沉降技術(shù)凈化提取液，建立11種水溶性合成著色劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜篩查方法。該方法分析時間較短、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能滿足準確定性定量水產(chǎn)品中著色劑的日常檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大黃魚、梅魚、紅膏蟹、紅蝦樣品（均從浙江省各農(nóng)貿(mào)市場、超市隨機購買）。

檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、紅2G、亮藍、酸性紅、赤蘚紅、喹啉黃11種標準品（純度≥98%，北京振翔科技有限公司）；無水乙醇、濃氨水、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸氫鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；Poly-sery GB 50090.35——2016固相萃取柱（6 mL，德國CNW）；試驗用水（經(jīng)Milli-Q凈化的超純水，美國Milli-pore公司）。

1.2 儀器與設備

ACQUITY/TQ-XS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Hei-VAP Precision旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國heidolph公司）；Centrifuge 5920R離心機（德國eppendorf公司）；MS3 basic渦旋振蕩器（德國IKA公司）；Microfuge 16臺式微量高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；KQ-600DV數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.3 溶液的配制

洗滌緩沖液的配制：分別稱取0.622 g二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、5.735 g十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、9 g氯化鈉（NaCl），用超純水溶解，全量轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加入1 mL吐溫-20，定容至刻度，混勻。

萃取緩沖液的配制：將無水乙醇、洗滌緩沖液、氨水以5∶5∶1體積比混勻。

0.2 mol/L硫酸氫鈉溶液的配制：稱取13.81 g硫酸氫鈉，用純水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶，并定容至標準刻度線，混勻。

淋洗液的配制：將甲醇、甲酸、水以4∶2∶4體積比混勻。

15%氨化甲醇溶液的配制：吸取30 mL氨水至200 mL容量瓶中，用甲醇定容至標準刻度線，混勻。

定容溶液配制：將10 mmol/L乙酸銨溶液與甲醇以1∶1體積比混勻。

夏國忠和戰(zhàn)士們看到眼前血腥的一幕，牙齒咬得咯咯響，都恨不得立刻鉆出去，把鬼子的飛機打散架。只可惜，狡猾的鬼子此時飛得高，扔了一陣炸彈后，搖搖尾巴就飛走了。

混合標準溶液的配制：準確移取適量檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、紅2G、亮藍、酸性紅、赤蘚紅、喹啉黃標準溶液于同一個100 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，得到質(zhì)量濃度10 μg/mL的混合標準溶液，在4 ℃環(huán)境下保存，待用。

1.4 樣品前處理

提取：準確稱取2.00 g水產(chǎn)品樣品于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL萃取緩沖液，渦旋振蕩5 min，超聲15 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液，重復操作2次。合并上清液，用無水乙醇定容至30 mL，混勻后，取15 mL至50 mL離心管中，加入30 mL無水乙醇，劇烈振蕩5 min，以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中，在40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至無液體流出。將雞心瓶中的水溶液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，用3 mL洗滌緩沖液分兩次潤洗雞心瓶，合并入15 mL離心管中，加入7 mL 0.2 mol/L硫酸氫鈉溶液混勻，待凈化。

凈化：依次用5 mL甲醇、5 mL水活化CNW柱，將待凈化液全部上樣過柱，用15 mL淋洗液淋洗，抽干。用10 mL 15%氨化甲醇溶液洗脫，抽干。將洗脫液于40 ℃水浴蒸發(fā)至小于1 mL后，用定容溶液定容至1 mL混勻。將樣液轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，按14 000 r/min離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入進樣瓶中，待測。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱Acquity UPLC CSH C18柱（2.1 μm×100 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；柱溫45 ℃；流動相A為甲醇，流動相B為10 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。洗脫程序：0～1 min，5% A；1～3 min，5%～35% A，3～10 min，35%～100% A；10～12 min，100%～5% A。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；霧化電壓1 000 V；離子源溫度600 ℃；氣簾氣采用氮氣。采用正負離子質(zhì)譜同時掃描方式；檢測方式采用多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件處理回收率、相對標準偏差等試驗數(shù)據(jù)，采用Qrigin 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與條件

2.1 萃取緩沖液氨水濃度的選擇

水產(chǎn)品中含有大量蛋白質(zhì)，且11種水溶性合成著色劑呈酸性，在中性條件下會與蛋白質(zhì)中的氨基酸緊密結(jié)合難以洗脫，需采用堿性萃取緩沖液進行洗脫，從而提高目標物的提取率?？疾鞜o水乙醇-洗滌緩沖液（1∶1，V/V），無水乙醇-洗滌緩沖液-氨水（5∶5∶1，V/V）和無水乙醇-洗滌緩沖液-氨水（5∶5∶2，V/V）3種不同配比的萃取緩沖液對11種著色劑提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在萃取緩沖液中加入適量氨水，可以提高溶劑的提取率。且無水乙醇-洗滌緩沖液-氨水（5∶5∶1，V/V）的提取效果優(yōu)于無水乙醇-洗滌緩沖液-氨水（5∶5∶2，V/V）。故試驗選擇無水乙醇-洗滌緩沖液-氨水（5∶5∶1，V/V）為萃取緩沖液。

圖1 萃取緩沖溶液對11種水溶性合成著色劑回收率的影響（n=3）

2.2 超聲時間的選擇

超聲波提取法是指采用超聲波輔助溶劑進行提取，因超聲波具有極端的物理特性，可以促使基質(zhì)組織破壁或變形，從而增強溶劑的提取效果。試驗考察5，10，15和20 min 4種超聲時間對11種著色劑提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。超聲時間達到15 min時，提取效率趨于穩(wěn)定。綜合考慮，超聲時間為15 min。

圖2 超聲提取時間對11種水溶性合成著色劑回收率的影響（n=3）

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 流動相的優(yōu)化

基于11種水溶性合成著色劑的化學特性，為獲得最佳的分離效果和響應強度，試驗考察乙腈-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨和甲醇-10 mmol/L乙酸銨3種流動相體系對11種目標化合物色譜分離的影響。結(jié)果表明，以乙腈作為有機相時，檸檬黃、新紅等著色劑出峰時間過早，難以進行準確定性定量分析，因此選用甲醇作為有機相。5和10 mmol/L這2種濃度的乙酸銨溶液均能使11種目標化合物有效分離，但選用10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相時峰形相對較好。綜合考慮，選擇甲醇-10 mmol/L乙酸銨作為流動相。

2.3.2 色譜柱的選擇

分別考察Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 μm×100 mm，1.7 μm）、CSH C18柱（2.1 μm×100 mm，1.7 μm）和HSS T3柱（2.1 μm×100 mm，1.8 μm）3種常用色譜柱對11種著色劑的分離效果，結(jié)果表明，選用CSH C18柱（2.1 μm×100 mm，1.7 μm）色譜柱時，各目標化合物的分離效果較好，且響應值高，無雜峰干擾，故選擇Waters Acquity UPLC CSH C18（2.1 μm×100 mm，1.7 μm）色譜柱為分離柱。11種著色劑混合標準工作液的總離子流圖如圖3所示。

圖3 11種水溶性合成著色劑標準工作液總離子流圖（10 ng/mL）

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為獲得11種著色劑的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)，配制質(zhì)量濃度1.0 μg/mL的11種著色劑混合標準溶液，分別在ESI正離子模式和負離子模式下，采用注射泵連續(xù)進樣的方式進行一級質(zhì)譜分析，將響應值最高的目標離子設為母離子，并確定其保留時間。對母離子進行二級質(zhì)譜掃描，選取響應值較高的2個離子碎片為子離子用于定性、定量分析，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)。試驗11種著色劑的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 11種著色劑的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

2.5 線性方程和定量限

根據(jù)11種著色劑的響應程度，配制系列混合標準工作溶液，在1.5儀器條件下進行分析，外標法定量。以色譜峰面積為縱坐標（Y），以質(zhì)量濃度為橫坐標（X，ng/mL），繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。在陰性樣品中添加系列混合標準工作液，以3倍信噪比（rSN=3）和10倍信噪比（rSN=10）分別確定檢出限和定量限，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，11種著色劑在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.994。各目標物的檢出限和定量限分別在1～5 μg/kg和3～10 μg/kg范圍內(nèi)，滿足定性定量分析要求。

表2 11種著色劑的線性范圍、檢出限和定量限

2.6 回收率和精密度

以陰性黃魚、紅蝦和魷魚為檢測對象，按1.4所述方法進行前處理，在陰性基質(zhì)中分別添加5，20和50 μg/kg 3個水平的混合標準溶液，并采用UPLC-MS/MS進行測定，每個加標濃度水平平行重復測定6次，進行精密度試驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明，11種著色劑的加標回收率為72.8%～114.6%，相對標準偏差為2.81%～6.82%。該方法具有良好的回收率和精密度，能滿足水產(chǎn)品中著色劑的日常檢測需求。

表3 水產(chǎn)品中11種著色劑的加標回收率和相對標準偏差

2.7 實際樣品檢測

采用試驗所建立的方法對來自浙江農(nóng)貿(mào)市場、超市等場所的大黃魚、梅魚、紅膏蟹、紅蝦樣品各40批次共160批次中的11種水溶性合成著色劑進行分析檢測，檢測結(jié)果見表4。大黃魚和梅魚中有檸檬黃和日落黃檢出，檢出率分別為12.5%和10%。紅膏蟹中有胭脂紅檢出，檢出率為2.5%。說明該方法適用于水產(chǎn)品中11種水溶性合成著色劑的定性定量分析。

表4 實際樣品中11種著色劑的檢測結(jié)果 單位：μg/kg

3 結(jié)論

試驗建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定水產(chǎn)品中11種水溶性合成著色劑含量的分析方法。前處理過程主要利用堿性萃取緩沖液提取目標化合物，并采用乙醇沉降技術(shù)進行凈化。該方法不僅前處理凈化效果好，基質(zhì)干擾較小，且分析時間短、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能夠滿足水產(chǎn)品中痕量分析要求，為檢測水產(chǎn)品中著色劑含量提供技術(shù)支撐，對相關(guān)部門監(jiān)測水產(chǎn)品中著色劑的使用情況具有重要意義。